СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНГИОТЕНЗИНА II МЕТОДОМ ИНВЕРСИОННОЙ ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИИ Российский патент 2005 года по МПК G01N27/48 

Изобретение относится к области аналитической химии, в частности к инверсионному вольтамперометрическому способу определения гормона ангиотензина II, и может быть использовано в дифференциальной диагностике гипертонической болезни.

Ангиотензин II (Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe) - многофункциональный пептид, биологическое действие которого реализуется посредством его взаимодействия со специфическими рецепторами клеточных мембран.

Основные эффекты ангиотензина II разделяют на два вида: внепочечные и внутрипочечные. Ангиотензин II является сильнейшим сосудосуживающим агентом. При введении в организм он суживает артериолы и вызывает прессорный эффект, то есть повышает артериальное давление. Считают, что ангиотензин II играет роль в патогенезе артериальной гипертонии, так как увеличивает периферическое сосудистое сопротивление и вызывает гипертрофию левого желудочка сердца при гипертонии. Под действием ангиотензина II увеличивается выработка одного из гормонов надпочечников - альдостерона, что приводит к усиленной реабсорбции натрия в почечных канальцах [1].

Таким образом, ангиотензин II является не только мощным сосудосуживающим агентом, но и биологически активным веществом, повышающим выработку альдостерона и активирующим симпатическую нервную систему.

Количественное определение ангиотензина II является актуальным в оценке эффективности лечения заболеваний сердечно-сосудистой системы.

Сведения по количественному определению микроколичеств ангиотензина II методом инверсионной вольтамперометрии отсутствуют.

Наиболее близким способом является инверсионно-вольтамперометрическое определение лекарственного препарата дигоксина, взятое за прототип. Определение дигоксина заключается в электрохимическом концентрировании дигоксина на поверхности ртутно-пленочного электрода в течение 180 с, при потенциале электролиза (-1,80)-(-1,75) В на фоне 0,2 н. лития хлорида с последующей регистрацией вольтамперных кривых при скорости развертки потенциала 20 мВ/с, а концентрацию дигоксина определяют по высоте пика в диапазоне потенциалов (-1,10)-(-1,00) В относительно хлор-серебряного электрода [2]. Использование условий, приведенных в способе прототипе, не обеспечивает чувствительность и экспрессность определения ангиотензина II в модельных смесях и биологических жидкостях.

Целью изобретения является увеличение чувствительности и экспрессности способа определения ангиотензина II методом инверсионной вольтамперометрии.

Поставленная цель достигается техническим решением, представляющим собой определение ангиотензина II методом инверсионной вольтамперометрии на приборе ТА-2 путем регистрации поляризационных кривых с предварительным электрохимическим концентрированием вещества на поверхности электрода. Для этого через раствор пропускают азот с содержанием кислорода менее 0,001%, и, не прекращая перемешивания, проводят электролиз раствора при потенциале (-1,5) В в течение 330 с. В качестве рабочего используют стеклографитовый электрод. Затем регистрацию поляризационных кривых проводят при линейной скорости развертки потенциала 300 мВ/с. Концентрацию ангиотензина II определяют по высоте пика в интервале потенциалов от 0,3 В до 0,5 В, относительно хлорсеребряного электрода. Определение проводят на фоне 0,01 моль/л раствора аммония гидрофосфата двузамещенного с добавлением 5 моль/л раствора винной кислоты до рН 3,0.

Новым в способе является то, что проводят предварительное электрохимическое накопление ангиотензина II при потенциале электролиза, равном (-1,5) В, на приборе ТА-2. В качестве рабочего электрода используют стекло-графитовый электрод. Регистрацию поляризационных кривых проводят при скорости развертки потенциала 300 мВ/с, а концентрацию ангиотензина II определяют по высоте пика в интервале потенциалов от 0,3 В до 0,5 В относительно хлорсеребряного электрода на фоне 0,01 моль/л раствора аммония гидрофосфата двузамещенного с добавлением 5 моль/л раствора винной кислоты до рН, равного 3,0.

Отличительные признаки проявили в заявляемой совокупности новые свойства: увеличение чувствительности (10^-4-10^-6 мг/л) и экспрессности анализа.

С учетом изложенного следует считать заявляемое решение соответствующим критерию \существенные отличия\.

Все условия определения ангиотензина II подобраны экспериментально. Приготовление фоновых и стандартных растворов органического вещества в воде являются общепринятыми.

В процессе поиска оптимальных условий инверсионного вольтамперометрического определения ангиотензина II было изучено влияние ряда факторов (индикаторный электрод, фоновый электролит, его концентрация и рН, время и потенциал электролиза, границы и скорость развертки потенциала) на высоту аналитического сигнала (табл.1-3).

В качестве фоновых электролитов были исследованы растворы аммония нитрата, натрия гидрофосфата, калия хлорида, лития хлорида, натрия гидрокарбоната, кальция карбоната с добавлением разведенной серной, хлористоводородной и винной кислот. Исходя из полученных результатов, в качестве фонового электролита был выбран раствор аммония гидрофосфата двузамещенного, так как на нем наблюдалась четкая волна окисления ангиотензина II, кроме того, данный раствор обеспечивал хорошую электропроводность, широкую рабочую область и необходимую площадь для обработки сигнала, был прост в приготовлении, к преимуществам также можно отнести продолжительный срок годности.

Оптимальная концентрация раствора аммония гидрофосфата двузамещенного составила 0,01 моль/л. В более концентрированных растворах мы не наблюдали прироста от добавки при наличии большого остаточного тока, тогда как более разбавленный раствор был неустойчив во времени.

В предлагаемом способе в качестве индикаторного электрода использовали стекло-графитовый. Преимуществом такого электрода является возможность получения более узких и высоких пиков, служащих аналитической характеристикой определяемого вещества. Что повышает разрешающую способность метода. Ангиотензин II легко адсорбируется на рабочей поверхности стеклографита, это позволяет концентрировать его на электроактивном электроде.

Оптимальные значение рН фонового электролита составило 3,0. В щелочной среде в подобранных условиях сигнал ангиотензина II отсутствовал, тогда как в нейтральной - был слабо выражен, при изменении рН в более кислую сторону (менее 3,0) сужалась рабочая область электрода, при этом невозможно было зафиксировать пик ангиотензина II. Оптимальным подкисляющим агентом была выбрана винная кислота, так как серная загрязняла фоновую линию, а на хлороводородной мы не наблюдали воспроизводимисти результатов.

Оптимальное время накопления составило 330 с, при этом достигается максимальное значение величины тока растворения накопленных осадков с поверхности стеклографитового электрода и хорошая воспроизводимость для количественного определения исследуемого вещества. При времени электролиза более 330 с происходит насыщение осадка на электроде, аналитический сигнал ангиотензина II незначительно возрастает, но при этом искажается, образуя волну с нечеткими границами, тем самым затрудняя обработку полярограмм. При времени электролиза менее 330 с величина тока растворения не достигает максимального значения, что снижает чувствительность определения пептида (табл.1).

Другим отличительным признаком являются установленные условия электрохимического накопления. Оптимальный потенциал электролиза составил (-1,5) В. В прототипе диапазон потенциалов электролиза соответствует (-1,80)-(-1,75) В, который не позволяет накапливать ангиотензин II на индикаторном электроде. При значениях потенциала электролиза менее (-1,5) В величина регистрируемого анодного тока значительно уменьшается, что снижает чувствительность определения, а при значениях потенциала электролиза более (-1,5) В происходит частичное накопление осадка (табл.2).

Важным для определения ангиотензина II инверсионным вольтамперометрическим методом является выбор скорости развертки потенциала. Оптимально экспериментально установленной является 300 мВ/с. Изменение скорости развертки потенциала в сторону уменьшения заметно понижало высоту аналитического сигнала, при этом уменьшалась и разрешающая способность метода, что затрудняло обработку полярограмм, увеличивало время анализа и не позволяло определять очень низкие концентрации ангиотензина II, тогда как увеличение скорости развертки потенциала с одновременным возрастанием сигнала заметно искажало пик, который раздваивался, при этом исчезала четкость в определении его границ (табл.3).

Пример 1. Определение ангиотензина II методом инверсионной вольтамперометрии в растворе.

В кварцевый стаканчик емкостью 20 мл наливают 10 мл 0,01 моль/л раствора аммония гидрофосфата двузамещенного, добавляют 5 моль/л раствор винной кислоты до рН 3,0. При потенциале (-1,5) В раствор деаэрируют азотом с содержанием кислорода менее 0,001% в течение 30 с и, не прекращая перемешивания, проводят электролиз при потенциале (-1,5) В в течение 330 с. Отключают газ и фиксируют вольтамперограмму при скорости развертки потенциала 300 мВ/с. Отсутствие пиков свидетельствует о чистоте фона.

Затем добавляют N капель объемом 0,01 мл стандартного раствора ангиотензина II 10^-5 мг/л, перемешивают раствор и проводят электрохимическое концентрирование вещества при потенциале (-1,5) В в течение 330 с. Отключают газ и фиксируют вольтамперограмму при скорости развертки потенциала 300 мВ/с. Аналитический сигнал для указанной концентрации ангиотензина II регистрируют в диапазоне потенциалов от 0,3 В до 0,5 В.

Время единичного анализа ангиотензина II не превышает 15 мин, что соответствует требованию экпрессности. Осуществление изобретения позволяет определять в исследуемом растворе концентрацию ангиотензина II, соответствующую 0,01 пг/л, что заметно увеличивает чувствительность методики.

Установленные условия впервые позволили количественно определить ангиотензин II путем регистрации вольтамперных кривых при потенциале (-1,5) В на фоне 0,01 моль/л раствора аммония гидрофосфата двузамещенного с добавлением 5 моль/л раствора винной кислоты до рН, равного 3,0. Относительное стандартное отклонение (S) для диапазона концентраций 10^-4-10^-6 мг/л, соответствующих содержанию ангиотензина II в крови, не превышает 1,4 (табл.4).

Установленные экспериментальные условия определения ангиотензина II методом инверсионной вольтамперометрии позволяют с высокой чувствительностью и экспрессностью определить указанный пептид в водной и биологической средах, а также позволяют разработать методику определения содержания микроколичеств ангиотензина II в плазме и сыворотке крови.

Таблица 1
ВЛИЯНИЕ ВРЕМЕНИ ЭЛЕКТРОЛИЗА НА ВЫСОТУ АНАЛИТИЧЕСКОГО СИГНАЛА№ п/пКонцентрация раствора стандартного образца в электролитической ячейке, мг/лВремя электролиза, сВысота аналитического сигнала, мкА19,99·10^-9600,258±0,0072900,441±0,00631200,538±0,00541500,627±0,00451801,321±0,00262102,319±0,00172402,446±0,00682702,521±0,00293003,342±0,007103304,059±0,005113604,063±0,002123904,071±0,007134204,078±0,002144504,085±0,003154804,094±0,005165104,114±0,004Примечание: Потенциал электролиза - (-1,5) В;
границы развертки потенциала от (-1,5) до 0,6В;
скорость развертки потенциала 300 мВ/с.

Таблица 2
ВЛИЯНИЕ ПОТЕНЦИАЛА ЭЛЕКТРОЛИЗА НА ВЫСОТУ АНАЛИТИЧЕСКОГО СИГНАЛА№ п/пКонцентрация раствора стандартного образца в электролитической ячейке, мг/лПотенциал электролиза, ВВысота аналитического сигнала, мкА19,99·10^-9- 0,700,124±0,0302- 0,800,639±0,0043- 0,901,483±0,0064- 1,001,803±0,0025- 1,102,053±0,0056- 1,202,712±0,0037- 1,303,315±0,0068- 1,403,975±0,0029- 1,504,059±0,00510- 1,603,841±0,00311- 1,703,136±0,001Примечание: Время электролиза - 330 с;
границы развертки потенциала от (-1,5) до 0,6 В;
скорость развертки потенциала 300 мВ/с.

Таблица 3
ВЛИЯНИЕ СКОРОСТИ РАЗВЁРТКИ ПОТЕНЦИАЛА НА ВЫСОТУ АНАЛИТИЧЕСКОГО СИГНАЛА№ п/пКонцентрация раствора стандартного образца в электролитической ячейке, мг/лСкорость развертки потенциала, мВ/сВысота аналитического сигнала, мкА19,9960·10^-9500,592±0,01021001,106±0,00731501,724±0,00942002,264±0,00452503,567±0,00863004,059±0,00573504,087±0,001Примечание: Время электролиза - 330с;
потенциал электролиза - (-1,5)В;
границы развертки потенциала от (-1,5) до 0,6 В.

Таблица 4
МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ РАЗРАБОТАННОЙ МЕТОДИКИ (f, число степеней свободы, - 19; Р, доверительная вероятность, - 95%; t (P; S), критерий Стьюдента (табл.), - 2,09)№ п/пИстинное значение измеряемой величины, мг/л μСредние выборки, Дисперсия, S²·10^-12Стандартное отклонение, S·10^-6Полуширина доверительного интервала, величина, ΔX·10^-6Относительная погрешность отдельной варианты, ε, %Относительная погрешность среднего результата, , %11·10^-41,000053,91421,97844,13494,130,8921·10^-50,099770,04840,22010,10294,611,0331·10^-60,009890,00810,02840,01336,001,34

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

1. Руководство по клинической лабораторной диагностике / Под ред. В.В.Меньшикова. - М.: Медицина, 1982. - 576 с.

2. Ивановская Е.А. Количественное определение дигоксина в сыворотке крови методом инверсионной вольтамперометрии // Патент РФ №21322553.

Изобретение относится к области аналитической химии, в частности к инверсионно-вольтамперометрическому способу определения пептида ангиотензина II (Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe), и может быть использовано в дифференциальной диагностике гипертонической болезни. Способ определения ангиотензина II характеризуется тем, что в 0,01 моль/л раствора аммония гидрофосфата двузамещенного добавляют 5 моль/л раствора винной кислоты до рН, равного 3,0, при потенциале (-1,5) В раствор деаэрируют азотом с содержанием кислорода менее 0,001% в течение 30 с, и проводят электролиз при потенциале (-1,5) В в течение 330 с, отключают газ, фиксируют вольтамперограмму при скорости развертки потенциала 300 мВ/с, добавляют стандартный раствор ангиотензина II, перемешивают и проводят электрохимическое концентрирование на стеклографитовом электроде при потенциале (-1,5) В в течение 330 с, отключают газ, фиксируют вольтамперограмму при скорости развертки потенциала 300 мВ/с и регистрируют аналитический сигнал концентрации ангиотензина II в диапазоне потенциалов 0,3-0,5 В относительно хлорсеребряного электрода. Технический результат - увеличение чувствительности и экспрессности способа. 4 табл.

Способ определения ангиотензина II, характеризующийся тем, что в 0,01 моль/л раствор аммония гидрофосфата двузамещенного добавляют 5 моль/л раствор винной кислоты до рН 3,0, при потенциале (-1,5) В раствор деаэрируют азотом с содержанием кислорода менее 0,001% в течение 30 с и проводят электролиз при потенциале (-1,5) В в течение 330 с, отключают газ, фиксируют вольтамперограмму при скорости развертки потенциала 300 мВ/с, добавляют стандартный раствор ангиотензина II, перемешивают и проводят электрохимическое концентрирование на стеклографитовом электроде при потенциале (-1,5) В в течение 330 с, отключают газ, фиксируют вольтамперограмму при скорости развертки потенциала 300 мВ/с и регистрируют аналитический сигнал концентрации ангиотензина II в диапазоне потенциалов 0,3-0,5 В относительно хлорсеребряного электрода.