СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОСТАВА ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫ Российский патент 1999 года по МПК G01N33/52 

Изобретение относится к медицине, в частности к фармации, и может быть использовано для качественного и количественного определения состава лекарственных смесей, содержащих витамины, в условиях контрольно-аналитических лабораторий как складского, так и заводского типов.

В настоящее время на отечественном фармацевтическом рынке появилось многообразие зарубежных поливитаминных лекарственных форм: "Юникап", "Пиковит-пастилки", "Таксовит", "Лековит", "Витамульт" и др. В связи с этим возникла необходимость в разработке методик для того, чтобы обеспечить контроль за их качеством. Для этого предложен способ определения состава лекарственной смеси путем разделения и одновременного определения водорастворимых витаминов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на милихроме в таблетках "Пиковит-пастилки", состоящей из витаминов A, D, C, B₁₂, B₁, B₂, B₃, B_c, B₆, PP.

Известны способы определения состава лекарственной смеси путем ВЭЖХ (НТД N 42-5975-95). Однако известные способы применимы только для работы на зарубежных приборах, что сужает их применимость. Например, из методики, предложенной для анализа поливитаминных таблеток "Юникап М", видно, что для определения одних витаминов используют различные условия разделения методом ВЭЖХ, а для других, в частности для витамина C, - химический метод определения (см. табл. 1).

Из табл. 1 видно, что предложенная методика малоинформативна, т.к. не дает единого подхода для одновременного определения витаминов в анализируемой пробе.

Известны способы определения состава лекарственных форм: таблеток "Гексавит" (ФС 42-1357-93) и драже "Ревит" (ФС 42-1676-95) путем метода ВЭЖХ, где используют прибор - милихром различной модификации. Условия хроматографического разделения и определения витаминов следующие: в качестве подвижной фазы используют "Силасорб С18", а в качестве подвижной фазы используют 30%-ный метанол или 20%-ный метанол соответственно в смеси с гексилсульфонатом натрия и гептилсульфонатом натрия, доведенного до pH 2,8 с помощью ледяной уксусной кислоты.

Известная методика вполне приемлема для разделения и одновременного определения витаминов, но из-за отсутствия таких реагентов, как гексилсульфонат натрия и гептилсульфонат натрия, не находит широкого применения в практике.

Наиболее близким к предлагаемому является способ определения состава лекарственной формы по НТД N 42-1543-92, который позволяет идентифицировать витамины A, C, B₂, B₃, B₆ методом хроматографии в тонком слое сорбента и количественно определять содержание витамина C, фосфора и кальция спектрофотометрическим методом в видимой области при 570, 750 и 422,7 нм соответственно после получения окрашенного соединения. Известный способ позволяет определять количественно только три компонента из двенадцати, перечисленных в составе одной пастилке. Условия для развития хроматографии по методике НТД N 42-1543-92 см. в табл. 2.

Из табл. 2 видно, что анализ лекарственной формы "Пиковит-пастилки" не дает полной информации о количественном содержании витаминов (за исключением витамина C). Кроме того, известный способ трудоемок и требует много времени для его выполнения.

Положительным результатом заявляемого способа является повышение информативности, снижение трудоемкости и сокращение времени определения. Положительный результат достигается тем, что определение состава лекарственной формы, содержащей витамины, осуществляют методом ВЭЖХ, причем хроматографирование проводят на "Лихросорбе RP-18" в градиентном режиме с использованием метанола в фосфатном буфере при pH 7 в следующих соотношениях: 3%-ный метанол - 1000 мкл, из которых 200 мкл идут на регенерацию колонки, затем 10, 30 и 40% по 400 мкл. Все водорастворимые витамины определяют при 260 нм, только кальция пантотенат (витамин B₃) при 210 нм. Последовательность выхода пиков витаминов из колонки составляет: для кислоты аскорбиновой (витамин C) = 1,33 мин, для кальция пантотената (витамина B₃) = 2,17 мин, пиридоксина гидрохлорида (витамина B₆ = 7,67 мин, никотинамида (витамина PP) = 10,78 мин, тиамина гидрохлорида (витамина B₁) = 17,67 мин, рибофлавина (витамина B₂) = 19,33 мин.

Для иллюстрации способа автор проводит определение витаминов в лекарственной форме "Пиковит-пастилки". Предлагаемый способ включает следующие этапы.

I. Приготовление анализируемой пробы:
- определяют средний вес одной пастилки из 20, в нашем случае он был = 1,21005 г;
- около 0,9768 г (точная навеска) растертых пастилок из десяти помещают в пенициллинку вместимостью 20 мл, добавляют 10 мл фосфатного буфера с pH 7 и 10 мл хлороформа, хорошо взбалтывают и помещают на водяную баню и нагревают при температуре 60^oC в течение 20 мин, затем охлаждают и центрифугируют на лабораторной центрифуге или можно на любой в течение 10 мин при 2000 об/мин. На анализ отбирают 10 мкл водной фазы.

II. Подготовка внешнего стандарта (модельной смеси) к анализу.

Готовят данную смесь путем смешивания стандартных растворов витаминов: C, B₃, B₆, B₁, B₂, PP:
а) для приготовления 1%-ного стандартного раствора аскорбиновой кислоты (витамина C) берут 1,0000 г (точная навеска) и помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят фосфатным буферным раствором с pH 7 до метки, раствор перемешивают и используют для приготовления модельной смеси. Расчет необходимого объема стандартного раствора витамина C для модельной смеси проводят следующим образом:
1,21005 - 10 мг вит.C
0,9768 - x
x = 8,0724 мг, или 8072,4 мкг
8072,4 мкг - 10000 мкл
x - 10 мкл
x = 8,072 мкг
10 мкг вит.C - 1 мкл 1%-ного стандартного раствора
8,072 мкг - x
x = 0,807 мкл 1%-ного стандартного раствора
В модельную смесь берется 0,81 мл 1%-ного стандартного раствора витамина C;
б) для приготовления 0,1%-ного стандартного раствора тиамина гидрохлорида (витамина B₁) берут 0,1000 г (точная навеска) витамина B₁ и помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят фосфатным буферным раствором с pH 7 до метки, раствор перемешивают и используют для приготовления модельной смеси. Расчет необходимого объема стандартного раствора витамина B₁ для модельной смеси проводят следующим образом:
1,21005 г - 0,25 мг вит. B₁
0,9768 г - x
x = 0,202 мг, или 202 мкг
202 мкг - 10000 мкл
x - 10 мкл
x = 0,202 мкг
1 мкг вит. B₁ - 1 мкл 0,1%-ного стандартного раствора
0,202 кг вит. B₁ - x
x = 0,2 мкг 0,1%-ного стандартного раствора вит. B₁
В модельную смесь берется 0,2 мл 0,1%-ного стандартного раствора витамина B₁;
в) для приготовления 0,02%-ного стандартного раствора рибофлавина (витамина B₂) берут 0,0200 г (точная навеска) витамина B₂, переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят фосфатным буферным раствором с pH 7 до метки и перемешивают. Этот раствор используют для приготовления модельной смеси.

Расчет необходимого объема 0,02%-ного стандартного раствора рибофлавина для приготовления модельной смеси проводят следующим образом:
1,21005 - 0,3 мг вит. B₂
0,9768 - x
x = 242,17 мкг
242,17 мкг - 10000 мкл
x - 10 мкл
x = 0,242 мкг
0,2 мкг - в 1 мкл 0,02%-ного стандартного раствора
0,242 мкг - x
x = 1,2 мкл, или же 1,2 мл 0,02%-ного стандартного раствора рибофлавина;
г) для приготовления 0,1%-ного стандартного раствора кальция пантотената (витамин B₃) берут 0,1000 г (точная навеска) вит. B₃ и помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят фосфатным буферным раствором с pH 7 до метки. Раствор перемешивают и используют для приготовления модельной смеси. Расчет необходимого объема 0,1%-ного стандартного раствора витамина B₃ для модельной смеси проводят следующим образом:
1,21005 г - 1200 мкг вит. B₃
0,9786 г - x
x = 968,69 мкг
968,69 мкг - 10000 мкл
x - 0,9687 мкл
1 мкг - в 1 мкл 0,1%-ного стандартного раствора вит.B₃
0,9687 мкг - x
x = 0,97 мкл 0,1%-ного стандартного раствора вит. B₃
В модельную смесь берется 0,97 мл 0,1%-ного стандартного раствора витамина B₃;
д) для приготовления 0,1%-ного стандартного раствора пиридоксина гидрохлорида (витамина B₆) берут 0,1000 г (точная навеска) препарата и помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят фосфатным буферным раствором с pH 7 до метки, раствор перемешивают и используют для приготовления модельной смеси. Расчет для приготовления необходимого объема 0,1%-ного стандартного раствора пиридоксина гидрохлорида для модельной смеси проводят следующим образом:
1,21005 г - 300 мкг вит. B₆
0,9768 г - x
x = 242,17 мкг
242,17 мкг - 10000 мкл
x - 10 мкл
x = 0,242 мкг
1 мкг - в 1 мкл 0,1%-ного стандартного раствора вит.B₆
0,242 мкг - x
x - 0,242 мкл, или же 0,24 мл 0,1%-ного стандартного раствора пиридоксина гидрохлорида.

В модельную смесь берется 0,24 мл 0,1%-ного стандартного раствора пиридоксина гидрохлорида;
ж) для приготовления 0,1%-ного стандартного раствора никотинамида (витамина PP) берут 0,1000 г (точная навеска) препарата и помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят фосфатным буферным раствором с pH 7 до метки, раствор перемешивают и используют для приготовления модельной смеси. Расчет необходимого объема 0,1%-ного стандартного раствора никотинамида (витамина PP) для модельной смеси проводят следующим образом:
1,21005 г - 3000 мкг вит. PP
0,9768 г - x
x = 2421,72 мкг
2421,72 мкг - 10000 мкл
x - 10 мкл
x = 2,42
1 мкг - в 1 мкл 0,1%-ного стандартного раствора
2,42 мкг - x
x - 2,42 мкл 0,1%-ного стандартного раствора витамина PP
В модельную смесь берется 2,42 мкл 0,1%-ного стандартного раствора витамина PP.

III. Приготовление фосфатного буферного раствора с pH 7:
1,3600 г (точная навеска) дигидрофосфата калия помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят дистиллированной водой до метки. Из полученного раствора путем разбавления в 10 раз был приготовлен 0,01 М раствор дигидрофосфата калия (раствор A);
2,2000 г (точная навеска) гидрофосфата калия помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в дистиллированной воде и доводят этой же водой до метки. Из этого раствора путем разведения в 10 раз был получен 0,01 М раствор гидрофосфата калия (раствор B);
для приготовления фосфатного буферного раствора с pH=7 смешивали равные объемы растворов А и Б. Полученный раствор был использован для приготовления элюентов и растворения образцов для анализа.

IV. Приготовление элюентов.

Для приготовления элюентов различной концентрации: 3, 10, 30, 40% используют 100%-ный метанол с высокой степенью очистки и разводят его фосфатным буферным раствором с pH 7. Полученные растворы хорошо взбалтывают и центрифугируют в течение 10 мин при 2000 об/мин (на любой центрифуге). Готовые растворы используют для работы в градиентном режиме.

Условия хроматографирования.

Жидкостной микроколоночный хроматограф "Милихром" (любой модификации), снабженный спектрофотометрическим детектором с переменной длиной волны. Колонка размером 62х2 мм, заполненная сорбентом - лихросорбом RP-18 с размером частиц 5 мкм. Элюент-смесь метанола (от 3 до 40%) с фосфатным буферным раствором с pH 7. Объемная скорость элюента 100 мкл в 1 мин. Температура комнатная. Объем вводимой анализируемой пробы 10 мкл, а модельной смеси 5,84 мкл. Детектирование осуществлялось по поглощению в УФ-области спектра при 210 нм для кальция пантотената (вит.B₆) и при 260 нм для остальных водорастворимых витаминов: C, B₁, B₂, B₆, PP с переключением шкалы чувствительности на детектор (А) для выбора оптимального масштаба предоставления информации на самописец: для витамина C - A = 12,8, для вит. PP - AA = 0,8, для витаминов B₁, B₃, B₆ - A = 0,2, для витамина B₂ - A = 0,4.

После установления равновесия в хроматографической колонке (устойчивая базовая линия) поочередно хроматографируют внешний стандарт (модельную смесь) и анализируемые образцы не менее трех раз каждый. Время выхода одной хроматограммы составляет 20 мин. Последовательность выхода пиков витаминов на хроматограмме: C, B₃, B₆, PP, B₁, B₂ с временами удерживания порядка 2,0; 2,7; 7,3; 9,3; 16,0; 18,0 мин соответственно.

Количественное определение водорастворимых витаминов в лекарственной форме "Пиковит-пастилки" проводили методом внешнего стандарта в качестве которых использовали модельную смесь витаминов фармакопейной степени чистоты: C, B₃, B₆, B₁, В₂, PP в соотношениях, соответствующих их содержанию в прописи. Хроматографирование модельной смеси и анализируемой пробы проводили не менее трех раз. Результаты представлены в табл. 3. Содержание водорастворимых витаминов рассчитывали по формуле:

где C_исс. - концентрация витамина в исследуемой пробе, мкг;
C_ст. - концентрация витамина в модельной смеси, мкг;
P_ср. - средняя масса одной пастилки, г;
q - масса растертых пастилок, взятая для анализа, г;
V - объем исследуемой пробы, мкл;
a - объем исследуемой пробы, взятой для анализа, мкл.

Средние ошибки определений для аскорбиновой кислоты (витамина C) составили 3,49%, для кальция пантотената (витамина B₃) 12,50%, для пиридоксина гидрохлорида (витамина B₆) 4,41%, для тиамина гидрохлорида (B₁) 14,01%, для рибофлавина (вит. В₂) 11,30% и для никотинамида (вит. PP) 9,17%.

Автором разработан способ определения состава лекарственной формы "Пиковит-пастилки", содержащей витамины: C, B₁, В₂, В₃, B₆, PP методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Разработанная методика является высокочувствительной, специфичной и не требует предварительного разделения и значительно сокращает время анализа.

Способ может быть использован в медицине, в частности в фармации. Разделение проводят методом высокоэффективной жидкостной хроматографии при комнатной температуре в градиентном режиме с использованием метанола в фосфатном буфере при рН 7 в следующих соотношениях: 3%-ный метанол - 1000 мкл, из которых 200 мкл идет на регенерацию колонки, затем 10, 30 и 40% по 400 мкл с последующим определением водорастворимых витаминов при 260 нм, а кальция пантотената при 210 нм не менее трех раз. Способ позволяет повысить информативность, упростить и сократить время анализа. 3 табл.

Способ определения состава лекарственной формы, заключающийся в разделении смеси хроматографическим путем, отличающийся тем, что разделение проводят методом высокоэффективной жидкостной хроматографии при комнатной температуре в градиентном режиме с использованием метанола в фосфатном буфере при pH 7 в следующих соотношениях: 3%-ный метанол - 1000 мкл, из которых 200 мкл идет на регенерацию колонки, затем 10, 30 и 40% по 400 мкл с последующим определением водорастворимых витаминов при 260 нм, а кальция пантотенат при 210 нм не менее трех раз.