ШТАММ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS SPECIES ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ПРОТИВ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ЗАБОЛЕВАНИЙ РАСТЕНИЙ Российский патент 1999 года по МПК A01N63/00 C12N1/20 C12N1/20 C12R1/38 

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и может быть использовано для защиты растений от фитопатогенов.

Известен штамм Pseudomonas fluorescence biovar V MD-4f, подавляющий размножение грибов рода Streptomyces, являющихся возбудителями парши картофеля. Семенной картофель обрабатывают суспензией клеток данного штамма с концентрацией 10⁹ кл/мл (Заявка Японии N 1-19320 А, кл. A 01 N 63/00, опубл. 03.08.89).

Недостатком данного штамма является ограниченный спектр действия (только на фитопатогенные грибы рода Streptomyces) и большой расход суспензии, идущей на обработку картофеля.

Известен штамм Pseudomonas putida, подавляющий рост фитопатогенного гриба Fusarium oxysporum (Патент США N 4714614, кл. C 12 N 1/20, 1987). Однако не описано его действие на другие фитопатогены.

Известен штамм Pseudomonas cepacia АММА, подавляющий рост фитопатогенных грибов вида Aphanomyces (Патент США N 5244658 кл. C 12 N 1/20, опубл. 14.09.93). Однако отсутствуют сведения о его антагонистической активности в отношении других фитопатогенов.

Наиболее ближайшим к заявляемому штамму прототипом является штамм Pseudomonas aureofaciens, подавляющий рост вирулентных агробактерий, вызывающих бактериальный рак винограда и других растений (Патент РФ N 1482188 кл. C 12 N 1/20, опубл. 15.03.94, БИ N 5). Известный штамм депонирован в ВКПМ под номером В-4117. Клетки данного штамма выращивают в течение 24 часов при 30^oC на бульоне Хоттингера или картофельном агаре до титра клеток 10⁸-10⁹ кл/мл. Недостатком данного штамма является узкий спектр его антагонистического действия. Целью изобретения является выделение природного штамма бактерий с широким спектром антагонистического действия на фитопатогенные грибы.

Новый штамм Pseudomonas species 7Г выделен из ризосферы диких злаковых растений в Ордынской лесостепи Новосибирской области.

Выделенный штамм Pseudomonas species 7Г задепонирован в НИИ "Коллекция культур микроорганизмов ГНЦ ВБ "Вектор" под регистрационным номером В-694. Штамм хранится в лиофильно высушенном состоянии.

Штамм Pseudomonas speciеs 7Г характеризуется следующими признаками:
Морфологические признаки.

Это грамотрицательные, подвижные, короткие палочки с полярными жгутиками, спор не образуют, размер 0,6 х (1,3-2,6) мкм. Клетки хорошо растут на простых питательных средах: мясопептонном агаре (МПА), картофельном агаре, минимальных средах с глюкозой или глицерином, на среде LB.

Морфология колоний на агаризованных средах (при 28^oC на 2-3 сутки):
на МПА колонии выпуклые, прозрачные с матовым оттенком, гладкие, слизистой консистенции, диаметр 5-7 мм;
на МПА с 2% глицерином колонии прозрачно-беловатые, умеренно слизистые, выпуклые, средние.

Пигмент на МПА желто-зеленый, диффундирующий в среду.

Пигментация на диагностических средах Кинга для флуоресцирующих псевдомонад (King Е.О. at all. J. Lab. Clin. Med., 1954, v.44, p.301).

Кинг A - пигмент отсутствует.

Кинг Б - желто-зеленый, флуоресцирующий, интенсивный пигмент.

Физиолого-биохимические свойства:
строгий аэроб, метаболизм глюкозы окислительный. В факторах роста не нуждается. Крахмал и целлюлозу не гидролизует. Максимальная температура роста на питательных средах равна 40^oC, минимальная - 4^oC, оптимальная - 30^oC. Хорошо растет при pH 6,5-7,5.

В качестве единственного источника углерода усваивает глюкозу и глицерин и не усваивает рамнозу, галактозу, мальтозу, сорбит, дульцит, инозит.

Новый штамм устойчив к антибиотикам:
рифампицину (50 мкг/мл), ампициллину (200 мкг/мл), новобиоцину (50 мкг/мл) и чувствителен к тетрациклину (10 мкг/мл).

Штамм не фитотоксичен, о чем свидетельствует отсутствие мацерации на ломтиках картофеля и некротических пятен на листьях табака при нанесении на них уколом суспензии живых клеток штамма.

Штамм не вирулентен для лабораторных животных: при введении двадцати мышам внутрибрюшинно суспензии его клеток по 1 млрд клеток в объеме 0,5 мл в течение 30 дней животные не погибали.

Новый штамм хранится на косяках картофельного агара в холодильнике с пересевом на свежие косяки через 2-4 месяца и в лиофильно-высушенном состоянии (в ампулах) не менее года.

Штамм идентифицирован:
1. по первоисточнику H.Stolp, D.Dadkari in "The procaryotes", Berlinea, 1981, v. 1, cb.61, p.719-741.

2. по определителю "Bergey's Manual of Sistematic Bacteriology", v.1, ed Krieg N.R. et al., Baltimore/London, 1984.

Для культивирования Pseudomonas specias НИИ KKM (ГНЦ ВБ "Вектор) В-694 применяют среду LB следующего состава, г/л: пептон 10,0, дрожжевой экстракт 5,0, натрий хлористый 10,0, вода до 1 л. Культивирование проводят при 28-30^oC в течение 14-16 часов до достижения титра клеток 1•10¹¹ кл/мл, затем суспензию клеток разводят до необходимой концентрации.

Определяющим отличием нового штамма от прототипа является более широкий спектр антагонистического действия на возбудителей грибных заболеваний растений. Кроме этого, новый штамм отличается высокой продуктивностью и высокой скоростью метаболизма. Свойства нового штамма иллюстрируются следующими примерами:
Пример 1.

Клетки нового штамма выращивают в течение 14 часов при 30^oC на чашках с МПА на LB бульоне следующего состава, г/л:
Пептон - 10,0
Дрожжевой экстракт - 5,0
NaCl - 10,0
Вода дистиллированная - До 1 л
Клетки смывают фосфатным буфером (pH 7,2), центрифугируют и суспензируют в этом же буфере до титра 9•10¹⁰ кл/мл. Полученную суспензию используют как препарат против фитопатогенных микроорганизмов.

Пример 2.

Изучили действие нового штамма на фитопатогены. Культуру бактерий высевали сплошным "газоном" на поверхность питательного агара (МПА с 2% глицерина или среда Кинга Б) и выращивали при 28^oC в течение 2-3 суток. Затем вырезали диски агаризованной среды с культурой нового штамма и размещали их на поверхности другой агаровой пластинки (среда Чапека или картофельный агар), предварительно засеянной глубинным способом суспензией фитопатогенного гриба. Чашки помещали в термостат при 28-30^oC на 3-6 суток. Учет проводили по зонам отсутствия или подавления роста гриба вокруг диска с культурой нового штамма. Изучена антагонистическая активность нового штамма относительно 7 видов фитопатогенных грибов. Результаты приведены в табл.1
Из табл. 1 видно, что новый штамм Pseudomonas sp. 7Г оказывает антагонистическое действие в отношении всех исследованных видов фитопатогенных грибов.

Пример 3.

В производственных условиях АОЗТ "Ирмень" Ордынского р-на Новосибирской области изучили влияние препарата на основе суспензии клеток нового штамма Pseudomonas sp. 7Г на снижение степени поражения мягкой яровой пшеницы Новосибирская 89 корневыми гнилями хлебных злаков. Для этого провели предпосевную обработку семян из расчета: 50 мл суспензии клеток предлагаемого штамма (титр клеток 1•10¹⁰, кл/мл) на 1000 кг зерна. Контрольные семена пшеницы обрабатывали водой. Семена высевали в открытый грунт на полях с высоким минеральным фоном (жидкие удобрения).

В результате обработки получили результаты, которые приведены в табл. 2.

Из табл. 2 видно, что обработка семян пшеницы Новосибирская 89 суспензией клеток нового штамма позволяет снизить заболеваемость растений корневыми гнилями в 7 раз и увеличить урожай пшеницы на 6 ц/га.

Таким образом, предлагаемый штамм Pseudomonas sp. ККМ В-694 в составе биопрепарата позволяет подавлять широкий спектр фитопатогенных микроорганизмов и способствует повышению урожая злаковых культур и других растений.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и сельскому хозяйству. Штамм Pseudomonas sp. 7Г выделен из ризосферы диких злаковых растений. Депонирован в НИИ "Коллекция культур микроорганизмов" ГНЦ ВБ "Вектор" под В-694. Для получения препарата против возбудителей грибных заболеваний растений штамм выращивают на среде LB , содержащей, г/л: пептон 10,0, дрожжевой экстракт 5,0, натрий хлористый 10,0, воду до 1 л, в течение 14-16 ч при 28-30^oC до концентрации 10¹⁰-10¹¹ кл/мл. Затем с агаризованной среды клетки смывают буфером, разводят до титра 10⁶-10⁷ кл/мл. Штамм проявляет антагонистические свойства против грибов рода Altermaria, Bipolaris, Fusarium, Rhizochonia, Helmintosporium, Phytophthora. 2 табл.

Штамм бактерий Pseudomonas species НИИ ККМ ГНЦ ВБ "Вектор" В-694 для получения препарата против возбудителей заболеваний растений.