ШТАММ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS SPECIES ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА, ИСПОЛЬЗУЕМОГО ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ РОСТА И ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ ОТ ФИТОПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ Российский патент 1999 года по МПК A01N63/00 C12N1/20 C12N1/20 C12R1/38 

Изобретение относится к биотехнологии и касается нового штамма Pseudomonas specias, который может быть использован для получения бактериального препарата для защиты растений от фитопатогенных микроорганизмов или для стимуляции роста растений.

Известен штамм Pseudomonas specias АР33, подавляющий развитие возбудителей сосудистого и слизистого бактериозов капусты. (Патент РФ N 17993878, кл. A 01 N 63/00, 1993). Семена капусты обрабатывают суспензией штамма бактерий Pseudomonas sp. (ВКПМ В-3481) в концентрации 10⁶-10⁹ кл/мл и высевают в теплицу. Перед высадкой в поле корневую систему саженцев капусты вновь обрабатывают бактериальной суспензией данного штамма, а затем проводят обработку в фазе кочанообразования.

Недостатком известного штамма является узкий спектр его действия и большой расход суспензии, идущей на обработку капусты.

Известен штамм Pseudomonas aureofaciens 35, оказывающий антагонистическое действие на фитопатогенные бактерии (Патент РФ N 1482188 C кл. C 12 N 1/20, 1994), однако спектр его антагонистического действия на фитопатогенные микроорганизмы узок, так как он способен подавлять рост, в основном, фитопатогенных агробактерий, вызывающих бактериальный рак винограда и других растений.

Наиболее ближайшим к заявляемому штамму - прототипом, является штамм Pseudonomas aureofaciens H16, используемый для стимуляции роста растений (Патент РФ N 2001950 C, кл. C 12 N 1/20, 1993).

Известный штамм выделен из ризоплана корневищ пырея ползучего, депонирован ВКМ при ИБФМ РАН под N В-1973Д. Для получения препарата штамм выращивают на среде Альбит-1, содержащей отвар из проростков растений, спиртовый экстракт проростков семян, хлористый натрий, гидролизат казеина и воду, в течение 24-30 часов при 28-30^oC с аэрацией до титра 2-4 • 10⁹ кл/мл. Полученную суспензию используют для обработки семян. Недостатком известного штамма является то, что он, обладая способностью стимулировать рост растений, не защищает их от различных фитопатогенов, обладает низкой продуктивностью и требователен к питательным средам.

Технической задачей изобретения является выделение природного штамма бактерий с широким спектром антагонистического действия на фитопатогенные грибы, и способностью стимулировать рост и развитие растений.

Поставленная задача достигается выявлением и использованием нового штамма Pseudomonas species 17-2, выделенного из ризосферы диких злаков, произрастающих на черноземных почвах в Ордынской лесостепи Новосибирской области. Выделенный штамм депонирован в НИИ "Коллекция культур микроорганизмов" ГНЦ ВБ "Вектор" под регистрационным N В-696.

Штамм Pseudomonas species 17-2 характеризуется следующими признаками,
Морфологические признаки.

Грамотрицательные подвижные палочки с полярными жгутиками, размером 0,5-0,6 х 1,6-2,7 мкм, спор не образуют. Морфология колоний, образующихся при культивировании при 28^oC в течение 2-3 суток. На мясопептонном агаре (МПА) - круглые, гладкие, слабовыпуклые, прозрачные с матовым оттенком, диаметр 3-5 мм; на МПА с LB бульоном или с 2%-ным глицерином колонии прозрачные с беловатым оттенком, слабовыпуклые, гладкие, мелкие. Пигмент с LB бульоном яркозеленый.

Пигментация на диагностических средах Кинга для флурресцирующих псевдомонад (King Е.О. at all. J. Lab. Clin. Med., 1854, v. 44, p. 301).

Кинг A - пигмент отсутствует.

Кинг Б - пигмент зеленый.

Физиолого-биохимические свойства.

Аэроб использует глюкозу только по окислительному пути. В факторах роста не нуждается. Крахмал и целлюлозу не гидролизует. Индол и сероводород не образует. Каталазу образует. Хорошо растет при pH среды от 6,5 до 8,0 и при температуре от 4^oC до 37^oC; при 41^oC - не растет; оптимальная температура роста 28-31^oC. Усваивает с образованием кислоты глюкозу, маннит и глицерин. Не усваивает сахарозу, рафинозу, сорбит, дульцит, инулин. Хорошо усваивает пептон, аланин, аргинин, слабо - аспарагин, тирозин, мочевину. Новый штамм устойчив к антибиотикам: ампицилину (200 мкГ/мл), хлорамфениколу (20 мкГ/мл), новобиоцину (50 мкГ/мл), чувствителен к тетрациклину (10 мкГ/мл), канамицину (100 мкГ/мл). Новый штамм не фитотоксичен, о чем свидетельствует отсутствие мацерации на ломтиках картофеля и некротических пятен на листьях табака при нанесении на них уколом суспензии живых клеток штамма.

Штамм не патогенен для лабораторных животных: при внутрибрюшинном введении двадцати белым мышам весом 14-16 г по 0,5 мл 1 млрд. взвеси 16 часовой культуры штамма Pseudomonas species 17-2 в течение 30 дней гибели животных не наблюдалось.

Штамм хранят в лиофильно высушенном состоянии не менее одного года.

Штамм идентифицирован:
1) по первоисточнику: H.Stolp, D.Gadkari in "The Prokaryotes", Berlinea, 1981, V.1, ch.61, p.719-741.

2) по определителю: Kried N.R. at all. "Bergey's mannual of Systematic Bacteriology", Baltimore-London, 1984.

Для культивирования Pseudomonad species 17-2 (KKM В-696) применяют среду LB следующего состава (г/л): пептон - 10,0, дрожжевой экстракт - 5,0, натрий хлористый - 10,0, вода до 1 литра. Культивирование проводят 28-31^oC при аэрации в течение 16-18 часов до концентрации 5•10¹⁰ кл/мл, затем разводят водой до необходимого титра.

Определяющим отличием предлагаемого штамма от прототипа является то, что он не только стимулирует рост растений, но и подавляет рост фитопатогенных микроорганизмов. Кроме этого, заявляемый штамм обладает более высокой продуктивностью и не требователен к питательным средам.

Свойства нового штамма иллюстрируются следующими примерами.

Пример 1.

Штамм выращивают в течение 16 часов при 30^oC с аэрацией до титра 5•10¹⁰ кл/мл на среде LB, затем разводят водой до необходимой концентрации. Полученной суспензией обрабатывают семена растений перед посевом.

Пример 2.

Методом агаровых блочков изучили действие нового штамма на фитопатогенные грибы.

Культуру бактерий Pseudomonas species 17-2 высевали сплошным "газоном" на поверхность питательного агара (МПА с 2% глицерина или среда Кинга Б) и выращивали в течение 2-3 суток при 28^oC. Затем вырезали диски (агаровые блочки) и переносили на поверхность сплошного "газона" тест-культуры фитопатогенного гриба на среде Чапека или на картофельном агаре (суспензию гриба высевали глубинным способом из расчета около 100 спор на 1 мл среды) чашки со сплошным "газоном" тест-культуры с нанесенными на него агаровыми блочками, засеянными культурой нового штамма, помещали в термостат при 28-30^oC и инкубировали 2-3 суток. Учет проводили по зонам отсутствия или подавления роста тест-культуры вокруг диска с культурой нового штамма.

Результаты представлены в таблице 1 (см, в конце описания) и свидетельствуют о том, что новый штамм Pseudomonas sp. 17-2 имеет широкий спектр антагонистического действия на фитопатогенные грибы.

Пример 3.

В производственных условиях ОПХ Института земледелия и химизации сельского хозяйства РАСХ изучили влияние препарата на основе суспензии клеток нового штамма Pseudomonas sp. 17-2 на способность стимулировать рост растений пшеницы (сорт Новосибирская 89), кукурузы (гибрид Молдавский-23) и сои (сорт СибНИИК-315). Для этого провели предпосевную обработку семян вышеназванных растений из расчета 50 мл суспензии клеток предлагаемого штамма (титр клеток 1•10¹⁰ кл/мл) на 1000 кг семян. Контрольные семена растений обрабатывали водой. Обработанные семена высевают в открытый грунт на делянки размером 1 м² (опыт). Параллельно высевают семена пшеницы, кукурузы и сои, обработанные водой (контроль). В контроле и опыте по 3 делянки на каждую культуру. Стимулирующий эффект препарата оценивают по дню появления всходов после высева семян растений.

Результаты представлены в таблице 2 (см. в конце описания).

Из таблицы 2 видно, что предлагаемый штамм в составе биопрепарата обладает способностью стимулировать рост растений.

Таким образом, новый штамм Pseudomonas sp. 17-2, обладает антагонистической активностью в отношении широкого спектра фитопатогенных микроорганизмов, обладает способностью стимулировать рост растений и может использоваться в составе биопрепаратов для повышения урожая с/х растений.

Изобретение относится к биотехнологии, микробиологии и сельскому хозяйству. Штамм Pseudomonas species 17-2 выделен из ризосферы диких злаков, растущих в Ордынской лесостепи Новосибирской области. Депонирован в НИИ ККМ ГНЦ ВБ "Вектор" под N В-696. Для получения препарата штамм выращивают на среде LВ, содержащей, г/л: пептон 10,0, дрожжевой экстракт 5,0, натрий хлористый 10,0, воду дo 1 л, в течение 16-18 ч при 28-31^oС до концентрации 5•10¹⁰ кл/мл и полученную суспензию используют для обработки семян растений. Препарат, полученный на основе данного штамма, позволяет стимулировать рост растений и подавляет рост фитопатогенных грибов рода Alternaria, Bepolaris, Fusarium. 2 табл.

Штамм бактерий Pseudomonas species НИИ ККМ ГНЦ ВБ "Вектор" В-696 для получения препарата, используемого для стимуляции роста и защиты растений от фитопатагенных микроорганизмов.