ВАКЦИНА, АССОЦИИРОВАННАЯ ПРОТИВ АНАЭРОБНОЙ ЭНТЕРОТОКСЕМИИ И ЭШЕРИХИОЗА ПОРОСЯТ Российский патент 1999 года по МПК A61K39/116 A61K39/08 A61K39/108 

Изобретение относится к области биотехнологии и касается изготовления профилактических препаратов против анаэробной энтеротоксемии и эшерихиоза поросят.

Обе инфекции широко распространены, особенно в комплексах, и частично протекают в виде смешанной инфекции.

Химиотерапия анаэробной энтеротоксемии и эшерихиоза мало эффективна и трудоемка. В связи с этим основным эффективным методом борьбы является вакцинация субпоросных свиноматок, обеспечивающая сохранность поросят за счет колострального иммунитета.

Известна вакцина против эшерихиоза животных, содержащая адгезивные антигены K88, K99, 987P, F41, термостабильный (ТС) и термолабильный (ТЛ) анатоксины, соматические антигены 078, 0141 и полисахаридные капсульные антигены K80 и K87 (в виде суспензии клеток шт. ВГНКИ N 305-37/11 и N 334-37/12), адъювант - гидрат окиси алюминия, консервант - формалин, культуральную среду (бульон Хоттингера) и фосфатно-мочевинный буфер. В качестве продуцентов антигенов в вакцине использованы следующие штаммы эшерихий, депонированные в Всероссийском государственном научно-исследовательском институте контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов: ВГНКИ N 305-37/11 (078: K80), ВГНКИ N 334-37/12 (0141:K87:K88), ВГНКИ N 453-37/17 (0115: K88), ВГНКИ N 353-37/17 (0141:K99), ВГНКИ N 397-37/14 (09: K103: 987P), ВГНКИ N 398-37/14 (0101:F41). Вакцину вводят двухкратно внутримышечно с интервалами 14 - 20 дней по 5 мл на инъекцию (патент РФ N 2043771, A 61 K 39/108, 199).

Использование известной вакцины профилактирует эшерихиоз поросят, но, естественно, не создает иммунитета против анаэробной энтеротоксемии. Кроме того, она имеет повышенную реактогенность за счет содержания высокотоксичных штаммов серогрупп 078 и 0141 и недостаточную концентрацию анатоксинов, что делает необходимым вводить эту вакцину в большой дозе - 10 см³ на одно животное.

Известна концентрированная формолвакцина на основе гидроокиси алюминия против энтеротоксемии поросят, полученная на основе производного штамма Clostridium perfringens типа C (Ветеринария, 1971, N 6, с. 53 - 55).

Недостатком известной вакцина против анаэробной энтеротоксемии является низкая иммуногенная активность в связи с потерей производственным штаммом токсигенности.

Наиболее близким аналогом является ассоциированная вакцина Gletvax 5 против E.coli и Cl. pertringens типа C свиней, содержащая в каждых 5 см³ по 100 единиц антигенов K88ab, K88ac, K99 и 987P и не менее 300 интернациональных единиц эквивалента бета-токсоида Cl. pertringens типа C. Вакцину вводят субпоросным свиноматкам двукратно внутримышечно или подкожно, первую дозу за 6 недель, вторую - за 2 недели до опороса. Ревакцинацию проводят путем однократного введения вакцины за 2 недели до опороса (проспект фирмы Pitman Moore, Великобритания).

Однако известная ассоциированная вакцина недостаточно иммуногенна, не содержит адгезивных антигенов F41, ТЛ- и ТС-анатоксинов и О-антигенов эшерихий, что делает ее малоэффективной в ряде хозяйств, где превалируют соответствующие возбудители, против которых вакцина не содержит антигенов.

Технический результат изобретения заключается в повышении иммуногенной активности и расширении антигенного спектра ассоциированной вакцины, а также снижение реактогенности.

Сущность изобретения заключается в следующем:
Ассоциированная вакцина против анаэробной энтеротоксемии и эшерихиоза поросят содержит из антигенов клостридий - суспензию клеток и B-токсин штамма Cl. perfingens типа C N 3, из антигенов эшерихий - адгезивный антиген K88 в фосфатно-мочевинном буфере, выделенный из штамма Escherichia coli ВГНКИ N 453-37/17, адгезивный антиген K99 в фосфатно-мочевинном бефере, выделенный из штамма E.coli ВГНКИ N 454-37/17, адгезивный антиген 987P в фосфатно-мочевинном буфере, выделенный из штамма E.coli ВГНКИ N 397-37/14, адгезивный антиген F41 в фосфатно-мочевинном буфере, выделенный из штамма E.coli ВГНКИ N 398-37/14, термолабильный анатоксин в культуральной среде, полученный при культивировании штаммов E.coli ВГНКИ N 334-37/12, ВГНКИ N 397-37/14 и ВГНКИ N 453-37/17, термостабильный анатоксин в культуральной среде, полученный при культивировании штаммов E. coli ВГНКИ N 305-37/11, ВГНКИ N 398-37/14, суспензию клеток штамма E.coli ВГНКИ N 305-37/11 в культуральной среде, суспензию клеток штамма E.coli ВГНКИ N 334-37/12 в культуральной среде, инактиватор-формалин и адъювант-гель гидроокиси алюминия, взятые в определенных соотношениях.

Ассоциированная вакцина согласно изобретению содержит необходимое количество протективных антигенов, обеспечивающее формирование иммунитета высокой напряженности у животных по отношениюя к энтеропатогенным эшерихиям независимо от их серогрупповой принадлежности. Вакцина содержит соматические антигены 078 и 0141 в форме анаэндотоксинов, белковые адгезивные антигены K88, K99, 987P, F41, широко распространенные полисахаридные капсульные антигены K80 и K87, термолабильный и термостабильный антитоксины, а также высокоиммуногенные анатоксины клостридий типа C.

Эшерихиозные антигены получают в соответствии с патентом RU N 2043771, уже упомянутом выше в качестве аналога.

Клостридиозные антигены получают из нового штамма Cl. perfingens типа C N 3.

Штамм Cl. perfingens типа С N 3 выделен от павшего от энтеротоксемии поросенка, характеризуется следующими свойствами:
Морфологические свойства. Клетки в среде Китт-Тароцци имеют форму палочек, прямые с округленными и обрубленными концами, грамположительные, неподвижные, располагаются в форме полисада или попарно. Размер 4-8х 1,0-1,5 μ . Образуют большие овальные споры, располагающиеся центрально или субтерминально. В процессе лабораторного и производственного культивирования споры и капсулы обычно не образуются.

Культуральные свойства. Колонки на поверхности агара Цейсслера имеют в диаметре 2 - 5 мм, круглые, куполообразной формы, от серого до зеленовато-желтого цвета с глянцевой поверхностью.

Образуют три вида гемолизинов: альфа, дельта и тета. Может образовывать очень широкую грязновато-коричнесую зону гемолиза на среде с кровью овцы или коровы за счет действия дельта-токсина. Растет одинаково хорошо при температуре 37^o и 45^oC. Рост стимулируется присутствием сбраживаемых углеводов и не угнетается 20% желчью.

Ферментный свойства. Штамм образует аммиак и сероводород, восстанавливает нейтральный красный, ферментирует большинство сахаров и продуцирует лецитиназу, дезоксирибонуклеазу, рибонуклеазу, эластазу, гиалуронидазу, амилазу, нейроминидазу и гемагглютинин.

Бурно свертывает молоко с образованием губчатого осадка и разжижает желатин на 3 - 5 день.

Штамм чувствителен к бактериоцинам энтерококков и продуцирует высокоактивные бактериоцины.

Токсигенность. Бета-токсин, продуцируемый штаммом в высоком титре (20 тыс. и более ДЛМ для белых мышей массой 16 - 18 г), высоко трипсиночувствителен, состоит из единственной полипептидной цепи с молекулярной массой около 30000 Д. Его токсический эфир обусловлен увеличением проницаемости капиллярных сосудов. Продукция бета-токсина обеспечивается плазмидой. Штамм продуцирует также альфа-токсин, который является фосфолипазой C и вызывает гидролиз лецитина до фосфорилхолина и диглицерина.

Эшерихиозные антигены и клостридиозный анатоксин соединяют в определенных соотношениях согласно изобретению, доводят до нужной концентрации геля гидрата окиси алюминия в вакцине и устанавливают pH 7,2 - 7,4.

Полученная ассоциированная вакцина против эшерихиоза и анаэробной энтеротоксемии поросят имеет следующий состав, (на 1 л):
Суспензия клеток штамма Cl. perfingens типа C N 3 в культуральной среде, кл. - 3,8 - 4,0•10¹²
Суспензия клеток штамма E coli ВГНКИ N 334-37/12 (0141:K87:K88) в культуральной среде, кл. - 9,0•10¹²-1,0•10¹³
Суспензия клеток штамма E coli ВГНКИ N 305-37/11 (078:K80) в культуральной среде, кл. - 9,0•10¹²-1,0•10¹³
B-токсин штамма Cl. perfingens типа C N 3, ДЛМ - 1,2•10⁴-1,3•10⁴
Адгезивный антиген K88 в фосфатно-мочевинном буфере с титром в РДП 1: 16-1:32, см ³ - 60 - 80
Адгезивный антиген K99 в фосфатно-мочевинном буфере с титром в РДП 1: 16-1:32, см ³ - 60 - 80
Адгезивный антиген 987P в фосфатно-мочевинном буфере с титром в РДП 1: 16-1:32, см³ - 60 - 80
Адгезивный антиген F41 в фосфатно-мочевинном буфере с титром в РДП 1: 16-1:32, см³ - 60 - 80
Гидроокись алюминия, 6%-ная, см³ - 270 - 320
Формалин, см³ - 2,7 - 3,2
Термолабильный и термостабильный анатоксины эшерихий в культуральной среде с титром в РДП 1:8-1:16, л - До 1
Входящие в состав ассоциированной вакцины антигены в эффективных количествах обеспечивают синергетический эффект, проявляемый в увеличении напряженности и длительности иммунитета.

Пример 1. Для изготовления клостридиозного компонента ассоциированной вакцины производственный штамм Cl. perfingens типа C N 3 выращивают на мясо-печеночно-казеиновой среде в реакторе в течение 4 - 6 часов при температуре 37 - 38^oC до накопления не менее 4 млрд/см³ микробных клеток, проверяют токсичность выращенной культуры на белых мышах, которые должны погибнуть после внутривенного введения 0,5 см³ культуры в срок до 24 часов.

Для изготовления вакцины используют культуру, содержащую не менее 6000 ДЛМ/см³ для белых мышей. В реактор добавляют формалин до 0,65%-ной концентрации и выдерживают 8 суток при температуре 37 - 38^oC, добавляют 3%-ную гидроокись алюминия до 20%-ной концентрации, выдерживают 2 - 5 суток и удаляют 50% общего объема надосадочной жидкости. К осадку добавляют расплавленный агар-агар до 0,05%-ной концентрации, устанавливают pH 7,4 - 7,6.

Эшерихиозный компонент получают из следующих штаммов:
1. Escherichia coli ВГНКИ N305-37/11 (078:K80).

2. Escherichia coli ВГНКИ N334-37/12 (0141:K87:K88).

3. Escherichia coli ВГНКИ N453-37/17 (0115:K88).

4. Escherichia coli ВГНКИ N454-37/17 (0141:K99).

5. Escherichia coli ВГНКИ N397-37/14 (09:K103:987P).

6. Escherichia coli ВГНКИ N398-37/14 (0101:F41).

Штаммы известны и охарактеризованы в патенте RU N 2043771.

Штаммы выращивают раздельно в бульоне Хоттингера, содержащем аминный азот - 150 - 200 мг%, триптофан - 50 - 100 мг% при pH 7,8 - 8,0.

Выращенные культуры шт. NN397-37/14, 398-37/14, 453-37/17, 454-37/17 отделяют от культуральной жидкости на сепараторе или центрифуге при 10 - 15 тыс. об/мин. Культуральную жидкость сливают в отдельную емкость и определяют концентрацию ТЛ и ТС токсинов в реакции диффузной преципитации (РДП).

Титр ТС и ТЛ-токсинов в культуральной жидкости должен быть не менее 1: 4-1:8.

Бактериальную массу штаммов ресуспендируют в фосфатно-мочевинном буфере до концентрации не менее 100 млрд/см³ микробных клеток, прогревают при температуре 60 - 65^oC в течение 20 - 25 мин, супернатант отделяют от бактериальной массы и проверяют на концентрацию адгезивного антигена в РДП. Титр каждого антигена в супернатанте должен быть не менее 1:16.

Полученные супернатанты смешивают в равных частях, консервируют формалином до 0,3%-ной концентрации и используют для изготовления вакцины. Бактериальную массу утилизируют.

В выращенных культурах штаммов NN305-37/11 и 334-37/12 определяют концентрацию микробных клеток и разбавляют культуральной средой, полученной при выращивании штаммов NN397-37/14, 398-37/14, 453-37/17, 454-37/17, до концентрации 15,0 - 16,0 млрд/см³ микробных клеток. Культуры штаммов 305-37/11 и 334-37/12 смешивают в равных частях, добавляют формалин до 0,3%-ной концентрации, выдерживают 15 - 16 дней при температуре 37 - 38^oC. Затем добавляют содержащий адгезивные антигены супернатант до 25 - 30%-ной концентрации, гидроокись алюминия 6%-ную до 30%-ной концентрации и дополнительно формалин до 0,12 - 0,15%-ной концентрации.

Доводят pH 10%-ным раствором NaOH до 7,2 - 7,4, оставляют вакцину при температуре 10 - 22^oC на 8 - 10 часов и удаляют половину надосадочной жидкости. Проводят контроль на стерильность, безвредность и активность.

Клостридиозный и эшерихиозный компоненты смешивают в соотношении 1:1, доводят концентрацию 6%-ным гелем гидрата окиси алюминия до его 30%-ного содержания в вакцине и устанавливают pH 7,2 - 7,4.

Полученную ассоциированную вакцину против анаэробной энтеротоксемии и эшерихиоза поросят расфасовывают во флаконы емкостью 100 - 200 см³, контролируют внешний вид, наличие посторонних примесей, концентрацию водородных ионов, стерильность, безвредность и иммуногенность.

Получают 3 серии ассоциированной вакцины против анаэробной энтеротоксемии и эшерихиоза поросят при следующем соотношении компонентов (табл. 1).

Пример 2. Активность ассоциированной вакцины против анаэробной энтеротоксемии и эшерихиоза поросят проверяют в сравнении с моновакцинами против анаэробной энтеротоксемии поросят и против эшерихиоза животных.

Иммуногенную активность вакцины против энтеротоксемии проводят путем двукратной иммунизации 6 кроликов массой 2,0 - 2,5 кг с интервалами между введениями 18 - 20 суток. Препарат в дозе 4 см³ вводят в мышцы конечности с внутренней стороны бедра.

Через 18 - 20 суток после второй инъекции в сыворотке крови каждого кролика определяют титр антитоксических антител в реакции нейтрализации токсина Cl. perfingens типа C на белых мышах.

Вакцина считается активной против энтеротоксемии, если сыворотка крови кроликов, в опыте постановки реакции нейтрализации, предохраняет не менее двух мышей из трех, взятых в опыт, при гибели всех контрольных животных. Такая сыворотка содержит от 0,15 до 0,3 АЕ анатоксина.

Иммуногенную активность вакцины к эшерихиям проверяют на 40 белых мышах массой 18 - 20 г. Вакцину вводят 20 мышам подкожно двукратно с интервалом 7 - 10 суток в дозе 0,2 см³, а 20 мышей не вакцинируют. Через 16 - 18 суток после введения второй дозы вакцины животным вводят внутрибрюшинно подтитрованную смертельную дозу двух контрольных штаммов эшерихий серогрупп 0141, 078, используя на штамм каждой серогруппы 10 вакцинированных и 10 невакцинированных животных.

Вакцину считают активной при выживании не менее 7 из 10 вакцинированных и гибели не менее 8 невакцинированных контрольных белых мышей в каждой из групп.

Концентрацию адгезивных и капсульных антигенов в вакцине против эшерихиоза проверяют на 6 кроликах массой 3,0 - 3,5 кг, которые вводят внутрибрюшинно или внутримышечно вакцину в дозе 0,75 см³. Через 24 - 27 дней у кроликов берут кровь и исследуют сыворотку в реакции агглютинации, используя в качестве антигенов производственные и моноплазмидные штаммы-продуценты адгезивных антигенов K12:K38, K12:K99, K12:987P, K12:F41.

Результаты сравнительной оценки активности ассоциированной вакцины против анаэробной энтеротоксемии и эшерихиоза поросят и соответствующих моновакцин, полученных на лабораторных животных, показывают, что ассоциированная вакцина вызывает формирование иммунитета большей напряженности, чем моновакцины. Содержащиеся в ассоциированной вакцине антигены не проявляют конкурентного действия по отношению друг к другу, напротив, во всех случаях при проверке трех серий вакцин зарегистрирован синергетический эффект.

Пример 3. Ассоциированную вакцину против анаэробной энтеротоксемии и эшерихиоза поросят вводят супоросным свиноматкам внутримышечно двукратно с интервалом между введениями 15 - 20 дней в дозах 5 и 5 см³.

Эффективность вакцины оценивают по количеству заболевших и павших от анаэробной энтеротоксемии и эшерихиоза поросят в неблагополучных по этим инфекциям свиноводческих хозяйствах.

Иммунитет формируется через 2 недели после начала вакцинации и длится не менее 6 месяцев.

Производственные испытания вакцины подтвердили его безвредность и противоэпизоотическую эффективность, проявляемую в усилении иммунизирующей активности отдельных компонентов ассоциированной вакцины.

Изобретение относится к области биотехнологии. Ассоциированная вакцина содержит клостридиозный компонент, представленный штаммом Clostridium perfingens 3, активно продуцирующий B-токсин типа С. Она также содержит сложный эшерихиозный компонент, включающий набор полисахаридных О, К антигенов, адгезивных антигенов, ТЛ- и TC-анатоксинов в соотношении 1 : 1. Вакцина обеспечивает широкий спектр иммуногенности против энтеротоксемии и эшерихиоза поросят при двукратной вакцинации супоросных свиноматок. Применение ассоциированной вакцины вдвое сокращает затраты труда, число инъекций и сроки проведения вакцинации по сравнению с использованием моновакцин. 1 табл.

Вакцина, ассоциированная против анаэробной энтеротоксемии и эшерихиоза поросят, содержащая антигены клостридий, антигены эшерихий, инактиватор формалин и адъювант, отличающаяся тем, что из антигенов клостридий она содержит В-токсин и суспензию клеток штамма Clostridium perfringens типа C N 3, из антигенов эшерихий - адгезивные антигены K88, K99, 987P, F41 в фосфатно-мочевинном буфере с титром в РДП 1 : 16 - 1 : 32, выделенные из штаммов Escherichia coli ВГНКИ N 453-37/17, Escherichia coli ВГНКИ N 454-37/17, Escherichia coli ВГНКИ N 397-37/14 и Escherichia coli ВГНКИ N 398-37/14 соответственно, термолабильный анатоксин в культуральной среде, полученный при культивировании штаммов Escherichia coli ВГНКИ N 331-37/12, Escherichia coli ВГНКИ N 397-37/14 и Escherichia coli ВГНКИ N 453-37/17, термостабильный анатоксин в культуральной среде, полученный при культивировании штаммов Escherichia coli ВГНКИ N 305-37/11 и Escherichia coli ВГНКИ N 398-37/14, суспензию клеток штаммов Escherichia coli ВГНКИ N 305-37/11 и Escherichia coli ВГНКИ N 334-37/12 в культуральной среде, из адъювантов - гель гидроокиси алюминия при следующем соотношении компонентов на 1 л вакцины:
Суспензия клеток штамма Clostridium perfinges типа C N 3 в культуральной среде, кл. - 3,8 • 10¹² - 4,0 • 10¹²
Суспензия клеток штамма Escherichia coli ВГНКИ N 334-37/12 в культуральной среде, кл. - 9,0 • 10¹² - 1,0 • 10¹³
Суспензия клеток штамма Escherichia coli ВГНКИ N 305-37/11 в культуральной среде, кл. - 9,0 • 10¹² - 1,0 • 10¹³
B-токсин штамма Clostridium perfringens типа C N 3, ДЛМ - 1,2 • 10⁴ - 1,3 • 10⁴
Адгезивный антиген K88 в фосфатно-мочевинном буфере с титром в РДП 1 : 16 - 1 : 32, см³ - 60 - 80
Адгезивный антиген K99 в фосфатно-мочевинном буфере с титром в РДП 1 : 16 - 1 : 32, см³ - 60 - 80
Адгезивный антиген 987P в фосфатно-мочевинном буфере с титром в РДП 1 : 16 - 1 : 32, см³ - 60 - 80
Адгезивный антиген F 41 в фосфатно-мочевинном буфере с титром в РДП 1 : 16 - 1 : 32, см³ - 60 - 80
Гидроокись алюминия, 6%-ная, см³ - 270 - 320
Термолабильный и термостабильный анатоксины в культуральной среде с титром в РДП 1 : 8 - 1 : 16, л - До 1