СПОСОБ ВАКЦИНАЦИИ ДОМАШНЕЙ ПТИЦЫ ПРОТИВ КОКЦИДИОЗА Российский патент 1999 года по МПК A61K39/12 

Изобретение относится к способу вакцинации домашних птиц против кокцидиоза. В частности, изобретение относится к введению in ovo живых спороцист или ооцист видов рода Eimеria или их смесей в развивающиеся яйца домашних птиц с целью иммунизации вылупившихся птенцов против кокцидиоза.

Кокцидиоз является кишечным заболеванием домашних птиц, вызванным инфекцией внутриклеточными простейшими паразитами рода Eimеria. Кокцидиоз является заболеванием домашних птиц, наносящим наибольший экономический ущерб. Установлено, что антикокцидиозная лекарственная терапия и потери вследствие этого заболеваний ежегодно стоят птицеводческой промышленности сотни миллионов долларов.

С начала 50-х годов предпринимались различные попытки вакцинировать домашних птиц против кокцидиоза. Современные способы вакцинации включают введение живых ооцист Eimеria птицам с кормом или водой. Эти способы, однако, неудобны и неэффективны, поскольку не все птицы получают надлежащую дозу ооцист и многие птицы не получают защиты от вакцины или у них развивается болезнетворная инфекция.

В J. M. Sharma и B.R. Burmester, Avian Dis. 26: 134 - 149, 1981, авторы сообщают, что цыплята, вакцинированные in ovo вирусом герпеса индеек, приобрели иммунитет против последующего заражения вирусом болезни Марека. В европейской патентной публикации N 291173 ссылаются на процесс иммунизации, при котором невоспроизводящийся иммуноген вводят in ovo. Иммуногены, на которые конкретно ссылался европейский патент, представляют собой полученный методами генной инженерии антиген и экстракт ооцист Eimеria. Этот европейский патент особо исключает возможность использования стадий живых паразитов, таких как те, которые используются в заявленном в настоящем документе способе вакцинации.

Настоящий способ вакцинации включает введение in ovo, спороцист или ооцист Eimeria или их смесей в развивающиеся яйца домашних птиц. Доступные литературные данные наводят на мысль, что такой способ вакцинации будет неэффективен in ovo и должен применяться после выведения птенцов из яиц. В T.K. Jeffers и G.E. Wagenbach, J. Parasit 56(0): 656 - 662, 1970 авторы сообщают, что заражение спорозоитами E. tenella in ovo на 10 день инкубации не обеспечивало сколько-нибудь значимой защиты против последующего заражения ооцистами E. tenella. Фактически эти авторы сообщают о том, что птенцы, не получавшие вакцинации, имели более высокий коэффициент выживаемости по сравнению с птенцами, получавшими вакцинацию спорозоитами in ovo, при последующем заражении ооцистами E. tenella. B K.L. Watkins и др., Proc., VI-th International Coccidiosis Conf. , Abstract EI-2, Ontario, Canada, 1993, авторы описывают инокуляцию in ovo живых спороцист и спорулированных ооцист E. maxima, хотя они и не указывают, в какой срок инкубации яиц производилась инокуляция. Wathins и др. заключают, что их исследования не представили доказательств того, что воздействие in ovo защищает против последующего заражения кокцидиозной инфекцией, ооцистами E. maxima, на 10 день после вылупления птенцов. Они также заключают, что в случае, когда инокуляция производится вскоре после вылупления птенцов, обеспечивается более значительная иммунологическая защита, чем в случае инокуляции in ovo. В противоположность этому утверждению, способ вакцинации in ovo настоящего изобретения обеспечивает неожиданный иммунитет, который защищает вылупившихся птенцов против последующего кокцидиозного заражения.

Резюме
Настоящее изобретение, также упоминаемое в настоящем документе как "настоящий способ вакцинации", относится к способу вакцинации домашней птицы против кокцидиоза, который включает в себя введение in ovo в последнюю четверть инкубации эффективной иммунизирующей дозы живых спороцист или ооцист Eimeria или их смесей.

Термин "домашняя (ие) птица (ы)", используемый в настоящем документе, если не указывается иное, включает кур, индеек, уток, охотничье-промысловых птиц (включая, но не ограничиваясь, перепелов, фазанов и гусей) и бескилевых (включая, но не ограничиваясь, страусов).

Термин "in ovo", используемый в настоящем документе, если не указывается иное, означает "в яйцо" домашней птицы, содержащее живой развивающийся эмбрион.

Термин "введение in ovo" или "in ovo введение", используемый в настоящем документе, если не указывается иное, означает введение описанной в настоящем документе вакцины в яйцо домашней птицы, содержащее живой развивающийся эмбрион, любым из способов проникновения через скорлупу яйца и введения вакцины. Такие способы введения включают, но не ограничиваются, инъекцию вакцины.

Термин "последняя четверть инкубации", используемый в настоящем документе, если не указывается иное, означает последнюю четверть инкубации развивающегося яйца домашней птицы.

Термин "Eimeria", используемый в настоящем документе, если не указывается иное, означает один или более видов рода Eimeria, который заражает домашних птиц. Такие виды Eimeria включают те из них, которые обнаруживают у кур, включая E. tenella, E. acervulina, E. maxima, E. necatrix, E. mitis, E. praecox и E. brunetti, а также те из них, которые обнаруживают у индеек, включая E. meleagrimitis, E. adenoeides, E. gallopavonis, E. dispersa, E. meleagridis, E. innocua и E. subrotunda, а также виды Eimeria, которые заражают других домашних птиц, как определено выше. Термин "Eimeria" также включает все штаммы упомянутых видов Eimeria, включая, но не ограничиваясь, ранние штаммы и аттенуированные штаммы, которые включают штаммы, подвергавшиеся облучению или какому-либо иному воздействию, после которого они не могли завершить свое развитие. Термин "Eimeria" включает также все вновь открытые штаммы или виды Eimeria, которые заражают домашних птиц, как определено выше.

Термин "спороцисты", используемый в настоящем документе, если не указывается иное, означает живые спороцисты Eimeria.

Термин "ооцист", используемый в настоящем документе, если не указывается иное, означает живые спорулированные ооцисты Eimeria или смесь спорулированных и неспорулированных ооцист.

Термин "эффективная иммунизирующая доза", используемый в настоящем документе, если не указывается иное, означает количество спороцист, или ооцист или, в случае смеси, количество спороцист и ооцист, достаточное для создания иммунологической защиты у вылупившихся птенцов, которая превышает врожденный иммунитет неиммунизированных птиц. Используемые в настоящем документе термины "иммунизировать" и "вакцинировать" являются синонимами и используются взаимозаменяемым образом.

Предпочтительная доза для введения согласно настоящему изобретению включает в себя от 10² до 10⁸ спороцист, или ооцист, или их смесь, в которой общее количество названных спороцист и ооцист варьирует от 10² до 10⁸.

Более предпочтительная доза включает от 10² до 10⁵ спороцист или ооцист или их смесь, в которой общее количество названных спороцист и ооцист варьирует от 10² до 10⁵.

Другая предпочтительная доза включает от 10⁵ до 10⁷ спороцист или ооцист или их смесь, в которой общее количество названных спороцист и ооцист варьирует от 10⁵ до 10⁷.

Другая предпочтительная доза включает от 10⁴ до 10⁶ спороцист или ооцист или их смесь, в которой общее количество названных спороцист и ооцист варьирует от 10⁴ до 10⁶.

Другая предпочтительная доза включает от 10³ до 10⁶ спороцист или ооцист или их смесь, в которой общее количество названных спороцист и ооцист варьирует от 10³ до 10⁶.

Предпочтительной домашней птицей для вакцинации согласно способу настоящего изобретения является курица.

Предпочтительная доза для введения in ovo в куриные яйца включает спороцисты, или ооцисты, или их смесь, двух или более видов Eimeria, выбранных из группы, состоящей из E. tenella, E. acervulina, E. maxima, E. necatrix, E. mitis, E. praecox и E. brunetti.

Другой предпочтительной домашней птицей для вакцинации согласно способу настоящего изобретения является индейка.

Предпочтительная доза для введения in ovo в яйца индейки включает спороцисты или ооцисты или их смесь, двух или более видов Eimeria, выбранных из группы, состоящей из E. meleagrimitis, E. adenoeides, E. gallopavonis, E. dispersa, E. meleagridis, E. innocua и E. subrotunda.

Другими предпочтительными домашними птицами для вакцинации согласно способу настоящего изобретения являются охотничье-промысловые птицы, утки и бескилевые.

Способ настоящего изобретения дополнительно включает, в комбинации с настоящим способом вакцинации, введение in ovo иммуностимулятора в любое время в течение инкубации.

Предпочтительным способом введения иммуностимулятора является одновременное введение с введением in ovo дозы спороцист, или ооцист, или смеси названных спороцист и ооцист, в течение последней четверти инкубации.

Подробное описание изобретения
Настоящий способ вакцинации включает введение in ovo в течение последней четверти инкубации спороцист, или ооцист Eimeria, или их смеси в яйца домашних птиц. Если вакцинация производится для куриных яиц, введение in ovo предпочтительно производится на 15 - 20 дни инкубации и, более предпочтительно, на 18 день инкубации. Если вакцинация производится для яиц индейки, введение in ovo предпочтительно производится на 21 - 26 дни инкубации.

Настоящий способ вакцинации может выполняться с использованием любого удобного способа введения in ovo. Предпочтительно, настоящая вакцина вводится посредством инъекции. Согласно одному способу инъекции, на тупом конце яйца делают отверстие в скорлупе, используя иглу номер 18, для доступа к воздушному пузырю яйца. Через это отверстие и мембрану воздушного пузыря можно вставить иглу номер 22 длиной 1,0 - 1,5 дюйма, присоединенную к шприцу подходящей емкости (1 - 3 мл). Подходящее количество спороцист, или ооцист, или в случае смеси подходящее количество спороцист и ооцист суспендируют в удобном жидком носителе, например, в 10 - 500 мкл физиологического раствора с фосфатным буфером, а затем инъецируют в яйцо. Подходящий объем будет зависеть от размера яйца, поскольку очевидно, что яйца страуса потребуют большего объема по сравнению с куриными. Место инъекции может находиться в любом участке яйца. Предпочтительно, инъекцию делают по оси через центр тупого конца яйца в амнион.

Иначе, можно использовать автоматическую систему для инъекций в яйца для вакцинации по способу настоящего изобретения. Такие системы описаны в патентах США N 4681063, 4040388, 4469047 и 4593646, которые включены в настоящий документ в качестве ссылки. Специалистам известны также и другие подходящие способы инъекции.

Ооцисты для использования согласно настоящему способу вакцинации могут быть приготовлены любым из нескольких известных специалистам способов. Такие способы включают в том числе описанные в J.F. Ryley и др., Parasitology 73 : 311 - 326, 1976 и P.Z. Long и др., Folia Veterinaria Zalina VI#3 201 - 217, 1976, включенных в настоящий документ в качестве ссылки. Согласно одному способу, коммерческих бройлерных цыплят, приблизительно двухнедельного возраста, заражали видом Eimeria, представлявшим интерес, с помощью желудочного зонда, адекватной дозой спорулированных ооцист. Например, типичная доза для E. tenella составляла 200000 спорулированных ооцист на одну птицу. Затем выполняли хорошо известные процедуры сбора и очистки ооцист, полученных от зараженных птиц. Для большинства видов Eimeria от зараженных птиц собирали фекалии на 5 - 7 день после заражения, смешивали и фильтровали для удаления дебриса, затем центрифугировали на скорости, достаточной для оседания оставшегося фекального материала. Для E. tenella применяли сходную процедуру за исключением того, что на 6 день после заражения брали содержимое слепой кишки. Осадок ресуспендировали в насыщенном солевом растворе, в котором ооцисты всплывали, а большая часть контаминирующего дебриса могла быть удалена центрифугированием. Суспензию ооцист затем разводили для понижения концентрации соли. Ооцисты повторно отмывали для удаления соли и ресуспендировали в растворе дихромата калия (2,5% вес/объем). Суспензию ооцист инкубировали при 29^oC при встряхивании (например, 140 об/мин) приблизительно 72 часа для индуцирования споруляции ооцист. Иначе, ооцисты можно обрабатывать гипохлоритом натрия, после чего происходит споруляция. Количество спорулированных ооцист в 1 мл определяли прямым подсчетом на гемацитометре, и культуру сохраняли, предпочтительно, в холодильнике, вплоть до ее использования. Ооцисты могут использоваться в соответствии с настоящим способом вакцинации, предпочтительно, в дозе, включающей в себя от 10² до 10⁸ ооцист на одно яйцо. Более предпочтительно, доза содержит от 10² до 10⁵ ооцист на одно яйцо.

Для приготовления спороцист из описанной выше суспензии ооцист удаляли дихромат калия путем повторных отмываний ооцист, которые заключаются в сборе ооцист центрифугированием и ресуспендировании их в деионизированной или дистиллированной воде. Когда дихромат был удален, о чем судили по исчезновению желтовато-оранжевой окраски, суспензию ооцист смешивали с равным объемом гипохлорита натрия (отбеливающего средства) и инкубировали при комнатной температуре 15 минут. Затем отбеливатель удаляли повторными отмываниями, а ооцисты ресуспендировали в физиологическом растворе или деионизированной воде. Ооцисты можно разрушить для высвобождения спороцист с помощью многих известных методик. Например, ооцисты можно разрушить для высвобождения спороцист путем смешивания ооцист со стеклянными бусами диаметром 1 - 4 мм и встряхивания вручную, с помощью вортекс-мешалки или встряхивающего инкубатора, или использования ручного гомогенизатора. Неразрушенные ооцисты и оболочки ооцист можно отделить от освободившихся спороцист дифференциальным центрифугированием в 50% Percoll^® (фирмы Pharmacia Biotech) или в 1 М сахарозе, как описано Dulski и др., Avian Diseases, 32:235 - 239, 1988. Спороцисты можно использовать в настоящем способе вакцинации как смешанным, так и свободными от неразрушившихся ооцист и оболочек ооцист. Предпочтительно, доза спороцист отделяется от ооцист и оболочек ооцист. Предпочтительная доза спороцист содержит от 10² до 10⁸ спороцист на яйцо. Более предпочтительно, эта доза содержит от 10² до 10⁵ спороцист на яйцо.

Спороцисты, или ооцисты, или их смесь можно инъецировать in ovo в любой физиологически приемлемой среде. Предпочтительно, их суспендируют в физиологически сбалансированном солевом растворе, таком как физиологический раствор с фосфатным буфером. Выбранная среда может включать, необязательно, один или более суспендирующих агентов, включая физиологически приемлемые гели, желатины, гидрозоли, целлюлозу или полисахаридные смолы.

Предпочтительно, в настоящем способе вакцинации спороцисты или ооцисты или их смесь, двух или более видов Eimeria инъецируют in ovo в одно и то же время. Согласно настоящему способу вакцинации, спороцисты, или ооцисты, или их смесь, всех идентифицированных видов Eimeria, которые заражают конкретную домашнюю птицу, такую как курица, можно инъецировать in ovo в одно и то же время, или сериями, в адекватных дозах, обеспечивающих иммунологическую защиту против всех видов.

В настоящем способе вакцинации могут применяться иммуностимуляторы. Иммуностимуляторы, которые можно применять в настоящем способе вакцинации, включают, но не ограничиваются этим перечнем, цитокины, факторы роста, хемокины, надосадочные жидкости от клеточных культур лимфоцитов, моноцитов или клеток лимфоидных органов, препараты клеток или клеточные экстракты (например, фиксированный Staplylococcus aureur или препараты липополисахаридов), митогены или адъюванты, включая низкомолекулярные лекарственные средства. Иммуностимуляторы можно вводить in ovo в любое время инкубации. Предпочтительно, иммуностимуляторы вводят in ovo в среде, содержащей дозу спороцист или ооцист Eimeria или их смесь.

Изобретение касается иммунизации домашней птицы против кокцидиоза. Способ заключается во введении in ovo эффективной иммунизирующей дозы живых спороцист, или ооцист Eimeria, или их смеси. При этом живую вакцину вводят в течение последней четверти инкубации яиц. Предпочтительная доза для введения составляет 10²-10⁸ спороцист, или ооцист, или их смесь. Изобретение обеспечивает создание иммунитета, защищающего вылупившихся птенцов против последующего заражения кокцидиозом. 10 з.п.ф-лы.

1. Способ вакцинации домашней птицы против кокцидиоза, предусматривающий инъекцию эффективной иммунизирующей дозы вакцины, содержащей иммуноген Eimeria, in ovo в последней четверти инкубации, отличающийся тем, что в качестве иммунизирующих компонентов указанной вакцины используют живые спороцисты, или ооцисты, или их смесь. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что он дополнительно предусматривает введение in ovo иммуностимулятора в любое время в течение инкубации. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что домашней птицей является курица. 4. Способ по п.3, отличающийся тем, что доза содержит спороцисты, или ооцисты, или их смесь, двух или более видов Eimeria, выбранных из группы, состоящей из E.tenella, E.acervulina, E.maxima, E.necatrix, E.mitis, E.preacox и E.brunetti. 5. Способ по п.1, отличающийся тем, что домашней птицей является индейка. 6. Способ по п.5, отличающийся тем, что доза содержит спороцисты, или ооцисты, или их смесь, двух или более видов Eimeria, выбранных из группы, состоящей из E.meleagrimitis, E.adenoeides, E.gallopavonis, E.dispersa, E. meleagridis, E.innocua и E.subrotunda. 7. Способ по п.1, отличающийся тем, что доза содержит живые спороцисты. 8. Способ по п.1, отличающийся тем, что доза содержит живые ооцисты. 9. Способ по п.1, отличающийся тем, что доза содержит от 10² до 10⁵ спороцист, или ооцист, или их смесей, в которых общее количество указанных спороцист или ооцист находится в пределах от 10² до 10⁵. 10. Способ по п.2, отличающийся тем, что иммуностимулятор вводят in ovo одновременно с введением указанной дозы спороцист или ооцист или их смеси. 11. Способ по п.1, отличающийся тем, что спороцисты перед включением в дозу очищают для удаления ооцист.