АССОЦИИРОВАННАЯ ВАКЦИНА ПРОТИВ РОТА-, КОРОНАВИРУСНОЙ И ЭШЕРИХИОЗНОЙ ДИАРЕИ НОВОРОЖДЕННЫХ ПОРОСЯТ Российский патент 1999 года по МПК A61K39/295 A61K39/15 A61K39/215 A61K39/108 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, микробиологии и биотехнологии и касается новой вакцины для специфической профилактики смешанных инфекционных диарей новорожденных поросят, этиологическими агентами которых являются рота-, коронавирусы и энтеропатогенные штаммы кишечной палочки, содержащие антигены К88, К99 и 987Р.

Известно, что возможность возникновения смешанных инфекций в различных сочетаниях довольно высока. Смешанные инфекции, характеризующиеся интенсивным развитием клинических признаков, связанных с симптомокомплексом гастрита и высокой смертностью поросят (80-90%), наблюдаются как в промышленных комплексах с большой концентрацией животных, так и в небольших хозяйствах (Бурсук И.Ф "Бюллетень ВИЭВ, 1984; Прискока В.А., "Ветеринария", N 3, 1986; Benfield D. A. et al., Amer. J. Veter. Res., 1988, v. 49, N 3, p. 330-337; Janke B. H. et al., Canad. J. Vet. Research, 1988, v. 52, N 3, р.360-363 и др.}.

Основные возбудители инфекционных диарей обладают строго дифференцированным тропизмом в отношении клеток слизистого покрова желудочно-кишечного тракта новорожденных поросят, инфицирование которых происходит в первые часы и дни постнатального периода жизни с последующими прогрессивно развивающимися необратимыми патологическими изменениями, приводящими их к быстрой гибели.

Чрезвычайно широкое распространение ротавирусной инфекции среди свиней, возможность наличия у них субклинической и бессимптомной инфекции, участие в этой ассоциации вируса трансмиссивного гастроэнтерита - возбудителя столь высококонтагиозной болезни, энтеропатогенных штаммов E.coli, выделяющие термостабильные и термолабильные токсины, обуславливают необходимость разработки эффективных вакцин против инфекционных диарей поросят, обеспечивающих оптимальную защиту новорожденных факторами лактогенного иммунитета, реализуемого через молозиво и молоко свиноматок.

Известна живая моновалентная вакцина против трансмиссивного гастроэнтерита свиней (ТГС) на основе аттенуированного штамма вируса ВГНКИ N 5 (Авт. свидетельство SU N 734279, A 61 K 39/225, опубл. 20.05.80).

Известна также живая моновалентная вакцина против ротавирусного гастроэнтерита свиней, содержащая аттенуированный штамм ротавируса свиней 1 серотипа (Рухадзе Г.Г. и др. //Сельскохозяйственная биология, 1988, N 1, с.31).

Недостатками известных живых моновакцин является потенциальная опасность в следствие угрозы постоянного накопления и распространения вирусов среди популяции свиней.

Известна цельноклеточная вакцина из основных штаммов E.coli, способных продуцировать адгезивный антиген К88, К99, 987Р (То S. et al. Mod. Veter. Pract. , 1983, v. 64, N 4, p. 327-329; Cieslicki M. Pract. Tierarzt., 1989, v. 70, N 8, p. 29-34; Nagy L.K. et а1., Veter. Rec., 1985, v.117, N 16, p. 403-413).

Известны также субъединичные вакцины, содержащие пили трех штаммов кишечной палочки К88, К99, 987Р (Genetically engineered Bact., USA. In Pract., 1983; Hybrid bacterium aims at scours. Pig American., 1983, v.8, N 2, p.62).

Однако в известных биопрепаратах, изготовленных из адгезивных штаммов E. coli, отсутствуют специфические антигены ротавируса и вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней, которые признаны основными патогенными агентами, вызывающие высокую заболеваемость и летальность поросят.

Таким образом, существенными недостатками известных вакцин является то, что они стимулируют образование иммунитета у животных только к одной инфекции, требуют проведения профилактических обработок против каждой инфекции в отдельности, что сказывается на затратах труда, растягивает сроки формирования иммунитета у животных, способствует возникновению стрессовых явлений и осложнений.

Известна ассоциированная вакцина, содержащая смесь ротавирусов и инактивированных штаммов E. coli, продуцирующих адгезины К88, К99, 987Р и F41 (Combination swine scour vaccine, Agri-Practice, 1986, v.7, N 3-4, p. 58).

Однако известная ассоциированная вакцина не содержит коронавирусные антигены и не обеспечивает максимального иммунизирующего эффекта против основных возбудителей инфекционных диарей новорожденных поросят.

Ассоциированная вакцина против рота-, коронавирусной и эшерихиозной диареи новорожденных поросят не известна.

Задачей изобретения является создание ассоциированной вакцины против основных возбудителей инфекционных диарей новорожденных поросят.

Технический результат изобретения заключается в повышении иммуногенной активности и расширении иммуногенного спектра ассоциированной вакцины для профилактики диареи новорожденных поросят, вызываемой смешанной инфекцией.

Сущность изобретения: вакцина для профилактики диареи новорожденных поросят, вызываемой смешанной инфекцией, содержит
инактивированные культуральные суспензии штаммов ротавируса "Пугачевский-92" и корона вируса Transmissible gastroenteritis ВГНКИО N 5 с титрами 10^6,0-10^7,5 ТЦЦ 50/мл, из антигенов эшерихий - инактивированные суспензии клеток штаммов Escherichia coli, содержащие адгезины К88, К99 и 987Р с концентрацией каждого штамма 100-120 млрд.кл в 1 мл физиологического раствора и адъювант - 6%-ный раствор геля гидроокиси алюминия, при следующем соотношении компонентов (об. %):
инактивированная культуральная суспензия штамма ротавируса "Пугачевский-92" с титром 10^6,0 - 10^7,5 ТЦД 50/мл - 40 - 45
инактивированная культуральная суспензия штамма вируса Transmissible gastroenteritis ВГНКИ N 5 с титром 10^6,0 - 10^7,5 ТЦД 50/мл - 40 - 45
Инактивированная суспензия клеток штамма Escherichia coli, содержащая адгезин К88 с концентрацией 100-120 млрд.кл в 1 мл физиологического раствора - 2 - 3
Инактивированная суспензия клеток штамма Escherichia coli, содержащая адгезин К99 с концентрацией 100-120 млрд. кл в 1 мл физиологического раствора - 2 -3
Инактивированная суспензия клеток штамма Escherichia coli, содержащая адгезин 987Р с концентрацией 100-120 млрд.кл в 1 мл физиологического раствора - 2 - 3
Гель гидроокиси алюминия, 6%-ный раствор - Остальное
Для изготовления ассоциированной вакцины используют известные производственные штаммы ротавируса свиней "Пугачевский-92" и вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней Transmissible gastroenteritis ВГНКИ N 5. Из антигенов эшерихий вакцина содержит любые производственные или местные штаммы Е.coli, активно продуцирующие адгезиныК88, К99, 987Р, например, с титром антител в реакции агглютинации (РА) со стандартными моноспецифическими антиадгезивными сыворотками 1:320-1:1280 и выше.

При объединении штаммов в предлагаемом по изобретению соотношении наблюдается образование синергетической ассоциации, проявляемой в увеличении напряженности и длительности иммунитета.

Ассоциированная вакцина обеспечивает повышение уровня накопления специфических защитных антител в сыворотке крови и молозиве у вакцинированных свиноматок и сохраняет новорожденных поросят за счет колострального иммунитета.

Для изготовления вакцины каждый из используемых штаммов выращивают в отдельности на соответствующих питательных средах, инактивируют формальдегидом, смешивают в оптимальных объемных соотношениях и адсорбируют антигены с помощью геля гидроокиси алюминия.

Вакцина предназначена для профилактики диареи новорожденных поросят, вызываемой смешанной инфекцией, обусловленной ротавирусом и вирусом трансмиссивного гастроэнтерита свиней, и энтеротоксигенными штаммами эшерихий, продуцирующими факторы адгезии К88, 937Р и К99.

По внешнему виду вакцина, депонированная гелем гидроокиси алюминия, непрозрачная жидкость с белым осадком, который при встряхивании флакона легко разбивается, образуя гомогенную смесь бледно-розового цвета.

Вакцину выпускают в стеклянных флаконах по 50, 100 и 200 см³ с плотно закрытыми резиновыми пробками, обкатанными металлическими колпачками, и этикетируют в соответствии с ТУ.

Вакцина пригодна для применения в течение 12 месяцев со дня ее изготовления, при условии хранения и транспортировке при температуре 2 - 10^oC.

Перед применением флаконы с вакциной необходимо тщательно взбалтывать, а в холодное время подогревать в водяной бане до 37-38^oC.

Вакцину применяют с профилактической целью в хозяйствах, стационарно неблагополучных по инфекционной диарее новорожденных поросят. Вакцину вводят внутримышечно супоросным свиноматкам за 30-35 дней до опороса, двукратно с 12-15-дневным интервалом в дозах для первой прививки 5 мл и для второй - 10 мл. Общая объемная доза для свиноматок составляет 15 мл.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Ротавирус свиней (штамм "Пугачевекий-92") и вирус ТГС (штамм "N 5 ВГНКИ") раздельно размножают в роллерных бутылях с выросшей однословной перевиваемой культурой почки эмбриона свиньи (линия СПЭВ) на комбинированной ростовой среде, состоящей из гидролизата лактоальбумина (ГЛА) - 50%, из среды 199 - 50%, сыворотки крупного рогатого скота - 10% и антибиотиков. Культуру выращивают в течение 3-4-х суток при посевной концентрации 50-100 тыс. клеток на 1 мл среды. Перед внесением в культуру вирусы активируют трипсином (100 мкг/мл в течение 30-35 минут при 37-38^oC) в соотношении 1:10-1:12 и добавляют его в поддерживающую среду без сыворотки. Добавляют глутаминовую кислоту и антибиотики. Ростовую среду сливают, вносят в бутыли с культурой поддерживающую среду и инкубируют при 37-38^oC в течение 24-48 часов. После выраженного разрушения культуры клеток титр вирусов должен составлять 10^6,0 - 10^7,5 ТЦД 50/мл. Для освобождения вируса культуру трехкратно замораживают при минус 18-20^oC и в дальнейшем быстро оттаивают при 36-37^oC.

Полученные культуральные вирусные суспензии осветляют центрифугированием. Полученные вирусные суспензии объединяют и инактивируют формалином с содержанием активного формальдегида 37- 38%, перемешивают и оставляют на сутки при комнатной температуре.

После инактивации вирусов проверяют на бактериальную и грибковую контаминацию, для приготовления вакцины берут вирусные сборы без посторонней контаминации. Контроль полноты инактивации осуществляют путем дачи per os 2 мл вакцинного препарата 3-4 новорожденным поросятам, не получавшим молозива, двух других поросят оставляют в качестве контроля. Вакцинный препарат считают инактивированным, если в течение 7 суток после введения поросята остаются клинически здоровыми.

Для получения эшерихиозного компонента вакцины используют местные или производственные штаммы, например:
"ПЛ-6" - синтезирующий адгезивный антиген К88;
"УК-2" - синтезирующий адгезивный антиген 987Р;
"КВ-1" - синтезирующий адгезивный антиген К99.

Штаммы вызывают гибель белых мышей массой 14-16 г в течение двух суток после внутрибрюшинного заражения в дозе 0,5 мл суспензией суточной культуры, содержащей 1 млрд. м. к. в мл по бактерийному или оптическому стандарту мутности.

Для получения культур E.coli используют питательные среды - мясопептонный агар (МПА) (для штаммов, синтезирующих адгезивные антигены К88 и 987Р) и среду Минка (для штамма, синтезирующего адгезивный антиген К99). Штаммы эшерихий выращивают в отдельности на соответствующих питательных средах при температуре 37^oС. Через 24 часа выросшие колонии исследуют в РА на стекле с моновалентными агглютинирующими антиадгезивными коли-сыворотками соответственно с К88, К99 и 987Р для уточнения чистоты культур.

Матровые расплодки штаммов E.coli хранят в лиофилизированном виде или на полужидкой МПА под вазелиновым маслом при температуре 4-6^oC. Для поддержания в активном состоянии штаммы ежегодно пассируют через новорожденных поросят или куриные эмбрионы.

Для получения биомассы культур эшерихий из матровых расплодок используют МПА (для штаммов, синтезирующих адгезивные антигены К88 и 987Р) и среду Минка (для штамма, синтезирующего антиген К99). После застывания сред делают посев указанных культур по 1,0 мл 1 млрд. м.к. Посевы выдерживают в термостате при 37^oC. Через 24 часа выросшие колонии культур смывают 0,85%-ным раствором хлорида натрия, готовят суспензию в концентрации 120 млрд. м.к. в 1 мл по бактерийному оптическому стандарту мутности ГИСК им. Тарасевича. Культуры проверяют на чистоту, морфологическую и серологическую типичность.

Инактивируют бактериальную взвесь формалином с содержанием 37-38% активного формальдегида. Перемешивают и ставят в термостат на 3 суток. Затем берут пробу на полноту инактивации.

Полноту инактивации контролируют путем посева инактивированных микробных взвесей на соответствующих питательных средах.

Для приготовление ассоциированной вакцины полученные вирусные и бактериальные антигены смешивают в равных объемных соотношениях и добавляют к смеси гель гидроокиси алюминия, исходя из расчета 10 мл на 100 мл вакцинного препарата, доводят pH вакцины до 7,2-7,4 и проверяют на стерильность.

Проверенную на стерильность вакцину расфасовывают при периодическом тщательном перемешивании во флаконы, которые закрывают резиновыми пробками, обкатывают металлическими колпачками и этикетируют. В таблице 1 приведен оптимальный состав вакцины.

Пример 2. Контроль вакцины на стерильность, безвредность и на антигенную активность.

Для проверки на стерильность из 6 флаконов вакцины каждой серии делают посевы по 0,5 мл на МПБ, МПА, МППБ под вазелиновым маслом и агар Сабуро по 2 пробирки на каждый флакон. Посевы со всеми средами выдерживают в термостате при 37^oC, а с агаром Сабуро - при температуре 20-22^oC в течение 15 суток. Питательные среды с посевами должны оставаться стерильными.

Для проверки на безвредность отбирают 10 белых мышей живой массой 17 - 18 г и вводят вакцину в дозе 0,5 см³ подкожно. Вакцину считают безвредной, если мыши в течение 10 суток после введения вакцины остаются живыми и клинически здоровыми.

Антигенную активность вакцины контролируют на 3-х кроликах живой массой 2-2,5 кг, которым подкожно в дозе 2 мл двукратно с интервалом 20-21 день вводят биопрепарат. Через 20-21 день после последней вакцинации у кроликов из ушной вены берут кровь и исследуют сыворотку с целью обнаружения и установления уровня специфических антител к ротавирусу свиней и вирусу ТГС в РВН, а также специфических антител в РА соответствующими эшерихиозными антигенами. Титры антител к ротавирусу ТГС должны быть соответственно в пределах 1:64 - 1:128 и эшерихиям 1:256 - 1:512.

Результаты контроля экспериментальных серий ассоциированной вакцины показали, что все серии биопрепарата были стерильными, безвредными и антигенно-активными.

Пример 3. Испытание экспериментальных серий ассоциированной вакцины было проведено на супоросных свиноматках двух хозяйств Республики Татарстан и Мари-Эл, неблагополучных по смешанным формам инфекционной диареи новорожденных поросят. При этом животные были разделены на 2 группы: опытные и контрольные. Животным опытной группы вакцина вводилась внутримышечно за 30-35 дней до опороса, двукратно с интервалом 12-15 дней в дозах для первой прививки 5 мл, и для второй - 10 мл. Общая объемная доза для свиноматок составляет 15 мл. Результаты производственных испытаний представлены в таблице 2, из которой следует, что ассоциированная вакцина обладает выраженной иммуногенной активностью. В группах поросят, полученных от вакцинированных свиноматок, сохранность составляла от 91,1 до 96,6%, тогда как в контрольных группах этот показатель не превышал 69,1 - 72,9%.

Изобретение предназначено для специфической профилактики смешанных инфекционных диарей новорожденных поросят. Вакцина содержит производственные штаммы ротавируса свиней, вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней (ТГС) и Е.coli. Используют любые штаммы Е.coli, синтезирующие адгезивные антигены К88, К99, 987Р в высоком титре. Выращивают все штаммы раздельно. Сбор рота, коронавирусов осуществляют через 24 -48 ч. Сбор Е.coli - через 24 - 36 ч. При этом смывают выросшие колонии 0,85%-ным стерильным раствором хлорида натрия. Инактивацию вирусов проводят 0,5%-ным раствором формалина при 25 - 27°С в течение 24 - 35 ч. Инактивацию эшерихий -0,5%-ным раствором формалина в течение 72 ч при 36 - 37°С. Смешивают инактивированные культуры ротавируса свиней, коронавируса свиней (ТГС) и Е.coli. К полученной смеси добавляют 6%-ный раствор геля гидроокиси алюминия. С профилактической целью вакцину вводят внутримышечно супоросным свиноматкам за 30 - 35 дней до опороса двукратно с 12 - 15-дневным интервалом в дозах для первой прививки 5 мл и для второй - 10 мл. Изобретение позволяет повысить уровень накопления специфических защитных антител в сыворотке крови и молозиве у вакцинированных свиноматок и сохранить новорожденных поросят за счет колострального иммунитета. 1 табл.

Ассоциированная вакцина против ротавирусной, коронавирусной и эшерихиозной диареи новорожденных поросят, отличающаяся тем, что из антигенов рота- и коронавирусов она содержит инактивированные культуральные суспензии штаммов ротавируса "Пугачевский-92" и коронавируса Transmissible gastroenteritis ВГНКИ 5 с титрами 10^6,0 - 10^7,5 ТЦД 50/мл, из антигенов эшерихий - инактивированные суспензии клеток штаммов Escherichia coli, содержащие адгезины K 88, K 99 и 987P с концентрацией каждого штамма 100 - 120 млрд, кл в 1 мл физиологического раствора и адъювант - 6%-ный раствор геля гидроокиси алюминия, при следующем соотношении компонентов, об.%:
Инактивированная культуральная суспензия штамма ротавируса "Пугачевский-92" с титром 10^6,0 - 10^7,5 ТЦД 50/мл - 40 - 45
Инактивированная культуральная суспензия штамма вируса Transmissible gastroenteritis ВГНКИ 5 с титром 10^6,0 - 10^7,5 ТЦД 50/мл - 40 - 45
Инактивированная суспензия клеток штамма Escherichia coli, содержащая адгезин K 88 с концентрацией 100 - 120 млрд.кл в 1 мл физиологического раствора - 2 - 3
Инактивированная суспензия клеток штамма Escherichia coli, содержащая адгезин K 99 с концентрацией 100 - 120 млрд.кл в 1 мл физиологического раствора - 2 - 3
Инактивированная суспензия клеток штамма Escherichia coli, содержащая адгезин 987P с концентрацией 100 - 120 млрд. кл в 1 мл физиологического раствора - 2 - 3
Гель гидроокиси алюминия, 6%-ный раствор - Остальное