ШТАММ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS AUREOFACIENS ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ПРОТИВ ЗАБОЛЕВАНИЙ ПШЕНИЦЫ, ВЫЗЫВАЕМЫХ ГРИБНЫМИ ФИТОПАТОГЕНАМИ Российский патент 2003 года по МПК C12N1/20 A01N63/00 C12N1/20 C12R1/38 

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и касается штамма, который оказывает антагонистическое действие на возбудителей заболеваний пшеницы твердой головней и корневыми гнилями и поэтому может быть использован для защиты от них сельскохозяйственных растений.

Известен штамм Pseudomonas sp. ЦМПМ В-348, используемый для получения препарата при защите злаковых от возбудителя обыкновенной корневой гнили Helminthosporium sativum (1). Однако этот штамм неэффективен для подавления корневой гнили злаков, вызываемой комплексом грибов Fusarium spp. и Н. sativum.

Известны штаммы Pseudomonas putida, подавляющий рост фитопатогенного гриба Fusarium oxysporum (2) и Pseudomonas putida BKM В-1743Д, подавляющий рост грибов рода Fusarium (3). Недостатками известных штаммов является узкий спектр антагонистического действия.

В качестве прототипа выбран штамм бактерий Pseudomonas species, проявляющий антагонистическую активность к фитопатогенным грибам Alternaria spp., Bipolaris sorokiniana, Fusarium oxysporum, F. gibbosum, F. sumbucinum (4). Однако отсутствуют сведения о действии этого штамма на такие широко распространенные возбудители болезней растений, как Fusarium culmorum, F. graminearum, F. nivale, F. semitectum, F. solani.

Кроме того, во всех перечисленных аналогах и прототипе нет сведений об активности выделенных штаммов микроорганизмов по отношению к возбудителю наиболее вредоносной болезни пшеницы - твердой головне (Tilletia caries), потери от которой приводят к недобору 10-15% урожая.

Технической задачей изобретения является выделение нового природного штамма с широким спектром действия на возбудителей грибных заболеваний растений, в том числе и твердой головни.

Поставленная задача достигается выявлением и использованием штамма Pseudomonas aureofaciens 51, выделенного из образца пахотных земель, отобранного в Мелеузовском районе Республики Башкортостан. Штамм депонирован в коллекции культур Института биологии Уфимского научного центра РАН под ИБ 51. Он характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Короткие, подвижные палочки, грам-отрицательные, спор не образуют. Морфологию колоний на питательных средах определяли после 4-5 сут роста при 28^oС. На мясопептонном агаре (МПА) - круглые с ровными краями, гладкие, слабовыпуклые, непрозрачные, ярко-оранжевые в центре с более светлой окантовкой, слизистой консистенции колонии, диаметр 5-6 мм, пигмент ярко-оранжевый, диффундирующий в среду. На МПА с 2% глицерина - колонии крупнее, интенсивнее окрашены, более интенсивная диффузия в среду пигмента.

Пигментация на диагностических средах Кинга для флюоресцирущих псевдомонад: Кинг А - пигмент отсутствует; Кинг Б - образуется желто-зеленый флюоресцирующий пигмент. В жидких питательных средах (МПБ) образуется тонкая, сплошная, складчатая пленка. На МПА-косяках штрих обильный, сплошной с ровным краем.

Физиолого-биохимические признаки. По отношению к кислороду - аэроб, окислительный тип метаболизма. Не нуждается в факторах роста. Разжижает желатин. Пептонизирует и свертывает молоко. Образует леван из сахарозы, не гидролизует крахмал. Продуцирует каталазу, образует аргининдигидролазу. Гидролизует лецитин, Твин-80. Растет при 4^oС, растет на МПБ с 3% NaCl. Усваивает с образованием кислоты глюкозу, ксилозу, сахарозу, арабинозу, рафинозу, фруктозу. В качестве источника углерода использует мальтозу, бутанол, гексанол, маннит, глицерин, бензойную кислоту, пропионовую кислоту, антраниловую кислоту, янтарную кислоту, α-кетоглутаровую кислоту, пируват, лактат, цитрат, фенилаланин, серин, лейцин, аргинин, аланин, валин, триптофан, орнитин, пролин, лизин, тирозин. Не усваивает лактозу, этанол, пропанол, сорбит, ацетамид, малеиновую кислоту, адипиновую кислоту, оксалат, изомасляную кислоту, треонин, метионин, цистеин, гексан, декан, октадекан, формальдегид, фенол.

Штамм устойчив к ампициллину (5000 мкг/мл), стрептомицину (500 мкг/мл), эритромицину (100 мкг/мл), чувствителен к гентамицину (100 мкг/мл).

Штамм не обладает фитопатогенной активностью, о чем свидетельствует отсутствие мацерации на ломтиках картофеля при нанесении на них уколом живых клеток штамма.

Штамм хранится на косяках МПА в холодильнике с пересевом на свежие косяки через 2-4 мес, а также в лиофильно-высушенном состоянии.

Штамм идентифицирован по определителю Bergey's Manual of Determinative Bacteriology.

Пример 1. Получение биомассы
Штамм выращивают в течение 48 ч при 28-30^oC с аэрацией до титра 10⁹ КОЕ/мл на среде LB следующего состава, г/л: пептон - 10,0; дрожжевой экстракт - 5,0; натрий хлористый - 10,0; вода водопроводная до 1 л. При необходимости суспензию клеток разводят водой до необходимого титра.

Определяющим отличием предлагаемого штамма от прототипа является более широкий спектр действия на возбудителей грибных заболеваний растений.

Пример 2. Изучение антагонистической активности нового штамма Pseudomonas aureofaciens ИБ 51
На пластинки глюкозо-пептонного агара (глюкоза - 5 г; пептон - 5 г; калий фосфорнокислый двузамещенный - 4 г; калий фосфорнокислый однозамещенный - 2 г; вода дистиллированная - 1 л) высевают сплошным газоном суспензию спор грибного фитопатогена. Затем на эти же пластинки уколом сажают бактерии штамма Pseudomonas aureofaciens ИБ 51. Чашки инкубируют при 28^oС в течение 3 сут.

Учет проводят по зонам отсутствия или подавления роста гриба вокруг колонии штамма. Результаты приведены в табл.1 и свидетельствуют о широком спектре антагонистического действия нового штамма.

Пример 3. Антагонистическое действие нового штамма против комплекса возбудителей корневых гнилей пшеницы испытывают в лабораторных условиях на пшенице сорта "Жница" с естественным уровнем заражения посевного материала, полученного в условиях опытного поля Башкирского Государственного Аграрного Университета. Семена пшеницы обрабатывают суспензией штамма (с титром 10⁹ КОЕ/мл) из расчета 1 мл суспензии на 50 г семян. Семена переносят на увлажненную до полной влагоемкости полоску фильтровальной бумаги, прикрывают такой же полоской увлажненной фильтровальной бумаги, поверх которой накладывают полоску полиэтилена, сворачивают в рулон, помещают вертикально в лабораторный стакан и оставляют при комнатной температуре. В контрольных опытах обработку семян осуществляют водопроводной водой. В качестве эталонов используют химический препарат дивидент и биопрепараты - фитоспорин и планриз. Эксперимент выполняют в четырехкратной повторности. Обработку результатов проводят через 7 дней. Эффективность штамма определяют при сопоставлении степени проявления корневых гнилей проростков пшеницы в опыте и контроле. Результаты приведены в табл.2.

В этой же таблице приведены и результаты лабораторных экспериментов, выполненных по аналогичной методике, но с дополнительным инфицированием посевного материала спорами фитопатогенных грибов Fusarium oxysporum и Bipolaris sorokiniana (титр споровой суспензии обоих патогенов составил 5•10⁴ КОЕ/мл).

Из табл. 2 видно, что новый штамм в условиях естественного инфекционного фона заражения не уступает биологическим препаратам фитоспорин и планриз в эффективности воздействия на фитопатогены. Наряду с этим следует отметить, что предлагаемый штамм обладает способностью стимулировать рост пшеницы, что проявляется не только в увеличении средней длины проростков на 13-19%, но и в снижении в 4,5-6 раз числа проростков, обладающих дефектами, отстающих в росте корешков и ростков.

Что касается дополнительного заражения посевного материала фитопатогенами: увеличение инфекционной нагрузки за счет Fusarium oxysporum показало, что новый штамм успешно справляется с присутствием на зернах данного патогена.

Пример 4. Антагонистическое действие штамма против возбудителя твердой головни пшеницы испытывали на пшенице сорта "Жница", искусственно зараженной Tilletia caries, в условиях закрытого грунта в теплице. Заспорение спорами твердой головни осуществляли из расчета 1-2 г спор на 1 кг зерна. Семена пшеницы обрабатывали суспензией штамма (с титром 10⁹ КОЕ/мл) из расчета 1 мл суспензии на 50 г семян и высаживали в вегетационные сосуды по 60 штук с учетом всхожести данного сорта пшеницы. В контрольных экспериментах обработку семян осуществляли водопроводной водой. В качестве эталонов использовали химический препарат дивидент и биологические препараты фитоспорин и планриз. Эксперименты выполняли в трехкратной повторности.

Эффективность штамма определяли при сопоставлении степени проявления заболевания растений твердой головней в опыте и контроле в период молочно-восковой спелости зерна. Результаты приведены в табл.3.

Как свидетельствуют результаты эксперимента, биологическая эффективность подавления твердой головни на пшенице у штамма Pseudomonas aureofaciens 51 составляет 52,7%, при 41,8% у выбранного аналога.

Таким образом, штамм Pseudomonas aureofaciens 51 обладает антагонистической активностью в отношении широкого круга фитопатогенных грибов, в том числе против возбудителя твердой головни Tilletia caries, a также характеризуется способностью стимулировать рост пшеницы, что в целом позволяет увеличить урожай в 1,7 раза.

Список литературы
1. Авторское свидетельство СССР 1464468, кл. А 01 N 63/00, 1988.

2. Патент США 4714614, кл. 424-93, 1987.

3. Патент RU 1805849, кл. А 01 N 63/00, 1993.

4. Патент RU 2130261, кл. А 01 N 63/00, С 12 N 1/20, 1999.

изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и касается штамма Pseudomonas aureofaciens 51, который выделен из образца пахотных земель Мелеузовского района Республики Башкортостан. Штамм Pseudomonas aureofaciens депонирован в коллекции культур Института биологии Уфимского научного центра РАН под ИБ 51. В качестве препарата против заболеваний пшеницы используют суспензию, полученную при культивировании данного штамма, и обрабатывают семена пшеницы. Препарат, полученный на основе данного штамма, подавляет развитие заболеваний пшеницы, вызываемых твердой головней и корневыми гнилями. 3 табл.

Штамм бактерий Pseudomonas aureofaciens, депонированный в коллекции микроорганизмов Института биологии Уфимского научного центра Российской Академии Наук под номером ИБ 51, для получения препарата против заболеваний пшеницы, вызываемых грибными фитопатогенами.