СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КАРВЕДИЛОЛА МЕТОДОМ ИНВЕРСИОННОЙ ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИИ Российский патент 2008 года по МПК A61K31/403 G01N27/48 G01N33/15 

Изобретение относится к области аналитической химии, в частности к инверсионному вольтамперометрическому способу определения лекарственного вещества карведилола ([({±})-1-(9Н-карбазол-4-илокси)-3-[[2-(2-метоксифенокси)этил]амино]пропан-2-ол]), и может быть использовано в медицине для определения концентрации в крови карведилола, являющегося β-адреноблокатором.

Данный лекарственный препарат оказывает антиангинальное, гипотензивное, антиоксидантное, сосудорасширяющее, антипролиферативное действие. Блокирует β- и α₁-адренорецепторы. Оказывает выраженный сосудорасширяющий эффект. Вследствие артериолярной вазодилатации снижает постнагрузку на сердце и тормозит нейрогуморальную вазоконстрикторную активацию сосудов и сердца. Активность ренина плазмы снижается. Тормозит пролиферацию и миграцию гладкомышечных клеток, действуя на специфические митогенные рецепторы. Не оказывает выраженного влияния на липидный обмен и содержание ионов калия, натрия, магния в плазме. Побочных эффектов, требующих отмены карведилола, не наблюдается. Он проявляет выраженное улучшение класса хронической сердечной недостаточности, ослабление клинической симптоматики заболевания, снижение частоты желудочковых аритмий [3; 4; 5].

Количественное определение карведилола является актуальным в оценке эффективности лечения заболеваний сердечно-сосудистой системы.

Сведения по количественному определению микроколичеств карведилола методом инверсионной вольтамперометрии отсутствуют.

Известен способ определения карведилола с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии, основанный на определении площади пика вещества исследуемого и стандартного образцов. При этом используют жидкостный хроматограф с автоинжектором типа SJL-10AD (Shimadzu), дозирующим устройством 10 мкл, детектором переменного ультрафиолета типа SPD-10AV, систему обработки данных типа SCL-100, насос типа LC-10AD; колонка: Supelcosil LC-18DB, 5 мкм, нержавеющая сталь, 250×4,6 мм, предколонка: Supelcosil LC-18DB, 5 мкм, нержавеющая сталь, 4,6×4,6 мм. В качестве подвижной фазы выступает смесь растворителей, состоящая из ацетонитрила и 0,1 М раствора однозамещенного фосфата натрия в соотношении (48:52) по объему, значение рН которой доведено до значения 3,7 с помощью 85% раствора фосфорной кислоты. Скорость прохождения раствора через сорбент составляет 0,8 мл/мин, объем вводимой пробы - 20 мкл, время регистрации пиков - 40 мин [2].

Недостатками данного способа являются длительность и трудоемкость анализа, подразумевающая использование большого количества реактивов, которые могут загрязнять пробу при проведении исследования.

Наиболее близким способом является инверсионно-вольтамперометрическое определение лекарственного препарата дигоксина, взятое за прототип. Определение дигоксина заключается в электрохимическом концентрировании вещества на поверхности ртутно-пленочного электрода в течение 180 с при потенциале электролиза (-1,80)-(-1,75) В на фоне 0,2 н. лития хлорида с последующей регистрацией вольтамперных кривых при скорости развертки потенциала 20 мВ/с, а концентрацию дигоксина определяют по высоте пика в диапазоне потенциалов (-1,10)-(-1,00) В относительно хлор-серебряного электрода [1].

Использование условий, приведенных в способе-прототипе, не обеспечивает чувствительности и экспрессности определения карведилола в модельных смесях и биологических жидкостях.

Целью изобретения является увеличение чувствительности и экспрессности способа определения карведилола методом инверсионной вольтамперометрии.

Поставленная цель достигается техническим решением, представляющим собой определение карведилола методом инверсионной вольтамперометрии, путем регистрации поляризационных кривых с предварительным электрохимическим концентрированием вещества на поверхности электрода. Для этого через раствор пропускают азот с содержанием кислорода менее 0,001%, и, не прекращая перемешивания, проводят электролиз раствора при потенциале -0,4 В в течение 210 с. В качестве рабочего используют графитовый электрод с золотым напылением. Затем регистрацию поляризационных кривых проводят при постоянно-токовой форме развертки потенциала со скоростью 150 мВ/с. Концентрацию карведилола определяют по высоте пика в интервале потенциалов от 0,2 до 0,9 В относительно хлор-серебряного электрода. Определение проводят на фоне 0,01 моль/л раствора калия хлорида при нейтральной рН среды.

Новым в способе является то, что проводят предварительное электрохимическое накопление карведилола при потенциале электролиза, равном (-0,4) В в течение 210 с. В качестве рабочего электрода используют графитовый электрод с золотым напылением. Регистрацию поляризационных кривых проводят при постоянно-токовой форме развертки потенциала со скоростью 150 мВ/с, а концентрацию карведилола определяют по высоте пика в интервале потенциалов от 0,2 до 0,9 В относительно хлор-серебряного электрода на фоне 0,01 моль/л раствора калия хлорида при нейтральной рН среды.

Отличительные признаки, характеризующие изобретение, проявили в заявляемой совокупности новые свойства (увеличение чувствительности 10^-3-10^-1 мг/л и экспрессности анализа), явным образом не вытекающие из уровня техники в данной области и не являющиеся очевидными для специалиста.

Идентичной совокупности признаков не обнаружено при изучении патентной и научно-медицинской литературы.

Данное изобретение может быть использовано в практическом здравоохранении.

Исходя из вышеизложенного следует считать предлагаемое изобретение соответствующим условиям патентоспособности «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».

Все условия определения карведилола подобраны экспериментально. Приготовление фоновых и стандартных растворов органического вещества в воде являются общепринятыми.

В процессе поиска оптимальных условий инверсионного вольтамперометрического определения карведилола изучено влияние ряда факторов (индикаторный электрод; фоновый электролит; его концентрация и рН; время и потенциал электролиза; скорость развертки потенциала) на высоту аналитического сигнала (табл.1-3).

В качестве фоновых электролитов были исследованы растворы аммония фосфорнокислого двузамещенного, аммония нитрата, натрия фосфорнокислого одно- и двузамещенного, калия хлорида, лития хлорида, кальция хлорида с добавлением разведенной серной, хлороводородной, винной кислот; натрия гидрокарбоната, натрия и калия гидроксидов. Исходя из полученных результатов в качестве фонового электролита был выбран раствор калия хлорида, так как на нем наблюдали четкую волну окисления карведилола, кроме того, данный раствор обеспечивал хорошую электропроводность, широкую рабочую область и необходимую площадь для обработки сигнала, был прост в приготовлении, к преимуществам также можно отнести продолжительный срок годности.

Оптимальная концентрация раствора калия хлорида составила 0,01 моль/л. В более концентрированных растворах мы не наблюдали прироста от добавки при наличии большого остаточного тока, тогда как более разбавленный раствор был неустойчив во времени.

рН фонового раствора должна соответствовать нейтральной (6-7), так как в кислой среде (рН до 6) сигнал карведилола искажается путем раздвоения пика, тогда как в щелочной среде (рН свыше 7) полностью исчезает.

В предлагаемом способе в качестве индикаторного электрода использовали графитовый с золотым напылением. Преимуществом такого электрода является возможность получения более узких и высоких пиков, служащих аналитической характеристикой определяемого вещества, что повышает разрешающую способность метода. Карведилол легко адсорбируется на графитовой с золотым напылением рабочей поверхности, это позволяет концентрировать его на электроактивном электроде.

Оптимальное время накопления составило 210 с, при этом достигалось максимальное значение величины тока растворения накопленных осадков с поверхности графитового электрода с золотым напылением и хорошая воспроизводимость для количественного определения исследуемого вещества. При времени электролиза более 210 с происходило насыщение осадка на электроде, аналитический сигнал карведилола искажался и затруднялась обработка полярограмм. При времени электролиза менее 210 с величина тока растворения не достигала максимального значения, что снижало чувствительность определения вещества (табл.1).

Другим отличительным признаком являются установленные условия электрохимического накопления. Оптимальный потенциал электролиза составил -0,4 В. В прототипе диапазон потенциалов электролиза соответствует (-1,80)-(-1,75) В, который не позволяет максимально полно накапливать карведилол на индикаторном электроде. При значениях потенциала электролиза более -0,4 В величина регистрируемого анодного тока значительно уменьшается, что снижает чувствительность определения, а при значениях потенциала электролиза менее -0,4 В происходит частичное накопление осадка (табл.2).

Важным для определения карведилола инверсионным вольтамперометрическим методом является выбор скорости развертки потенциала. Оптимально экспериментально установленной является 150 мВ/с. Изменение скорости развертки потенциала в сторону увеличения или уменьшения заметно понижало высоту аналитического сигнала, при этом уменьшалась и разрешающая способность метода, что затрудняло обработку полярограмм, увеличивало время анализа и не позволяло определять очень низкие концентрации карведилола (табл.3).

Пример 1. Определение карведилола методом инверсионной вольтамперометрии в растворе.

В кварцевый стаканчик емкостью 20 мл помещают 10 мл 0,01 моль/л раствора калия хлорида при нейтральной рН среды. При потенциале -0,4 В раствор деаэрируют азотом с содержанием кислорода менее 0,001% в течение 30 с и, не прекращая перемешивания, проводят электролиз при потенциале -0,4 В в течение 210 с. Отключают газ и фиксируют вольтамперограмму при постоянно-токовой форме развертки потенциала со скоростью 150 мВ/с. Отсутствие пиков свидетельствует о чистоте фона.

Затем добавляют N капель объемом 0,01 мл стандартного раствора карведилола 0,1 мг/л, перемешивают раствор и проводят электрохимическое концентрирование вещества при потенциале -0,4 В в течение 210 с. Отключают газ и фиксируют вольтамперограмму при постоянно-токовой форме развертки потенциала со скоростью 150 мВ/с. Аналитический сигнал для указанной концентрации карведилола регистрируют в диапазоне потенциалов от 0,2 до 0,9 В.

Время единичного анализа не превышает 10 мин.

Установленные условия впервые позволили количественно определить карведилол путем регистрации вольтамперных кривых при потенциале -0,4 В на фоне 0,01 моль/л раствора калия хлорида. Нижняя граница определяемых концентраций карведилола составляет 10^-1 мг/л. Относительная погрешность отдельной варианты (ε) для диапазона концентраций 995-0,00995 мг/л не превышает 1% (табл.4).

Экспериментально установленные условия определения карведилола методом инверсионной вольтамперометрии позволяют с высокой чувствительностью и экспрессностью определить указанное соединение в водной среде, а также позволяют разработать методику определения содержания микроколичеств карведилола в плазме и сыворотке крови.

Таблица 1
ВЛИЯНИЕ ВРЕМЕНИ ЭЛЕКТРОЛИЗА НА ВЫСОТУ АНАЛИТИЧЕСКОГО СИГНАЛА КАРВЕДИЛОЛА№ п/пКонцентрация раствора стандартного образца карведилола в электролитической ячейке, мг/лВремя электролиза, сВысота аналитического сигнала, мкА11,042·10^-4300,346±0,0302600,740±0,0183900,842±0,00841200,985±0,01051501,152±0,00861801,210±0,00672101,364±0,00282401,351±0,00392701,343±0,004103001,302±0,001113301,247±0,005123601,200±0,004133901,106±0,007144201,049±0,006154501,036±0,004164801,017±0,003175101,005±0,002185400,975±0,001195700,962±0,009206000,954±0,008Примечание: Потенциал электролиза -0,4 В;Границы развертки потенциала от -0,4 до 1,5 В;Скорость развертки потенциала - 150 мВ/с.

Таблица 2
ВЛИЯНИЕ ПОТЕНЦИАЛА ЭЛЕКТРОЛИЗА НА ВЫСОТУ АНАЛИТИЧЕСКОГО СИГНАЛА КАРВЕДИЛОЛА№ п/пКонцентрация раствора стандартного образца карведилола в электролитической ячейке, мг/лПотенциал электролиза, ВВысота аналитического сигнала, мкА11,042·10^-4-1,800,209±0,0442-1,700,521±0,0333-1,600,635±0,0134-1,500,768±0,0095-1,400,804±0,0126-1,300,883±0,0047-1,200,897±0,0058-1,100,977±0,0049-1,000,998±0,00310-0,901,004±0,00111-0,801,214±0,00512-0,701,274±0,01013-0,601,353±0,00714-0,501,355±0,00215-0,401,364±0,00216-0,300,822±0,00917-0,200,531±0,00618-0,100,296±0,0051900,083±0,013Примечание: Время электролиза - 210 с;Границы развертки потенциала от -0,4 до 1,5 В;Скорость развертки потенциала - 150 мВ/с.

Таблица 3
ВЛИЯНИЕ СКОРОСТИ РАЗВЕРТКИ ПОТЕНЦИАЛА НА ВЫСОТУ АНАЛИТИЧЕСКОГО СИГНАЛА КАРВЕДИЛОЛА№ п/пКонцентрация раствора стандартного образца карведилола в электролитической ячейке, мг/лСкорость развертки потенциала, мВ/сВысота аналитического сигнала, мкА11,042·10^-4200,347±0,0212300,453±0,0113400,531±0,0084500,543±0,0045600,634±0,0026700,825±0,0017800,994±0,0018901,253±0,00491001,278±0,003101501,364±0,002112001,226±0,005122501,182±0,002133001,175±0,008143501,097±0,011154000,904±0,012Примечание: Время электролиза - 210 с;Потенциал электролиза -0,4 В;Границы развертки потенциала от -0,4 до 1,5 В.

ТАБЛИЦА 4.
МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ РАЗРАБОТАННОЙ МЕТОДИКИ
(f, число степеней свободы, - 19; Р, доверительная вероятность, - 95%; t (P; S), критерий Стьюдента (табл.), - 2,09)№ п/пИстинное значение измеряемой величины, мг/л μСредние выборки, Дисперсия, S²Стандартное отклонение, SПолуширина доверительного интервала, результат отдельного определения, ±ΔХОтносительная погрешность отдельной варианты, ε, %Относительная погрешность среднего результата, , %1995,000990,95884,919,2219,271,950,44299,50099,0442,511,583,303,330,7539,9509,8981,8·10^-21,34·10^-12,80·10^-12,830,6440,9959,893·10^-13,56·10^-41,89·10^-20,88·10^-24,040,8950,09959,90·10^-21,82·10^-61,35·10^-32,82·10^-32,850,6460,009959,899·10^-32,38·10^-81,54·10^-43,22·10^-43,250,73

Источники информации

1. Ивановская Е.А. Количественное определение дигоксина в сыворотке крови методом инверсионной вольтамперометрии. // Патент РФ №2132553.

2. НД 42-11503-01. Карведилол.

3. Analysis of 24 hour ambulatory ECGs from the CHRISTMAS study (abstract no. 3026) / P.W.Macfarlane, G.D.Murray, J.McGowan et al. // Circulation. - 2002. - V.106, Suppl. 19. - P.613.

4. Carvedilol increases two-year survival in dialysis patients with dilated cardiomyopathy: a prospective, placebo-controlled trial / G.Cice, L.Ferrara, A.D'Andrea et al. // J. Am. Coll. Cardiol. - 2003. - V.41. - P.1438-1444.

5. Efficacy of carvedilol on complex ventricular arrhythmias in dilated cardiomyopathy: double-blind, randomized, placebo-controled study / G.Cice, E.Tiagliamonte, L.Ferrara et al. // Eur. Heart J. - 2000. - V.21 - P.1259-1264.

Изобретение относится к области аналитической химии, в частности к инверсионному вольтамперометрическому способу определения лекарственного вещества карведилола ([({±})-1-(9Н-карбазол-4-илокси)-3-[[2-(2-метоксифенокси)этил]амино]пропан-2-ол]), и может быть использовано в медицине для определения концентрации в крови карведилола, являющегося гипотензивным препаратом группы β-адреноблокаторов. Через исследуемый раствор пропускают азот с содержанием кислорода менее 0,001% и, не прекращая перемешивания, проводят электролиз раствора при потенциале -0,4 В в течение 210 с. В качестве рабочего используют графитовый электрод с золотым напылением. Регистрацию поляризационных кривых проводят при постоянно-токовой форме развертки потенциала со скоростью 150 мВ/с, а концентрацию карведилола определяют по высоте пика в интервале потенциалов от 0,2 до 0,9 В относительно хлорсеребряного электрода на фоне 0,01 моль/л раствора калия хлорида при нейтральной рН среды. Технический результат заключается в увеличении чувствительности и экспрессности способа. 4 табл.

Способ определения карведилола ([({±})-1-(9Н-карбазол-4-илокси)-3-[[2-(2-метоксифенокси)этил]амино]пропан-2-ол]) методом инверсионной вольтамперометрии, заключающийся в электрохимическом концентрировании вещества на поверхности электрода с последующей регистрацией вольтамперных кривых, отличающийся тем, что концентрирование проводят на графитовом электроде с золотым напылением в течение 210 с при потенциале электролиза (- 0,4) В на фоне 0,01 моль/л раствора калия хлорида при нейтральной рН среды, с последующей регистрацией вольтамперных кривых при постоянно-токовой форме развертки потенциала со скоростью 150 мВ/с, а концентрацию карведилола определяют по высоте пика в диапазоне потенциалов 0,2-0,9 В относительно хлорсеребряного электрода.