КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДИГОКСИНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ МЕТОДОМ ИНВЕРСИОННОЙ ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИИ Российский патент 1999 года по МПК G01N27/48 

Изобретение относится к области аналитической химии, в частности к инверсионно-вольтамперометрическому способу определения лекарственного препарата, дигоксина в сыворотке крови.

Дигоксин является кристаллическим глюкозидом, хорошо всасывающимся из желудочно-кишечного тракта и обеспечивающего полное терапевтическое действие при пероральном лечении. Препарат используется при различных формах сердечной недостаточности; случаи недостаточности кровообращения с нормальной фреквенцией и брадикардией; декомпенсированные пороки сердца. Для подготовки сердечных больных к операции и перед родами. Декомпенсация в педиатрической практике.

Количественное определение дигоксина является актуальным в оценке эффективности лечения сердечно-сосудистой системы.

В клинической практике для количественной оценки дигоксина используются радиоиммуный и имунноферментный методы, а также метод тонкослойной хроматографии /1/. Недостатками этих методов являются дороговизна аппаратуры и наборов реактивов, и трудоемкость исследования в методе тонкослойной хроматографии.

Сведений же по определению микроколичеств дигоксина вольтамперометрическим и инверсионно-вольтамперометрическим методами отсутствуют.

Известен инверсионно-вольтамперометрический способ определения лекарственного вещества /2/. Осадок вещества концентрируют (t_э=180 с) на фоне щелочных растворов на висячей ртутной капле при потенциале электролиза (E_э), равном - 0,90-0,95 В с последующей регистрацией вольтамперных кривых при следующих значениях Е:от - 1,90 - 1,95 В.

Наиболее близким способом является инверсионно-вольтамперометрический метод определения кардиопрепарата, этацизина, взятый за прототип /3/. Осадок вещества концентрируют на ртутно-пленочном электроде с серебряной подложкой в течение (t_э= 120 с) при потенциале электролиза (E_э) 0,50 - 0,55 В на фоне буферного раствора Бриттона-Робинсона с последующей регистрацией вольтамперных кривых при скорости развертки потенциала 30 мВ/с, при следующих значениях E: от - 0,80 до -1,00 В (отн.нас.к.э.). Использование условий, приведенных в способе прототипа, делают невозможным применение данного способа для определения дигоксина в биологических средах (плазмы, сыворотки крови и др.).

Целью изобретения является увеличение чувствительности и экспрессности способа определения дигоксина методом адсорбционной инверсионной вольтамперометрии. Поставленная цель достигается тем, что проводят электрохимическое накопление дигоксина на поверхности электрода с последующей регистрацией поляризационных кривых.

Разработанная экспресс-методика позволит определять концентрацию дигоксина в сыворотке крови для коррекции доз в период реабилитации послеоперационных больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями.

Новым в способе является то, что проводят электрохимическое накопление дигоксина на поверхности ртутно-пленочного электрода "игольчатого" при потенциале электролиза (E_э), равном - (1,75 - 1,80) В на фоне 0,2 н хлорида лития в течение 170 - 190 с с последующей регистрацией поляризационных кривых при линейной скорости развертки потенциала 20 мВ/с, а концентрацию препарата определяют по высоте волны в интервале потенциалов от - (1,1-1,0) В, относительно хлорсеребряного электрода.

В предлагаемом способе определение дигоксина проводят на фоне 0,2 н хлорида лития, который ранее применялся для определения микроколичеств веществ электрохимическими методами. Концентрация (0,2н) подобрана экспериментально, и этот признак обладает относительной новизной.

Другим отличительным признаком являются установленные условия электрохимического накопления:E_э равен - (1,75 - 1,80) В.

В прототипе диапазон потенциалов электролиза 0,50 - 0,55 В, который не позволяет накапливать дигоксин на индикаторном электроде. При значениях E_э < - 1,75 В величина регистрируемого анодного тока значительно уменьшается, что снижает чувствительность определения, а при E_э > - 1,80 В - происходит частичное накопление осадка.

Важным для определения дигоксина методом инверсионной вольтамперометрии является выбор скорости развертки потенциала. Оптимальной экспериментально установленной является 20 мВ/с. Увеличение скорости линейно меняющегося потенциала увеличивает чувствительность, но при этом растет ток заряжения; увеличивается остаточный ток и уменьшается разрешающая способность способа, затрудняется обработка полярограмм.

Время предварительного электролиза выбирают в зависимости от концентрации определяемого соединения. Оптимальное значение t_э равно 180+10 с, при этом достигается максимальное значение величины тока растворения накопленных осадков с поверхности ртутно-пленочного электрода и хорошая воспроизводимость для количественного определения органического вещества (0,1).При t_э > 190 с на полярограмме появляются дополнительные сигналы, что снижает чувствительность определения и воспроизводимость полезного сигнала. При t_э < 170 с величина тока растворения не достигает максимального значения, что снижает чувствительность определения лекарственного препарата.

В предлагаемом способе в качестве индикаторного электрода использовали пленку ртути на серебряной проволоке, упакованной в полиэтилен "игольчатый" электрод. Такой электрод чаще используется при определении неорганических веществ, для определения лекарственного препарата был использован впервые. Органические вещества способны образовывать со ртутью устойчивые комплексы или труднорастворимые соли. Это позволяет концентрировать их на электроактивном электроде.

Установленные условия впервые позволили количественно определять дигоксин путем регистрации вольтамперных кривых при потенциалах - (1,75 - 1,80) В на фоне 0,2 н хлорида лития. Нижняя граница определяемых содержаний (C_н) этого соединения равна 9,2•10^-10 г/мл. Относительное стандартное отклонение (S_r) для диапазона концентраций 10^-10 - 10^-7 г/мл не превышает 0,1.

Все условия определения дигоксина подобраны экспериментально. Приготовления фоновых и стандартных растворов органического вещества в воде являются общепринятыми.

Пример 1. Определение дигоксина методом инверсионной вольтамперометрии.

В кварцевый стаканчик емкостью 5 мл наливают 4 мл 0,2 н хлорида лития. Раствор деаэрируют азотом (или аргоном) с содержанием кислорода 0,01% в течение 30 с, и, не прекращая перемешивания, проводят электролиз раствора при условии: E_э = 180 с и t_э = 180 с. Отключают газ и фиксируют вольтамперограмму при скорости развертки потенциала 20 мВ/с. Отсутствие пиков свидетельствует о чистоте фона.

Затем добавляют N капель объемом 0,01 мл стандартного раствора дигоксина 2•10^-5 г/мл, перемешивают раствор и проводят электрохимическое концентрирование осадка при E_э = -1,80 В и t_э = 180 с. Аналитический сигнал для указанной концентрации дигоксина регистрируют в диапазоне потенциалов от - (1,1-1,0)В при чувствительности прибора 10^-7 А/мм.

Время единичного анализа не превышает 7-10 минут. Установленные экспериментальные условия определения дигоксина методом инверсионной вольтамперометрии позволяют с высокой чувствительностью и экспрессностью определить лекарственный препарат в водной и биологических средах, а также позволяют разработать методику определения содержания микроколичеств дигоксина в плазме, сыворотке крови.

Подготовку пробы проводили следующим образом: 0,1 мл сыворотки крови разбавили 0,8 мл воды и добавили 0,05 мл десятипроцентного раствора вольфрамата натрия и 0,05 мл концентрированной серной кислоты. Затем пробу центрифугируют 5-10 минут. Данная методика используется в клинической практике для осаждения белков /4 /. Для определения лекарственного препарата такая пробоподготовка используется впервые.

Пример 2. Определение дигоксина в сыворотки крови методом инверсионной вольтамперометрии.

В кварцевый стаканчик емкостью 5 мл наливают 4 мл 0,2 н хлорида лития. Раствор деаэрируют азотом 30 с и, не прекращая перемешивания, проводят электролиз раствора при условии: E_э = -1,80 В и t_э = 180 с. Отключают газ и фиксируют вольтамперограмму при скорости развертки потенциала 20 мВ/с. Затем добавляют N капель объемом 5 мкл сыворотки крови, перемешивают раствор и проводят электрохимическое концентрирование осадка в тех же условиях. Съемку вольтамперной кривой начинают с потенциала -1,4В, находят содержание методом добавок. Продолжительность анализа двух параллельных проб не превышает 20 минут.

Не мешают определению щавелевая кислота, сероорганические соединения. Определяемое предлагаемым способом на порядок выше по сравнению с прототипом, не требует неводных сред и большого количества реактивов.

Предлагаемый способ определения дигоксина обладает абсолютной чувствительностью (для анализа достаточно 5 мкл пробы) и может быть использован для определения лекарственных веществ подобного типа в биологических средах у больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями.

Источники информации.

1. Холодов Л.Е.,Яковлев В.П. //Клиническая фармакокинетика. - М. :Медицина, 1985 г.

2. Wang J., Farias P.A., Mahmoud J.//Analyst. 1986. Vol. 111. p.837.

3. Ивановская E.A., Анисимова Л.С./ Инверсионно- вольтамперометрическое определение этацизина.//Роспатент N 2045057. 1992г.

4. Добсон Р. , Эллиот Д. , Эллиот У., Джонс К.,/Справочник биохимика//Москва, "Мир",1991 г.

Использование: в аналитической химии, в частности при определении лекарственного препарата на примере дигоксина в сыворотке крови. Сущность изобретения: инверсионно-вольтамперометрический способ количественного определения дигоксина в сыворотке крови заключается в электрохимическом концентрировании вещества на поверхности электрода с последующей регистрацией вольтамперных кривых. Концентрирование проводят на ртутно-пленочном электроде в течение 180 с при потенциале электролиза (-1,80) - (-1,75) В на фоне 0,2 н хлорида лития с последующей регистрацией вольтамперных кривых при скорости развертки потенциала 20 мВ/с, а концентрацию дигоксина определяют по высоте пика в диапазоне потенциалов (-1,10) - (-1,00) В относительно хлорсеребряного электрода. Техническим результатом изобретения является увеличение чувствительности и экспрессности способа.

Инверсионно-вольтамперометрический способ определения дигоксина в сыворотке крови, заключающийся в электрохимическом концентрировании вещества на поверхности электрода с последующей регистрацией вольтамперных кривых, отличающийся тем, что концентрирование проводят на ртутно-пленочном электроде "игольчатом" в течение 180 c(t_э) при потенциале (E_э) - (1,75 - 1,80) В на фоне 0,2 н хлорида лития с последующей регистрацией вольтамперных кривых при скорости развертки потенциала 20 мВ/с, а концентрацию дигоксина определяют по высоте пика в диапазоне потенциалов - (1,1 - 1,00) В относительно хлорсеребряного электрода.