СОЕВЫЙ БЕЛКОВЫЙ ИЗОЛЯТ, ОБОГАЩЕННЫЙ АГЛЮКОНИЗОФЛАВОНАМИ (ВАРИАНТЫ) Российский патент 2003 года по МПК A23J1/14 A23J3/16 

Настоящая заявка является продолжением заявки США 08/307752, поданной 12 апреля, 1996.

Область техники.

Настоящее изобретение относится к способу получения экстракта и изолята, обогащенных аглюконизофлавонами посредством экстракции растворимого вещества из растительного белкового материала и обработки одним или более бета-глюкозидазными ферментами при таких условиях, что большая часть глюконизофлавонов превращается в аглюконизофлавоны, которые остаются в белковом изоляте.

Уровень техники
Изофлавоны содержатся в различных растениях семейства бобовых, включая растительные белковые материалы, такие как соя. Эти соединения включают в себя даидзин, 6"-ОАс-даидзин, 6"-ОМаl дадзин, даидзеин, генистин, 6"-ОАс-генистин, 6"-OMal-генистин, генистеин, глицитин, 6"-ОМаl-глицитин, глицитеин, биочанин А, формононетин и кауместерол. Обычно присутствием данных соединений объясняется характерный горький привкус сои, и при производстве коммерческих продуктов, таких как изоляты и концентраты, стоит задача их удаления. Например, в традиционном процессе получения соевого белкового изолята, при котором хлопья сои экстрагируют водной щелочной средой, большое количество изофлавонов растворяется в экстракте и в растворенном состоянии остается в сыворотке, которая обычно отбрасывается после осаждения белка кислотой. Изофлавоны, оставшиеся в белковом изоляте, осажденном кислотой, обычно удаляются при помощи промывания изолята.

Недавно было обнаружено, что изофлавоны, содержащиеся в растительных белковых материалах, например сое, могут замедлять рост раковых клеток человека, таких как раковые клетки груди или простаты, как описано в статьях: "Genistein Inhibition of the Growth of Human Breast Cancer Cells, Independence from Estrogen Receptors and the Multi-Drag Resistance Gene", авторы - Peterson и Bames, Biochemical and Biophisical Research. Communications. Vol 179, 1, pp.661-667, 30 августа, 1991; "Genistein and Biochanin A Inhibit the Growth of Human Prostate Cancer Cells but Not Epidermal Growth Factor Receptor Tyrosine Autophosphorylation, Peterson and Barnes. The Prostate. Vol 22, pp.335-345 (1993); и Soybeans Inhibit Mammary Tumors in Models of Breast Cancer, Bames и др. , Mutagens and Carcinogens in the Diet. pp.239-253 (1990).

Некоторые из названных изофлавонов существуют в виде глюкозидов, или глюконов, с присоединенной молекулой глюкозы. Некоторые из глюконов, такие как 6"-ОАс-генистин, содержат ацетатную группу, присоединенную в шестом положении к самой молекуле глюкозы. Хотя все изофлавоны, включая глюкозиды, представляют интерес для медицины, наибольший интерес представляют аглюконы, соединения, к которым не присоединена молекула глюкозы. Такие изофлавоны менее растворимы в воде, чем глюконы или изофлавонглюкозиды. Особыми изофлавонами такого вида являются даидзин, генистеин и глицитеин. Эти аглюконы имеют общую формулу

где R₁, R₂, R₃ и R₄ могут представлять собой Н, ОН, ОСН₃. Настоящее изобретение относится к аглюконам и обогащению ими растительного белкового изолята.

Из уровня техники известны способы превращения глюконизофлавонов в аглюконизофлавоны, как это описано в заявке Японии 258669, Obata и др. В таких процессах достигается только умеренная степень превращения, поэтому они не выгодны, особенно для крупномасштабного коммерческого производства. Кроме того, известные процессы, такие как в заявке '669, описывают удаление изофлавонов из белкового материала и не описывают приготовление белкового экстракта или изолята, обогащенного аглюконизофлавоном. Таким образом, существует потребность в процессе превращения по крайней мере большей части и предпочтительно всех глюконизофлавонов в аглюконизофлавоны и получении белкового экстракта и изолята, обогащенных аглюконизофлавоном.

Целью настоящего изобретения явилось получение белкового экстракта и изолята, обогащенных аглюконизофлавоном, и создание способа получения такого экстракта и изолята. Этот и другие аспекты детально рассмотрены в подробном описании изобретения.

Краткое описание изобретения.

Согласно настоящему изобретению получены растительный белковый экстракт и изолят, обогащенные аглюконизофлавоном, и разрабоган способ их получения. Способы получения такого рода экстрактов включают в себя экстрагирование растительного белкового материала, содержащего глюконизофлавоны, водным экстрагентом с рН выше изоэлектрической точки растительного белкового материала, затем реакцию глюконизофлавонов с достаточным количеством одного или более бета-глюкозидазного фермента при условиях (период времени, температура и рН), подходящих для превращения по крайней мере большей части глюконизофлавонов, содержащихся в экстракте, в аглюконизофлавоны, в результате чего получается экстракт, обогащенный аглюконизофлавоном. Согласно настоящему изобретению также разработаны способы получения такого рода экстрактов. Кроме того, в настоящем изобретении таже созданы способы получения белкового изолята, обогащенного аглюконизофлавоном, путем приближения рН полученного экстракта к изоэлектрической точке белкового материала, в результате чего происходит осаждение белкового материала и получается белковый изолят, обогащенный аглюконизофлавонами. Полученный изолят, обогащенный аглюгонизофлавоном, может быть выделен и высушен с образованием сухого обогащенного изолята. Кроме того, настоящее изобретение представляет способы выделения изофлавонов в относительно высоких пропорциях из растительных белковых материалов.

Описание предпочтительных вариантов выполнения изобретения.

Хотя настоящее изобретение описано в применении к продуктам сои, и несмотря на то, что способ особенно подходит для получения экстрактов и изолятов, обогащенных аглюконизофлавонами, из соевого материала, настоящий способ в общем случае применим для получения белковых экстрактов и изолятов из различных растительных белковых источников, содержащих изофлавоны. Примером такого источника является растительный белковый материал, содержащий сою, или соевый материал. Термин "соевый материал" здесь относится к сое или производным сои.

Исходным материалом в соответствии с предпочтительным вариантом выполнения являются соевые хлопья, масло из которых удалили жидкостной экстракцией. Хлопья экстрагируют водным экстрагентом, имеющим рН выше изоэлектрической точки белкового материала, предпочтительно значение рН составляет от 6,0 до 10,0, более предпочтительно 6,7-9,7. Если желательно повысить рН водного экстрагента, могут применяться обычные щелочные реагенты, такие как гидроксиды натрия, калия и кальция. Требуемые изофлавоновые соединения обычно растворяются в водном экстракте. Для увеличения выхода этих соединений в водный экстракт придерживаются определенных весовых отношений хлопьев по отношению к экстракту с тем, чтобы растворить возможно большее количество изофлавонов.

Экстракция белка и изофлавонов может быть проведена различными способами, включая противоточную экстракцию хлопьев при весовом соотношении водного экстрагента к хлопьям от 8:1 до 16:1, причем исходный экстракт используется для экстрагирования хлопьев и получения водного экстракта белка и изофлавонов.

Альтернативно, может быть использован двухстадийный процесс экстракции, причем весовое отношение экстрагента к хлопьям на первой стадии составляет около 10:1, а вторую экстракцию хлопьев проводят свежей порцией экстрагента при весовом соотношении экстрагент к хлопьям - около 6:1 или меньше, так что общее весовое отношение экстрагента к хлопьям по двум стадиям не превышает 16:1.

После удаления нерастворимых материалов получившийся водный белковый экстракт, содержащий растворенные изофлавоны, подвергают реакции с одним или более бета-глюкозидазными ферментами для превращения большинства, и предпочтительно, практически всех изофлавонов, находящихся в глюконовой форме, с присоединенной молекулой глюкозы, в аглюконизофлавоны. Оптимальное значение рН для бета-глюкозидазных ферментов будет меняться в зависимости от фермента, но обычно составляет от 4 до 8. Значение рН экстракта перед проведением реакции приближается к значению рН, при котором специфичный фермент наиболее активен, обычно при помощи доступной кислоты, например уксусной, серной, фосфорной, соляной или любой другой.

Бета-глюкозидазный фермент может присутствовать в соевом материале с самого начала или может быть выращен микробиологическим путем, здесь он будет называться "остаточным" ферментом. Фермент также может быть добавлен к белковому экстракту, в таком случае он будет здесь называться "добавочным". В общем случае, если количество остаточного фермента в соевом материале или экстракте недостаточно для превращения большинства, предпочтительно, всех, изофлавонов, находящихся в глюконовой форме, в аглюконовую форму, то требуется внести добавочный фермент. Количество фермента, достаточное для проведения превращения изофлавонов, зависит от многих факторов, включая тип фермента, распределение концентраций фермента, рН системы, активности присутствующих ферментов. При наличии достаточной концентрации ферментов, остаточных, добавочных, или обоих типов, белковый экстракт с растворенными в нем изофлавонами реагирует с бета-люкозидазными ферментами в течение достаточного периода времени, при температуре и рН, подходящих для превращения по крайней мере большинства, и, предпочтительно, всех глюконизофлавонов, содержащихся в экстракте, в аглюконовую форму.

Предпочтительными добавочными бета-глюкозидазными ферментами являются Биопектиназа 100L и 300L, Биопектиназа OK 70L, Лактаза F и Лактозим. Лактаза F была получена от Amano International Enzyme Co., Inc., P.O. Box 1000, Troy, VA 22974, оптимальное значение рН составляет от 4 до 6, Лактозим был получен от Novo Industries, Ensyme Division, Novo Alle, DK-2880 Bagsvaerd, Дания, и имеет оптимальное значение рН около 7. Биопектиназа 100L, Биопектиназа 300L и Биопектиназа OK 70L были получены от Quest International, Sarasota, Флорида. Добавочные ферменты вводятся в количествах, достаточных для превращения по крайней мере большинства, и, предпочтительно, всех глюконизофлавонов в аглюконы. В тех случаях, когда необходимо введение добавочных ферментов, количество добавленного фермента составляет от 0.5% до 5% по весу от белкового осадка на сухой подложке.

Другим классом подходящих для применения ферментов являются эстеразы. Эти ферменты хорошо подходят к описываемому способу, так как они превращают ацетатные и малонатные конъюгаты в глюконизофлавоны путем отщепления ацетатной и малонатной групп. В наиболее предпочтительном варианте выполнения используются как глюкозидазы, так и эстеразы. Способ по предпочтительному варианту выполнения является предпочтительно одностадийным и позволяет достигать очень высоких степеней превращения изофлавонов (глюконовую форму превращает в аглюконовую) за относительно короткий промежуток времени, достаточно легко и экономично. Термин "одностадийная реакция" здесь означает, что значения определенных параметров процесса остаются практически неизменными в течение всего времени протекания реакции. Эти параметры включают в себя рН и температуру.

Достигаются очень высокие значения степени превращения, такие, что по крайней мере большая часть, и, предпочтительно, все изофлавоны, находящиеся в экстракте соевого материала в глюконовой форме, превращаются в аглюконовую форму. Термин "большая часть" означает, что степень превращения составляет по крайней мере 50%. Термин "практически все" означает, что глюконизофлавоны перешли в аглюконизофлавоны со степенью превращения по крайней мере 80%, и, более предпочтительно, 90%.

Очевидно, что неожиданно и непредсказуемо с точки зрения какой-либо теории, высокие степени превращения стали возможными в результате комбинации параметров, используемых в одностадийной реакции. Значение рН реакционной системы предпочтительно поддерживается постоянным, или около постоянного значения, в интервале от 4 до 8, и наиболее предпочтительно, при значении, при котором фермент(ы) проявляет наибольшую активность в реакции с изофлавоновым конъюгатом(ами). Температура реакционной системы предпочтительно поддерживается постоянной или близкой к постоянному значению, и составляет от 40^oС до 60^oС, наиболее предпочтительно 60^oС во время одностадийного процесса. Период времени, необходимый для практически полного превращения глюконизофлавонов в аглюконы в одностадийной реакции составляет от 2 до 24 часов.

После реакции с одним или более бета-глюкозидазными ферментами рН приближают к изоэлектрической точке соевого белка, что составляет в общем случае от 4,0 до 5,0, предпочтительно 4,4-4,6, путем добавления кислоты. При приближении рН к изоэлектрической точке происходит осаждение белка, обогащенного менее растворимыми аглюконами. После осаждения белковый осадок отделяют от сыворотки при помощи центрифугирования, в результате чего получают белковый изолят, обогащенный аглюконизофлавонами.

В предпочтительном варианте выполнения промывание осажденного белкового материала либо не проводят совсем, либо проводят минимально для того, чтобы значительно уменьшить вымывание аглюконизофлавонов из белкового осадка, несмотря на то, что аглюконы менее растворимы в воде, чем другие изофлавоны. Осажденный кислотой белок либо совсем не промывают, либо ограничиваются одним промыванием водой, причем весовое отношение воды к осажденному белковому материалу составляет от 2:1 до 6:1. Игнорирование стадии промывания осажденного кислотой белкового материала позволяет получить изолят, обогащенный желательным количеством изофлавонов, при промывании может быть получен меньший выход изофлавонов. Умеренное промывание позволяет получить белковый изолят с содержанием в сухом остатке от 1,5 до 3,5 мг/г генистеина, и 1,0-3,0 мг/ г даидзеина.

Затем из осажденного кислотой белка удаляют воду комбинацией центрифугирования или концентрирования, и его высушивают при помощи традиционных методик. Предпочтительный вариант выполнения не ограничивается специальными способами удаления воды, тем не менее, предпочтительно использовать традиционную технологию высушивания, например высушивание в виде спрея, для получения сухого изолята. В результате вышеописанного способа получаются изоляты с повышенным содержанием аглюконизофлавонов.

Настоящее изобретение также раскрывает способ выделения изофлавонов в значительных количествах из растительного белкового материала, такого как соя. Указанный способ позволяет выделить обычно по крайней мере 50%, предпочтительно 65%, более предпочтительно 80%, от общего количества всех форм выбранного изофлавона в исходном растительном белковом материале. Очевидно, что высокие значения выхода продукта получают в результате вышеописанных реакций превращения в совокупности с различными операциями процесс, хотя они не объясняются какой-либо теорией. Путем превращения на определенной стадии процесса конъюгатов глюконизофлавонов, которые относительно хорошо растворимы, в менее растворимые аглюконовые формы, возможно на конечной стадии выделить большое количество изофлавонов.

Следующие примеры описывают особые, но не ограничивающие рамки изобретения, варианты выполнения.

Примеры.

Образцы были приготовлены путем добавления 5 г экстрагированных, обезжиренных хлопьев (муки) к 5 г воды, рН смеси приблизили к 7-8. Затем к каждой из суспензий добавили 0,25 г Лактазы F или Лактозима таким образом, что концентрация фермента составляла около 5% по весу от твердых веществ в каждом образце. Образцы выдерживали при 40^oС и 60^oС. Пробы брали до того, как был добавлен фермент (t=0) и после выдерживания в течение 24 часов при выбранной температуре. Изменение и процентное распределение содержания изофлавонов в хлопьях сои (муке) после 24 часов выдерживания с Лактазой F или с Лактозимом показаны в таблице 1. Перед введением добавочного фермента образцы не стерилизовали, таким образом не прекращали микробный рост и рост на загрязнениях.

Эти данные демонстрируют степень конверсии, достигаемой при использовании комбинации остаточного фермента(ов) и добавочного фермента(ов). Источником остаточных ферментов может служит микробный рост или они могут являться эндогенными ферментами сои. Значительная степень превращения конъюгатов изофлавона в аглюконы наблюдается для образцов, которые выдерживались при рН 8, при 60^oС в течение 24 часов. Концентрация каждого из типов изофлавона, определенная здесь, основана на общей концентрации всех форм данного типа изофлавонов.

Другой ряд образцов был приготовлен посредством приготовления 16% водной суспензии обезжиренных хлопьев сои. Значение рН образцов довели до 4,5 и 7 и выдерживали при 45^oС в течение 24 часов. Пробы брали до начала эксперимента и после 24 часов. Все образцы исследовались на содержание изофлавона. В таблице 2 показано изменение процентного распределения изофлавонов в обезжиренных хлопьях после выдерживания в течение 24 часов при рН 4,5 и 7 при 45^oС.

Эти данные показывают степень конверсии, достигаемой при наличии в белковом материале остаточного фермента(ов). Значительная степень превращения конъюгатов изофлавона в аглюконы наблюдается при рН 7 и температуре 45^oС после выдерживания в течение 24 часов.

В другой серии экспериментов определяли процентный выход генистеина и даидзеина в белковом изоляте, полученном из сои. Процентный выход определяли по количеству генистеина (даидзеина) в изоляте и представляли это количество как процент от общего количества всех форм генистеина (даидзеина) в исходном соевом материале. 100 г обезжиренной соевой муки экстрагировали 1.000 г воды, рН которой был доведен до 9,7 путем добавления гидроксида натрия при температуре 32^oС, так что весовое отношение воды к муке составило 10:1. Муку отделили от экстракта и повторно проэкстрагировали 600 г водного экстракта с рН 9,7 при температуре 32^oС, Вторую стадию экстракции проводили при весовом соотношение воды к муке 6: 1. Муку отделили центрифугированием, первый и второй экстракты объединили, рН раствора довели до 4,5, в результате чего образовалась сыворотка и осадок. Сыворотку нагрели до 50^oС, добавили Лактазу F в количестве 2% от сухого веса осадка. В смеси проходила реакция в течение 16 часов при температуре 50^oС для достижения полного превращения глюконизофлавонов в аглюконы. Осадок, образовавшийся при подкислении, отделили от сыворотки центрифугированием, в результате чего образовался изолят, обогащенный аглюконами. Стадию промывания осадка не осуществляли. Количество генистеина в изоляте составило 86% от общего количества всех форм генистина и генистеина в исходном соевом материале. Аналогично, количество даидзеина в изоляте составило 75%.

Далее следует описание способа количественного опеделения изофлавонов в соевых продуктах. Изофлавоны экстрагируются из продуктов сои путем смешения 0,75 г образца (высушенного распылением или мелко измельченного порошка) с 50 мл смеси 80/20 метанол/вода. Смесь перемешивали в течение 2 часов при комнатной температуре при помощи круговой мешалки. Затем, через 2 часа, отфильтровали нерастворившиеся вещества через бумажный фильтр Ватман 42. Пять мл фильтрата разбавили 4 мл воды и 1 мл метанола.

Экстрагированные изофлавоны разделили при помощи ВЭЖХ на обращеннофазовой колонке Beckman С18. Изофлавоны впрыскивались в колонку и выводились при градиенте растворителя, начиная с 88% метанола, 10% воды и 2% ледяной уксусной кислоты и до 98% метанола и 2% ледяной уксусной кислоты. При скорости потока 0,4 мл/мин все изофлавоны - генистин, 6"-O-Ацетилгенистин, 6"-O-Малонилгенистин, генистеин, дайдзин, 6"-O-Ацетилдаидзин, 6"-O-Малонилдаидзин, даидзеин, глицитин, его производные и глицитеин - четко разделяются. Пики определяются при помощи измерения УФ-поглощения при 262 мм. Идентификацию пиков проводили с помощью масс-спектрометрии.

Количественное определение проводили при помощи чистых стандартов (генистин, генистеин, даидзин и даидзеин), полученных от Indoline Chemical Company, Sommerville, NJ. Параметры разрешения (интегрируемая площадь/концентрация) были посчитаны для каждого соединения и использованы в количественном анализе образцов с неизвестным содержанием. Для конъюгированных форм, для которых отсутствуют чистые стандарты, параметры разрешения принимаются такими же, как у "родительской" молекулы, с поправкой на разность молекулярных весов. Параметр разрешения для глицитина принимается равным параметру для генистина, с поправкой на разность молекулярных весов.

Данный способ позволяет количественно определить каждый индивидуальный изофлавон. Для удобства можно рассчитать общее количество генистеина, дайдзеина и глицитеина и представить совокупный вес этих соединений так, как если бы все конъюгированные формы перешли в соответствующие неконъюгированные. Эти количества также могут быть определены непосредственно с использованием кислотного гидролиза для превращения конъюгированных форм.

Понятно, что вышесказанное является предпочтительными вариантами выполнения изобретения и не ограничивают его, и в рамках изобретения возможны различные изменения и дополнения без выхода за рамки изобретения, ограниченного пунктами патентной формулы, которая должна трактовться в соответствии с принципами патентного законодательства, включая доктрину эквивалентов.

Изобретение относится к получению белковых изолятов, обогащенных аглюконизофлавонами. Соевый белковый материал, содержащий глюконизофлавоны, экстрагируют водным экстрагентом с рН, соответствующим изоэлектрической точке белкового материала. Образуется водный экстракт. Глюконизофлавоны подвергают реакции с ферментом бета-глюкозидазой или эстеразой. Для получения изолятов, обогащенных аглюконизофлавонами, значение рН экстракта доводят до изоэлектрической точки растительного белкового материала, в результате чего происходит осаждение белкового материала. Затем белковый материал отделяют, получая белковый изолят, обогащенный аглюконизофлавонами. Соевый белковый изолят содержит в пересчете на сухое вещество, по крайней мере, 1,5 мг/г генистеина или, по крайней мере, 1,0 мг/г даидзеина. Изобретение позволяет получить соевый белковый изолят, обогащенный веществами, способными замедлить рост раковых клеток. 2 с. и 3 з.п.ф-лы, 2 табл.

1. Соевый белковый изолят, содержащий в пересчете на сухое вещество генистеина, по крайней мере, 1,5 мг/г. 2. Соевый белковый изолят по п.1, содержащий в пересчете на сухое вещество генистеина от 1,5 до 3,5 мг/г. 3. Соевый белковый изолят по п.1, дополнительно содержащий в пересчете на сухое вещество даидзеина, по крайней мере, 1,0 мг/г. 4. Соевый белковый изолят, содержащий в пересчете на сухое вещество даидзеина, по крайней мере, 1,0 мг/г. 5. Соевый белковый изолят по п.4, содержащий в пересчете на сухое вещество даидзеина от 1,0 до 3,0 мг/г.