Изобретение относится к медицинской радиобиологии и может быть использовано для создания препаратов, обладающих эффективным терапевтическим действием для лечения облученных млекопитающих.
Известно, что препараты, приготовленные из экстракта селезенки, взятой от мышей, показали определенное влияние на выживаемость облученных животных, причем получен противолучевой эффект, выражающийся в увеличении выживаемости леченных облученных животных на 20 - 40% по сравнению с нелеченными. (См., например, ст. "Влияние экстракта селезенки на облученных животных". авт.: О. И.Олонцева и др., ж. "Радиобиология", 1977, т. XVII, вып. 4, стр. 536-540).
Наилучшие результаты были получены при использовании очищенного экстракта селезенки, взятой от мышей 3 - 4-недельного возраста. Биологическую активность экстракта и 1-ой фракции из него оценивали по выживаемости мышей, облученных γ-лучами 60Co с мощностью 0,097 - 0,106 Гр/мин в дозах 7,9-8,3 Гр. Препарат вводили через 60 мин после воздействия радиации в количестве 5-6 мг белка первичного экстракта или 2,0 - 2,4 мг белка очищенного экстракта на мышь. (См. ст. "Влияние очищенного селезеночного экстракта на выживаемость облученных мышей", авт. О.И.Олонцева и др., ж. "Радиобиология", 1980, т. XX, вып. 6, с. 877-880).
Однако в связи с невысокой радиорезистентностью мышей для получения устойчивого терапевтического воздействия необходимо введение значительного количества полученного средства (до 6 мг белка).
Задачей настоящего изобретения является создание средства для лечения облученных млекопитающих, обладающего эффективным лечебным действием при сокращении дозы введения в 10-30 раз.
Эта задача достигается тем что для получения средства для лечения облученных млекопитающих из экстракта кроветворных органов, в данном случае - печени черепахи Testudo horsfieldi, выделяются очищенные белковые фракции.
Наибольшей антирадиационной активностью обладают фракции с молекулярным весом: в первом разделении - от 48 - 80 кДа, во второй и третьем - около 2 кДа.
Экстракт печени черепахи готовят по методу Ellinger (Ellinger F., Proc. Soc. ExpH. , Biol and Med., 1956, v.92, N 4, p.670 - 673). Для отделения протеинсодержащих фракций экстракт подвергают очистке и фракционированному разделению методом гель-фильтрации. После 1-го разделения на сефадексе G-150 получают три протеинсодержащие фракции A1, A2, A3, из которых фракция A3 с молекулярным весом 48-80 кДа обладает наибольшей антирадиационной активностью. После разделения этой фракции методом гель-фильтрации на ультрагеле AcA 202 получают новые фракции - X1, X2, X3, из которых X3 с молекулярным весом около 2 кДа наиболее активна. Разделение фракции X3 методом гель-фильтрации на сефадексе G-10 приводит к получению еще трех фракций B1, B2, B3, из которых фракция B1 не проявляет антирадиационной активности, а фракция B2 с молекулярным весом около 2,5 кДа проявляет наивысшую противорадиационную активность и выживаемость облученных животных при введении этой фракции приближается к показателям для необлученных животных.
Таким образом, выделенные из экстракта печени черепахи Testudo horsfieldi протеинсодержащие фракции A3, X3 и B2 можно использовать для лечения пораженных радиационным облучением млекопитающих. Введение предлагаемых веществ животным, подвергшимся радиационному облучению, способствует восстановлению гемопоэза и выживанию облученных в летательной дозе млекопитающих. Выживаемость облученных леченных животных при равных дозах и мощности облучения увеличивается в средней на 30-50% по сравнению с животными, которым вводится экстракт селезенки мышей, и на 50-90% по сравнению с нелеченными облученными животными. При этом в 50-300 раз уменьшается доза вводимых препаратов, что снижает общий расход дефицитных веществ. Благодаря уменьшению вводимой дозы устраняется риск нежелательных побочных действий от введения чужеродного белка.
Для получения препаратов печень выделяют, разрезают на кусочки, замораживают в жидком азоте и измельчают до порошкообразного состояния. Измельченную печень заливают физиологическим раствором (0,9% NaCl) из расчета 1 мл физ. р-ра на 170 мг сырой печени. Этот раствор затем выдерживают в течение 24 часов при 4oC. Далее раствор центрифугируют при 4400g в течение 30 мин. Супернатант собирают и пропускают через миллипоровый фильтр (0,4 мкм).
Гемоглобин, липиды и углеводы выделяются из экстракта по методу Куртиса (Curtis F. J., Biochim. Biophys. Acta, 1970, 211, p.575). Протеины осаждают смесью хлороформ-метанола (2:1). Затем их ресуспензируют с конечной концентрацией 2 мг/мл в 0,9% NaCl. К полученному раствору добавляют смесь хлороформа и метанола из расчета на 1 объем белка - 9 объемов смеси, выдерживают в течение 30 мин и затем подвергают центрифугированию при 10000g в течение 10 мин. Полученный преципитат отделяют и жидкость подвергают лиофильной сушке.
После лиофильной сушки экстракт представляет собой белый порошок с содержанием влаги 5 ±0,2%. Он обладает хорошей растворимостью в воде (без осадка); содержание белка 62 ±1,5% (определение по методу Lowry), содержание углеводов - 4,0 ± 0,2% (определено метолом Dubois).
Полученный субстрат подвергают гель-фильтрации в колонке 2,6 • 80 см с сефадексом G-150 (с использованием буфера 0,05 М Трис-HCl (pH 8,0) или 0,5 аммониево-ацетатного буфера (pH 8,0), скорость 32 мл/час, относительная концентрация белка определяется фотометрически - 280 nm).
Результаты этого разделения показаны на фиг. 1, где отчетливо видны три пика, обозначенные как A1, A2<A3. Фракция A3 имеет молекулярный вес от 48 до 80 кДа и обладает наибольшей антирадиационной активностью.
Далее фракцию A3 подвергают дальнейшему фракционированию гель-фильтрацией на колонке 2,6 • 80 см с ультрагелем AcA 202 (с использованием 0,1% муравьиной кислоты, скорость 20 мл/час, фотометрическая детекция при 280 nm, 2,0 Au). Результаты этого разделения показаны на фиг. 2, на которой видны три пика, обозначенные X1, X2<X3. X1 фракция с молекулярным весом около 22 кДа не проявляет видимой антирадиационной активности; X2-фракция имеет молекулярный вес около 5,6 кДа и проявляет некоторую антирадиационную активность; и фракция X3 с молекулярным весом около 2 кДа обладает наибольшей антирадиационной активностью.
Затем фракции X2 и X3 объединяют и подвергают дальнейшему разделению гель-фильтрацией на колонке 2,6 х 80 см с сефадексом g-10 (с использованием 0,1% муравьиной кислоты, скорость 18 мл/час, фотометрическая детекция при 280 nm, 2,0 Au). Результаты фракционирования показаны на фиг. 3, где можно видеть три фракции, обозначенные B1, B2, B3, из которых фракция B1 оказалась токсичной, а фракция B2 с молекулярным весом около 2 кДа обладает максимальной антирадиационной активностью.
Для исследования эффективности действия препарата проводилось облучение белых мышей весом 18-20 г гамма-лучами 60Co мощностью 0,68 Гр/мин при общей дозе от 8 до 9 Гр. Животные были разделены на группы, и через 2 часа после облучения одним группам мышей были введены следующие дозы препаратов: доза на одно животное в 0,3 мл физ. раствора: A1, A2, A3 - по 300 мкг белка; X1, X2, X3 - по 100 мкг белка; B2, B3 - по 100 мкг белка.
В качестве контроля одна группа животных была облучена и получила инъекцию только физ. р-ра (0,9% р-р NaCl по 0,3 мл на мышь), а другая группа животных не получила ни облучения, ни инъекции (интактные животные).
На 8 и 11 день после облучения были определены следующие параметры у подопытных животных.
1. Количество эндогенных колоний на селезенке.
Селезенка извлекается, выдерживается в течение 24 часов в растворе Карнуа. Затем образец помещается на фильтровальную бумагу и под стереоскопом подсчитывается количество колоний.
2. Митотическая активность костного мозга.
Выделяется бедренная кость, из нее экстрагируется костный мозг, делается мазок и окрашивается краской Гимза-Романовского. Количество митозов подсчитывается под микроскопом из расчета 1000 клеток.
3. Количество лейкоцитов.
Подсчитывается в камере Горяева под микроскопом.
4. Масса селезенки.
Селезенка выделяется, переносится на фильтровальную бумагу, взвешивается.
5. Количество клеток крови.
Подсчитывается на автоматическом счетчике клеток "PS-4" ("Пикоскаль", Венгрия).
6. 30-суточная выживаемость.
Определяется процентное отношение выживших в течение 30 суток животных (количество животных в группе до облучения - 100%).
В таблицах 1-3 приведены результаты исследований.
Результаты, представленные в таблице 1, показывают, что из полученных после 1-го разделения фракций - A3 обладает наибольшей антирадиационной активностью. Дальнейшее разделение фракции A3 приводит к получению фракции B2, которая проявляет экстремально высокую антирадиационную активность, приближающуюся к значениям для необлученных животных.
Изобретение относится к медицинской радиобиологии и может быть использовано для лечения подвергшихся радиационному поражению млекопитающих. Средство для лечения облученных млекопитающих представляет собой очищенные белковые фракции, выделенные гель-фильтрацией из экстракта печени черепахи Testudo horsfieldi и имеющие молекулярный вес в пределах 48-80 и 2,5 кДа. Предлагаемое средство увеличивает выживаемость млекопитающих при значительном уменьшении вводимой дозы. 2 з.п. ф-лы, 3 ил., 3 табл.
| Радиобиология, 1980, т | |||
| ХХ, вып.6, с.877-880. |
