ШТАММ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS SPECIES ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ПРОТИВ ГРИБНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ РАСТЕНИЙ Российский патент 1999 года по МПК A01N63/00 C12N1/20 C12N1/20 C12R1/38 

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и биотехнологии и касается штамма, который оказывает антагонистическое действие на фитопатогенные грибы и поэтому может быть использован для защиты от них сельскохозяйственных растений.

Известен штамм Pseudomonas putida, подавляющий рост фитопатогенного гриба Fusarium oxysporurm (Патент США N 4714614 кл. 424-93, 1987). Однако отсутствуют сведения о его спектре действия на другие фитопатогены.

Известен штамм Pseudomonas cepacia, активный против ряда фитопатогенных грибов (Патент ЕПВ N 0257756, кл. A 01 N 63/00, 1987). Однако не имеется сведений о действии этого штамма на такие широко распространенные и вредоносные возбудители болезней растений, как Alternaria spp.. HeIminthosporium, Botrylis, Fusarium.

Наиболее ближайшим к заявляемому штамму - прототипом, является штамм бактерий pseudomonas putida BKM В-1743Д, подавляющий рост фитопатогенных грибов рода Fusarium (Патент 1805849 RU, кл. A 01 N 63/00, опубл. 30.03.93; БИ N 12). Известный штамм выделен из ризосферы дикорастущих злаков в Республике Армения. Для получения препарата, используемого для защиты растений от грибов рода Fusarium и бактерий Erwinia, штамм выращивают на МПБ на качалке при 30^oC в течение 16-18 часов до концентрации 109 кл/мл. Обработку семян производят из расчета 10⁶-10⁷ клеток на 1 г семян. Недостатком известного штамма является низкая продуктивность и узкий спектр антагонистического действия.

Технической задачей изобретения является получение нового природного штамма с широким спектром действия на возбудителей грибных заболеваний растений.

Поставленная задача достигается выявлением и использованием штамма Pseudomonas species 7Г2К, выделенного из ризосферы диких злаков, произрастающих на черноземных почвах в Ордынской лесостепи Новосибирской области.

Основными критериями отбора служили высокая продуктивность и подавление роста основных фитопатогенов с/х культур в лабораторных и полевых условиях. В качестве селектирующих факторов использованы также способность к быстрому росту и устойчивость к широкому спектру токсических веществ окружающей среды.

Полученный штамм Pseudomonas species 7Г2К депонирован в НИИ "Коллекция культур микроорганизмов" ГНЦ ВБ "Вектор" под регистрационным номером В-695. Штамм хранится в лиофильно высушенном состоянии.

Штамм Pseudomonas Sp 7Г2К характеризуется следующими признаками:
Морфологические признаки.

Палочковидные подвижные клетки с пучком полярных жгутиков, размером 0,7 • (1,7-3,8) мкм, большинство бактерий объединены в пары или кластеры, грамотрицательные, спор не образуют. Морфология колоний на питательных средах определялась после роста в течение 2-3 суток роста при 28-30^oC. Колонии на мясо-пептонном агаре (МПА.) бежевые, сильно выпуклые, крупные 10-12 мм. Пигмент зеленый, диффундирующий в среду. Под ультрафиолетовым светом (260 нм) вокруг колоний наблюдается флуоресцирующая зеленая зона. На МПА с LB бульоном колонии беловатые, густослизистые, выпуклые, крупные. На диагностических средах Кинга: Кинг А - пигмент отсутствует. Кинг Б - интенсивный зеленый.

На МПА - косяках штрих светло-бежевый, блестящий, выпуклый, пигмент зеленый.

Физиолого-биохимические свойства.

По отношению к кислороду - облигатный аэроб, метаболизм дыхательный. В факторах роста не нуждается. Образует аргининдигидрогеназу и оксидазу. Крахмал и целлюлозу не гидролизует.

Оптимальная температура роста 28-30^oC; растет при 5^oC и не растет при 42^oC. Хорошо растет в пределах pH среды от 6,5 до 7,5. Устойчив к NaCl: до 2%-ной концентрации.

В качестве источника углерода использует глюкозу, глицерин, маннит и не усваивает рафинозу, сорбит, дульцит, инулин.

Штамм устойчив к ампициллину (200 мкг/мл), рифамницину (50 мкг/мл), новобиоцину (50 мкг/мл), хлорамфениколу (100 мкг/мл), канамицину (100 мкг/мг) и чувствителен к тетрациклину (10 мкг/мл).

Штамм не обладает инфекционным и общетоксическим эффектом. Штамм не обладает фитопатогенной активностью, о чем свидетельствует отсутствие мацерации на ломтиках картофеля и некротических пятен на листьях табака при нанесении на них уколом суспензии живых клеток штамма.

Штамм идентифицирован:
1) по первоисточнику H.Stolp., D.Gadkari in "The prokaryotes". Berlinea, 1981, v.1., ch. 61, р.719-741.

2) по определителю Kried N.R. et all. Beregey's mannual of Systemat Bacteriology. London, '984, v.1.

Для культивирования Pseudomonas species 7Г2К применяют среду LB следующего состава:
Пептон - 10,0
Дрожжевой экстракт - 5,0
NaCI - 10,0
Вода дистиллированная - Остальное
Культивирование, проводят при 28-30^oC в течение 10-12 ч до достижения плотности культуры 10¹⁰-10¹¹ клеток на 1 мл. Полученную суспензию разводят до титра 10⁶-10⁷ кл/мл и используют для защиты растений от фитопатогенов.

Определяющим отличием предлагаемого штамма от прототипа является более широкий спектр действия на возбудителей грибных заболеваний растений.

Пример 1. Получение биомассы.

Перед началом работы клетки штамма Pseudomonas Sp. 7Г2К пересевают на агаризованную среду, помещают в термостат на 30^oC. После 18-20 часовой инкубации подросшие клетки пересевают в колбы с LB-бульоном и проводят культивирование при 30^oC с аэрацией при перемешивании в течение 12 ч до достижения плотности суспензии (5-9)•10¹⁰ жизнеспособных клеток/мл суспензии.

Для выращивания бактерий можно также использовать картофельный агар, для смывания - физиологический раствор или стерильную воду.

Пример 2. Изучение антагонистической активности нового штамма Pseudomonas sp. 7Г2К. Культуру бактерий высевали сплошным "газоном" на поверхность питательного агара (МПА с 2% глицерина или среда Кинга Б) и выращивали при 28^oC в течение 2-3 суток. Затем вырезали диски агаризованной среды (агаровые блочки) с культурой нового штамма и размещали на сплошной "газон" тест культуры (фитопатогенного гриба). Для получения сплошного "газона" среду Чапека или картофельный агар засевали глубинным способом тест-культурой из расчета около 100 спор на мл среды. Чашки со сплошным "газоном" тест-культуры фитопатогенного гриба с нанесенными на него агаровыми блочками с клетками нового штамма Pseudomonas sp. В-695 помещали в термостат при 28-30^oC на 3-6 суток. Учет проводили по зонам отсутствия или подавления роста гриба вокруг диска с клетками штамма. Результаты приведены в табл. 1 и свидетельствуют о широком спектре антагонистического действия нового штамма относительно фитопатогенных грибов.

Пример 3. В производственных условиях АОЗТ "Раздольное" Коченевского р-на Новосибирской области изучили влияние препарата на основе суспензии клеток нового штамма Pseudomonas sp. 7Г2К на снижение степени поражения мягкой яровой пшеницы Новосибирская 67 и Новосибирская 89 корневыми гнилями. Для этого провели предпосевную обработку семян из расчета: 50 мл суспензии клеток предлагаемого штамма (титр 10¹⁰ клеток/мл) на 1000 кг зерна. Контрольные семена пшеницы обрабатывали водой. Сев Новосибирской 67 провели по злаковым травам на площади 200 га (контроль - сев по кукурузе), а сев Новосибирской 89 провели по зерновым на площади 372 га (контроль - сев по злаковым травам). Испытания препарата на основе предлагаемого штамма проведены в условиях длительной холодной засухи мая-июня 1997 года.

Результаты приведены в табл. 2.

Из табл. 2 видно, что обработка семян пшеницы суспензией клеток нового штамма позволяет снизить заболеваемость растений корневыми гнилями на 10,4-18,6% и увеличить урожай пшеницы на 5 ц/га (33,3%).

Изобретение относится к сельскому хозяйству и биотехнологии . Штамм Pseudomonas species 7Г2К выделен из ризосферы диких злаковых растений. Депонирован в НИИ "Коллекция культур микроорганизмов" ГНЦ ВБ "Вектор" под номером В-695. Для получения препарата против грибных заболеваний растений штамм выращивают на различных питательных средах при 28 - 30°С в течение 10 - 12 ч до концентрации 10¹⁰ - 11¹¹ кл/мл. Затем клетки смывают водой или буферным раствором, разводят до титра клеток 10⁶ - 10⁷ в мл и полученную суспензию используют для защиты растений от фитопатогенов. Штамм проявляет антагонистические свойства против грибов рода Phytopthora, Fusarium, Alternaria, Rhizoctonia, не требователен к питательным средам, отличается активным метаболизмом и высокой продуктивностью. 2 табл.

Штамм бактерий Pseudomonas species НИИ ККМ ГНЦ ВБ "Вектор" И-695 для получения препарата против грибных заболеваний растений.