ТЕСТ ДЛЯ ИНТЕГРАЛЬНОЙ ОЦЕНКИ СОСТОЯНИЯ ЗАГРЯЗНЕНИЯ МОРСКОЙ И ПРЕСНОЙ ВОДЫ Российский патент 1999 года по МПК C12N9/22 C12Q1/34 C02F3/34 

Изобретение относится к биохимии, в частности к водной токсикологии, и может быть использовано для интегральной экспресс-оценки различных токсикантов в морской воде.

В связи с усиливающейся антропогенной нагрузкой на водные экосистемы, все большую актуальность приобретают проблемы поиска и разработки высокочувствительных и простых методов, характеризующих качество природной морской воды. Широко используемые методы физико-химического и химико-аналитического контроля, хотя и обладают высокой чувствительностью, но основаны на определении отдельных поллютантов, и не дают достаточно полной информации о содержании в морской воде комплекса загрязняющих веществ /1/.

В связи с этим за последние 15-20 лет внимание служб контроля за качеством вод для проведения своевременных водоохранных мероприятий все в большей степени привлекает биотестирование морской среды. Основанное на изучении изменений биологических показателей, биотестирование дает возможность получить интегральную информацию о качестве среды и предсказать экологические последствия. В мировой практике одним из наиболее популярных биотестов, являющихся частью системы тестирования морской воды с использованием половых клеток, эмбрионов и личинок морских ежей ("Sea Urchin Test System"), является метод, основанный на анализе оплодотворяющей способности сперматозоидов морского ежа, предварительно выдержанных в среде с токсическими веществами /2/. Этот биотест обладает рядом несомненных достоинств: относительной дешевизной, быстротой эксперимента (60 мин). Однако точность и чувствительность этого метода, как и вообще биотестирования, недостаточно высоки (малая достоверность и плохая воспроизводимость результатов), так как измеряемые параметры жизнедеятельности зависят от индивидуальных характеристик организма. Вместе с тем, существует новый подход к разработке биотестов, сочетающий в себе получение интегральных характеристик среды, высокую точность и чувствительность, универсальность и экспрессность путем использования ферментных систем, ответственных за какой-либо параметр жизнедеятельности организма /3/. При биомониторинге природной морской воды способность тест-систем к интегральной оценке токсичности множества веществ (отходов промышленных и сельскохозяйственных объектов, сточных вод и т.д.), является обычно более важным, чем их чувствительность к определенным токсикантам.

Как известно, скорость ферментативных процессов в значительной степени может зависеть от присутствия веществ, способных специфично ингибировать или активировать ферментативную реакцию. Поэтому введение исследуемой пробы морской воды в ферментную тест-систему, содержащую как фермент, так и его субстрат, с последующей регистрацией изменений свойств системы, позволяет оценить потенциальные возможности среды обитания для осуществления ферментативной реакции.

Разработанные ранее экспрессные тест-системы трипсин - азоказеин и амилаза - модифицированный крахмал, были использованы для оценки качества морской воды Черного моря /4/. Было показано, что некоторые из изученных образцов воды, обнаруживают эффекты ингибирования как протеазной, так и амилазной активностей.

Известно, что природная морская вода представляет собой раствор с высокой ионной силой, причем ее соленость варьируется в различных морях и океанах, а значения pH в зависимости от времени года и глубины погружения изменяются в интервале от 7,5 до 8,1 /5/. Поэтому, при мониторинге природной морской воды оптимальной является такая ферментативная тест-система, у которой скорости гидролиза субстрата в буферном растворе и в чистой морской воде одинаковы. Известные же тест-системы имеют более низкую ферментативную активность в чистой морской воде по сравнению с буферным раствором (трипсин-азоказеин до 50%), в связи с чем возникают трудности при интерпретации получаемых результатов. Возможными ингибиторами протеаз могут быть присутствующие в незагрязненных природных водах метаболиты, экскретируемые микроорганизмами. Поэтому ингибирование ферментативной активности в подобных случаях не может являться оценкой степени загрязненности среды. Одновременно на величину активности ферментов, помимо загрязняющих факторов, оказывают влияние такие параметры, как разные величины солености, pH среды и концентрация солей металлов, присутствующих в природной морской воде в естественных фоновых концентрациях.

Задача изобретения - разработка ферментативного теста, пригодного для анализа природных морских и пресных вод, сочетающего в себе получение интегральных характеристик загрязнения водной среды (подобно биотестам, использующим живые объекты) с высокой точностью анализа, простотой и чувствительностью; а также расширение арсенала тестов для оценки загрязнения и качества природных вод, включая морскую.

Поставленная задача решена применением металлозависимой дезоксирибонуклеазы (ДНКазы), полностью сохраняющей активность при гидролизе субстрата в морской воде, выделенной, например, из эмбрионов или икры морского ежа, в качестве теста для оценки состояния загрязнения морской и пресной воды.

Выделение и некоторые физико-химические свойства ДНКазы из эмбрионов морского ежа Strongylocentrotus intermedius описаны в работах /6, 7/. Исследование свойств и специфичности фермента показало, что данная ДНКаза, как и другие высокоспецифичные ДНКазы, может быть использована в молекулярной биологии и генной инженерии в качестве инструмента исследования необычных структур ДНК, а также в биотехнологии при получении биологически активных веществ. В связи с тем, что ферменты этого класса (нуклеазы) обладают противовирусным, противоопухолевым и иммуномодулирующим действием, возможно использование данной ДНКазы в медицине и ветеринарии, Использование ДНКазы в качестве тест-системы для оценки состояния загрязнения природных вод ранее известно не было. Авторами заявляемого изобретения установлено, что ДНКаза, выделенная из эмбрионов или икры морского ежа, обладает уникальным свойством расщеплять высокополимерную ДНК в природной морской воде (растворе с высокой ионной силой) без потери ферментативной активности относительно стандартной инкубационной смеси. Соли различных металлов, присутствующие в природной морской воде в фоновых концентрациях, а также естественные вариации pH воды в интервале от 7,6 до 8,2, не влияют на ферментативную активность, как и разбавление морской воды дистиллированной. Это коренным образом отличает тест с предлагаемой нами ДНКазой от известных ферментативных тестов.

В модельных экспериментах нами показано, что дополнительное введение как в стандартную инкубационную смесь, так и в чистую морскую воду различных концентраций двухвалентных ионов меди, цинка, кадмия, свинца, железа практически полностью подавляют активность фермента при концентрациях 0,1 - 3,0 мг/л. Чувствительность ДНКазной активности к присутствию в морской воде пестицидов (ДДТ, изофен, хлорофос, линдан), детергентов (порошок "Лотос", додецилсульфат натрия) и углеводородов нефти сказывается меньше и в значительной степени зависит от вида используемого соединения. Данное тестирование было проведено с целью создания базовых данных о токсикологических эффектах различных реагентов на предлагаемый модельный объект для определения его чувствительности и универсальности при анализе загрязнений морской среды.

Показано также ингибирующее действие на ДНКазный тест проб морской воды, взятой на анализ из загрязненных промышленными стоками акваторий Амурского и Уссурийского заливов (Японское море), то есть чувствительность фермента к комплексному влиянию токсикантов. Биотестирование, проведенное нами на присутствие в морской воде тяжелых металлов и некоторых пестицидов по показателям активности ДНКазы, свидетельствует о том, что предлагаемый метод сравним по своей чувствительности с биотестом, использующим в качестве тест-объекта сперматозоиды морских ежей /8/ (см. таблицу).

Предлагаемый тест совмещает в себе ряд достоинств, характерных для биохимических методов (точность и воспроизводимость результатов, кратковременность анализа, относительная простота и экономичность), с некоторыми преимуществами биотеста, основанного на анализе оплодотворяющей способности сперматозоидов морского ежа (получение интегральной характеристики токсичности среды). Однако, в отличие от последнего, применение ДНКазного теста не зависит от времени года и сезона нереста морских ежей. Используется стандартный и достаточно стабильный препарат фермента, возможно тестирование токсикантов в морской воде разной степени солености, вплоть до пресной. Таким образом, ДНКаза из эмбрионов или икры морского ежа является удобным модельным объектом и может быть использована в тест-системе в качестве универсального и чувствительного биоиндикатора для экспресс-оценки качества морской воды и контроля за ее состоянием,
Пример 1 конкретного выполнения изобретения.

Предварительно было проведено токсикологическое опробирование тест-системы, с целью создания базовых данных о токсикологических эффектах различных реагентов на предлагаемый модельный объект. В чистую морскую воду (0,9 мл) добавляют 5 ед. акт. ДНКазы и 300 мкг ДНК (0,05 мл) и известные количества отдельных химических реагентов (0,05 мл). Стандартная инкубационная смесь в объеме 1 мл содержит 300 мг ДНК, 5 ед.акт. ДНКазы, 5 мМ трис-HCl буфера, pH 7,5, 5 мМ MgCl₂ и 0,1 мМ CaCl₂. Смеси инкубируют при 37^oC в течение 30 мин. Ферментативную активность определяют по количеству образующихся в процессе гидролиза ДНК кислоторастворимых олигонуклеотидов по стандартной методике /7/.

При оценке токсичности известного реагента определяют ту его концентрацию, при которой достигается 50%-ное ингибирование ДНКазной активности (ИК 50). За 100% принимают активность фермента, определяемую в стандартной инкубационной смеси за вычетом контроля. Результаты параллельных опытов отличаются на 2-5%. ДНКазу из эмбрионов морского ежа Strongylocentrotus intermedius выделяют по методу /6/. Фермент хранят в 50 мМ трис-HCl буфере, pH 7,5, в 50%-ном глицерине в течение 6 месяцев без потери активности. Высокополимерную ДНК растворяют в 5 мМ трис-HCl буфере, pH 7,5, с концентрацией 3-4 мг/мл.

Пример 2.

Проведение непосредственного тестирования загрязнения морской воды для измерения суммарной токсичности неизвестных химических веществ. К 0,9 мл исследуемого образца воды добавляют в 0,1 мл 300 мгДНК и 5 ед.акт. ДНКазы с последующей инкубацией 30 мин при 37^o.

Пример 3.

Все стадии идентичны примеру 2, кроме того, что вместо ДНКазы из эмбрионов морского ежа Strongylocentrotus intermedius, используют ДНКазу из икры морского ежа Strongylocentrotus intermedius.

Пример 4.

Все стадии идентичны примеру 2, кроме того, что вместо ДНКазы из эмбрионов морского ежа Strongylocentrotus intermedius используют ДНКазу из икры морского ежа Tripheustes ventaicosus.

Пример 5.

Все стадии идентичны примеру 2, кроме того, что вместо ДНКазы из эмбрионов морского ежа Strongylocentrotus intermedius используют ДНКазу из икры морского ежа Lytechinus variegatus.

Пример 6.

Все стадии идентичны примеру 2, кроме того, что образец чистой природной морской воды разбавляют в 2, 3, 4, 5 раз дистиллированной водой, соленость меняется от 16 до 6 промиллей, при этом активность фермента сохраняется. (фиг. 1 и 2).

Пример 7.

Все стадии идентичны примеру 2, кроме того, что вместо морской воды берут 0,9 мл образца пресной воды, к которому добавляют 0,1 мл ДНК и ДНКазу в 5 мМ трис-HCl буфере, pH 7,5, 5 мМ MgCl₂ и 0,1 мМ CaCl₂
Литература
1. Экологическое нормирование антропогенных нагрузок //Экология. 1992. N 6. С. 3-12.

2. Improved methodology for a sea urchin sperm cell bioassay for marine waters //Arch. Environ. Contam. Toxicol. 1987. V. 16. P. 23-32.

3. Люциферазное биотестирование: биофизические основы, методы и применение. Дисс. докт. биол. наук. Красноярск, 1994.

4. Использование ферментных тест-систем для мониторинга состояния морских вод Черного моря //Экология. 1996. N 5. С. 589-597.

5. Тяжелые металлы в природных водах. М.: Мир. 1987. 288 с.

6. Выделение и некоторые свойства Ca, Md-зависимой дезоксирибонуклеазы из эмбрионов морского ежа Strongylocentrotus intermedius // Биохимия. 1976. Т.41. N 11. С. 2007-2014.

7. Влияние ионов двухвалентных металлов на ферментативную активность Ca, Mg-зависимой ДНКазы из эмбрионов морского ежа Strongylocentrotus intermedius//Биохимия. 1980. Т.45. N 3. С. 544-553.

8. Comparative sensitivity of sea urchin sperm bioassays to metals and pesticides //Arch. Environ. Contam. Toxicol. 1989. V. 18. P. 748-755.

Изобретение относится к биотехнологии и касается определения загрязнения природных вод. Разработан ферментативный тест для анализа загрязнения водной среды, основанный на применении металлозависимой ДНКазы, выделенной из эмбрионов или икры морского ежа. Данный фермент сохраняет 100%-ную активность при гидролизе субстрата в морской воде. Он позволяет интегрально оценить присутствие в воде тяжелых металлов, пестицидов и других токсикантов по ингибированию ферментативной активности. Преимуществом теста является его точность, чувствительность, простота и экономичность в использовании. 2 ил., 1 табл.

Применение металлозависимой дезоксирибонуклеазы (ДНКазы), выделенной из эмбрионов или икры морского ежа, в качестве теста для интегральной оценки состояния загрязнения морской и пресной воды.