ДИНАТРИЕВАЯ СОЛЬ N-АЦЕТИЛ-L-АСПАРАГИНОВОЙ КИСЛОТЫ, ОБЛАДАЮЩАЯ АНТИДЕПРЕССАНТНОЙ И НООТРОПНОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 1999 года по МПК C07C229/24 A61K31/195 

Изобретение относится к области химии нейроактивных аминокислот и их производных, в частности, к динатриевой соли N-ацетил-L-аспарагиновой кислоты формулы

которая обладает выраженной антидепрессантной и ноотропной активностью, низкой токсичностью и может найти применение в медицине в качестве лекарственного вещества в лекарственных средствах для коррекции памяти при различных нервно-психических заболеваниях, например, при болезнях Альцгеймера и Хантингтона, дегенеративных поражениях головного мозга в старческом возрасте, а также в комплексной терапии алкоголизма.

Известно, что N-ацетил-L-аспарагиновая кислота (NAA) является естественным продуктом метаболизма нервной ткани, в значительных количествах содержится в центральной нервной системе и, предположительно, участвует в биосинтезе ацетилхолина и миелина в нейронах, а также способствует выделению возбуждающих аминокислот-нейромедиаторов [Trackenmiller M.Е., Namboodri N.А. , Brownstein N. J., Neclo J.H. N-Acetylation of L-aspartate in the nervous system: differential distribution of a specific enzyme // J. Neurochem. - 1985. - Vol. 45. - P. 1658 - 1662]. Содержание NAA в норме составляет во фронтальном лобном белом веществе головного мозга 16,6±3,3 мкмоль/г (или 2,9±0,6 г/кг сырого вещества мозга), в таламусе 17,2±1,3 мкмоль/г (3,0±0,2 г/кг) [Barker P.B., Soher B.J., Blackband S.J., Chatham J.C., Mathews V.P., Bryan R. N. Quantitation of proton NMR spectra of the human brain using tissue water as an internal concentration reference // NMR Biomed. - 1993. - Vol. 6. -P. 89 - 94].

Многие патологические состояния ЦНС сопровождаются существенным снижением содержания NAA. Например, при интракраниальных опухолях мозга уровень NAA в лобном белом веществе понижается до 11,4±1,4 мкмоль/г (2,0±0,2 г/кг), то есть на 31% [Manton D.J., Lowry M., Blackband S.J., Horsman A. Determination of proton matabolite concentrations and relaxation parametres in normal human brain and intracranial tumours NMR Biomed. - 1995. - Vol. 8. - P. 104-112] . При болезни Альцгеймера отмечено уменьшение содержания NAA в гиппокампе в среднем на 38%, а в миндалевидном теле - на 28% [Jaarsma D., Veenma D.L., Korf J. N-acetylaspartate and N-acetylaspartylglutanate levels in Alzheimer's diseases post-mortem brain tissue // J. Neurol. Sci. - 1994. - Vol. 127. -P. 230 - 233]. Еще более значительное понижение концентрации NAA отмечено при болезни Хантингтона - на 55% в коре головного мозга и на 25% в церебральном кортексе [Dunlop D.S., Mc Hale D.M., Lajtha A. Decreased brain N-acetylaspartate in Huntington's disease // Brain Res. - 1992. - Vol. 580. - P. 44 - 48]. Обнаружено, что содержание NAA существенно понижается и при черепно-мозговой травме [Промыслов М.Ш. Обмен веществ в мозге и его регуляция при черепно-мозговой травме. M.: Медицина, 1984. -С. 50- 66].

Нами впервые было показано, что рацемическая N-ацетил-DL-аспарагиновая кислота в виде динатриевой соли при внутрибрюшинном введении белым мышам и крысам в дозах 1-50 мг/кг оказывает выраженное антидепрессантное и ноотропное действие, а при повышении дозы до 100 мг/кг проявляет психостимулирующие свойства [Патент РФ N 2051672, опубл. 10.01.96, Бюл. N 1. МКИ⁶ A 61 K 31/195. Ковалев Г.В., Рахимов А.И., Сажин В.А., Озеров А.А., Яницкая А.В., Петров В.И. Средство, обладающее антидепрессантной и ноотропной активностью] . Однако N-ацетил-DL-аспарагиновая кислота содержит в своем составе 50% балластного компонента, имеющего D-конфигурацию, который не проявляет психотропной активности и приводит к необходимости увеличения дозы используемого препарата.

Целью настоящего изобретения является разработка нового малотоксичного психотропного лекарственного средства, обладающего повышенной антидепрессантной и ноотропной активностью.

Сущность изобретения заключается в использовании динатриевой соли N-ацетил-L-аспарагиновой кислоты в качестве психотропного средства, обладающего антидепрессантной и ноотропной (антиамнестической) активностью.

Существенным отличием использования оптически чистой динатриевой соли N-ацетил-L-аспарагиновой кислоты от предложенного ранее рацемического аналога, имеющего DL-конфигурацию, является отсутствие в составе лекарственного средства N-ацетил-D- аспарагиновой кислоты, не являющейся носителем психотропных свойств и не оказывающей статистически значимого ноотропного или антидепрессантного действия. Увеличение в 2 раза содержания активного компонента, имеющего L-конфигурацию, в составе лекарственного средства позволяет существенно повысить уровень его психотропной активности и соответственно понизить дозу его введения, необходимую для достижения желаемого терапевтического эффекта. Кроме того, использование оптически чистой N-ацетил-L-аспарагиновой кислоты понижает вероятность возникновения побочных эффектов при клиническом использовании предлагаемого лекарственного средства, поскольку известно, что производные D-аспарагиновой кислоты, например, N-метил-D-аспартат (NMDA), оказывают отрицательное влияние на процессы памяти и обучения [Mondadori С., Weiskrantz L., Buerki М. NMDA receptor antagonists can anhance or impaire learning performance in animal // Exp. Brain Res. - 1989. - Vol. 75. P. 449 - 456].

Синтез динатриевой соли N-ацетил-L-аспарагиновой кислоты был осуществлен путем ацетилирования незамещенной L-аспарагиновой кислоты в водной среде уксусным ангидридом с последующим выделением и нейтрализацией едким натром или карбонатом натрия.

Пример 1. Динатриевая соль N-ацетил-L-аспарагиновой кислоты (лабораторный шифр Na₂-L-AcAsp). Суспензию 50,0 г (0,38 моль) L-аспарагиновой кислоты в 250 мл дистиллированной воды нагревают на кипящей водяной бане до температуры 95-97^oC (растворение аминокислоты неполное) и при интенсивном перемешивании добавляют 100,0 мл (1,06 моль) свежеперегнанного уксусного ангидрида с такой скоростью, чтобы поддерживать слабое кипение реакционной массы (15 - 20 мин). После полного растворения аминокислоты реакционную массу перемешивают в течение 2 ч при температуре 70 - 75^oC, отгоняют в вакууме смесь воды и уксусной кислоты, остаток растворителя удаляют в течение 1 ч при температуре 95 - 100^oC в вакууме при остаточном давлении 2 - 4 мм рт. ст. Полученную N-ацетил-L-аспарагиновую кислоту растворяют при нагревании в 200 - 250 мл дистиллированной воды, добавляют порциями 40,0 г (0,38 моль) безводного карбоната натрия и доводят pH раствора до 8,0 - 8,5 путем добавления 10%-ного раствора едкого натра. Добавляют 5,0 г активированного угля, перемешивают при комнатной температуре в течение 4 ч, фильтруют, упаривают в вакууме, остаток растворителя удаляют в течение 1 ч при температуре 95 - 100^oC в вакууме при остаточном давлении 2 - 4 мм рт. ст. и получают 85 - 86 г (95,5 - 96,5%) моногидрата динатриевой соли N-ацетил-L-аспарагиновой кислоты в виде гигроскопичного белого или светло-желтого хрупкого стекловидного вещества, T_разл. > 200^oC, [α]20D

Пример 2. Динатриевые соли N-ацетил-D- и N-ацетил-DL-аспарагиновой кислоты (лабораторные шифры Na₂-D-AcAsp и Na₂-DL-AcAsp), используемые в качестве препаратов сравнения, получают аналогично, исходя из 5,0 г (0,038 моль) соответствующей аминокислоты.

Изучение психотропной активности и токсических свойств динатриевой соли N-ацетил-L-аспарагиновой кислоты (Na₂-L-AcAsp) и препаратов сравнения проводили на белых беспородных крысах массой 150 - 200 г и мышах-самцах массой 18 - 22 г, полученных из питомника РАМН "Белый мох".

Оценка влияния соединений на спонтанную двигательную (СДА) и исследовательскую (ИА) активность животных проводилась на методике "открытого поля" [Хаунина Р. А. , Лапин И.П. Фенибут - новый транквилизатор // Хим.- фарм. журн. - 1976. - Вып. 12. - С. 125 - 127]. Транквилизирующие (антифобические) свойства веществ изучали на модели поднятого "плюс"-лабиринта [Pellow S., Chopin P. , File S.E. Validation of open:closed arm entries in an elevated plusmaze as a mezure of anxiety in the rat // J. Neurosci. Res. Method. - 1985. - Vol. 14. - p. 149 - 167]. Определение антидепрессантной активности соединений проводили по тесту "форсированного" плавания [Porsolt R.D., Anton G., Blavet N. Behavioural despair in rats: a new model sensitive to antidepressant treatments // Eur. J. Pharm. - 1978. - Vol. 47. -P. 379 - 391]. Изучение влияния веществ на формирование энграмм и когнитивную деятельность выполнено на моделях условной реакции пассивного избегания (УРПИ) [Bures J., Buresova О. Nootropic drugs // 21 Ann Czecoslovak. Psychopharmacolog. Meet. - 1979. -P. 7- 12] и условной реакции активного избегания (УРАИ) [Крауклис А. А. Саморегуляция высшей нервной деятельности. - Рига, Медицина, 1964. - 326 с.], оценивались также анальгетические и противосудорожные свойства веществ. Углубленное изучение антидепрессантной активности Na₂-L-AcAsp проводили на модели конкурентного избегания аверсивного раздражителя [Кампов-Полевой А. Б. Изучение особенностей формирования алкогольной мотивации у крыс // Фармакология экспериментального алкоголизма. Под. ред. Бурова Ю.В. - М., Медицина, 1982. - С. 130 - 135] в собственной модификации [Петров В.И., Григорьев И.А., Горбунов С.Г. Методика оценки зоосоциального поведения крыс в психофармакологии // Журн. эксп. клинич. фармакол. - 1996. -Т. 59.- Вып. 4. -С. 65 - 70].

В качестве препаратов сравнения при оценке психотропной активности веществ использовали пирацетам (Polfa) в дозе 400 мг/кг и имипрамин в дозе 10 мг/кг. Все препараты и исследуемые вещества вводились внутрибрюшинно за 1 ч до проведения экспериментов. В отдельной серии экспериментов исследовали нейротропную активность Na₂-L-AcAsp в условиях in vivo. Влияние Na₂-L-AcAsp на функциональную активность катехоламинергических систем мозга изучали на моделях фенаминовой стереотипии и апоморфиновой гипотермии [Самойлов М.О. Базисные молекулярно-клеточные механизмы адаптивных реакций мозга // Физиол. журн. - 1995. -Т. 81.- Вып. 8.-С. 3 - 11]. Оценка холинергических свойств Na₂-L-AcAsp проводилась на модели ареколин-индуцированного тремора, серотонин-позитивная активность соединения оценивалась по его влиянию на динамику развития и выраженность "кивательного" синдрома у мышей, вызванного введением 5-окситриптофана (200 мг/кг) [Жарковский А.М., Аликмейтис Л.Х., Нехилаке Л. Место фенибута среди психотропных препаратов // Механизм действия и клиника производных гамма-аминомасляной кислоты: Труды по медицине Тартусского гос. ун-та. - 1988. -Вып. 687. - С. 102 - 103]. Исследовали также противосудорожное действие Na₂-L-AcAsp на модели судорог, вызванных введением пикротоксина (3 мг/кг) и влияние соединения на общеугнетающий эффект гексенала [Раевский К. С. Фармакология нейролептиков. М., Медицина, 1976. -271 с.].

Определение острой токсичности (ЛД₅₀) Na₂-L-AcAsp проводили на крысах при подкожном, внутримышечном, внутривенном и пероральном введении по методу Литчфилда и Вилкоксона [Беленький М.Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта. - Л., Наука, 1963. - 152 с.]. Изучение кумулирующих свойств Na₂-L-AcAsp проводили по методу Когана и Станкевича [Коган Ю.С. Общая токсикология пестицидов. - Киев, Здоровье, 1981. - 280 с.], биохимические показатели крови определяли на основании рекомендаций [Саноцкий В.В. Методы определения токсичности и опасности химических веществ (токсикометрия). - М., Медицина, 1970. - 211 с.]. Влияние Na₂-L-AcAsp на репродуктивную функцию животных оценивали на основании комплексного подхода, включающего определение функциональной активности зрелых сперматозоидов, оценку морфоструктуры гонад, способности самцов к полноценному оплодотворению, анализ плодного материала на возможное наличие тератогенного эффекта, характеристику полового поведения животных [Методические указания по изучению эмбриотоксического действия фармакологических веществ и влияния их на репродуктивную функцию // Сост. Дыбан А.П., Пучков В.Ф., Торчинский А.М. и др. - М. , 1986. - 24 с.]. Мутагенные свойства Na₂-L-AcAsp изучали в тесте Эймса в модификации с преинкубацией на штаммах бактерий сальмонелла тифимуриум [Maron D. M., Ames B.N. Revised method for the Salmonella mutagenicity test // Mutat. Res. -1987. - Vol. 113. -P. 173 - 213], по оценке цитогенетической активности на основе учета аберрации хромосом в клетках костного мозга мышей [Методические указания по изучению мутагенной активности химических веществ при обосновании их ПДК в воде // Сост. Журков B.C., Красовский Г. Н., Жолдакова З.И. и др. - М., 1986. - 41 с.], а также по наличию и выраженности доминантных летальных мутаций у плодовых мушек линии Drosophila melanogaster.

Результаты исследований статистически обрабатывались по методу Вилкоксона-Уитни-Манна.

При изучении поведения крыс на модели "открытого поля" было установлено, что соединение Na₂-L-AcAsp в дозе 50 мг/кг увеличивало двигательную, а в дозах 1, 10 и 50 мг/кг и исследовательскую активность животных. Увеличение под влиянием соединения в дозе 50 мг/кг актов короткого груминга можно расценивать как проявление анксиогенного действия вещества. При этом рацемический аналог - соединение Na₂-DL-AcAsp достоверно увеличивало исследовательскую активность крыс только в дозе 100 мг/кг (табл. 1).

Результаты изучения антидепрессантной активности соединений по тесту форсированного плавания представлены в табл. 2. Полученные данные отчетливо указывают на наличие у соединения Na₂-L-AcAsp в дозах 1 и 10 мг/кг (внутрибрюшинное введение) и 30 мг/кг (пероральное введение) антидепрессантных свойств. Соединение Na₂-L-AcAsp приводило к достоверному снижению времени иммобилизации в тесте форсированного плавания и увеличению количества попыток избегания аверсивной среды. При сравнительной оценке эффективности изучаемого вещества с рацемическим аналогом Na₂-DL-AcAsp и препаратом имипрамином установлено наличие у соединения Na₂-L-AcAsp более выраженных в сопоставимых по отношению к ЛД₅₀ дозах антидепрессантных свойств на использованной экспериментальной модели.

При изучении антидепрессантных свойств соединения Na₂-L-AcAsp на модели конкурентного избегания аверсивного раздражителя было установлено, что при обучении пары животных в условиях конкуренции за сухую площадку устанавливаются отношения доминирования и подчинения, что проявляется в снижении количества попыток сталкивания и особенно эффективности попыток сталкивания подчиненными животными животных, занимающих доминирующее положение. При введении на второй день эксперимента (воспроизведение) подчиненным животным соединения Na₂-L-AcAsp в дозе 10 мг/кг наблюдалось достоверное увеличение частоты попыток сталкивания доминирующего партнера при некотором увеличении эффективности сталкиваний. Полученные результаты свидетельствуют о сочетании у соединения Na₂-L-AcAsp психостимулирующей и антидепрессантной активности, что приводит к увеличению моторной активности животных (табл.3).

Результаты изучения транквилизирующих, анальгетических и противосудорожных свойств соединения Na₂-L-AcAsp свидетельствуют об отсутствии у данного вещества этих видов активности.

Данные по изучению антиамнестических свойств соединения Na₂-L-AcAsp на модели нарушения УРПИ представлены в табл.4. В ходе экспериментов установлено, что изучаемое соединение при однократном введении в дозе 50 мг/кг приводит к значительному увеличению латентного периода захода в темный отсек по сравнению с животными контрольной группы, что свидетельствует о наличии у вещества отчетливой антиамнестической активности. При этом препарат сравнения пирацетам оказывает равнозначный антиамнестический эффект только в дозе 400 мг/кг.

В отдельной серии экспериментов изучалось влияние соединения Na₂-L-AcAsp в сравнении с D- и DL-аналогами на динамику обучения животных навыку активного избегания аверсивного раздражителя (УРАИ) при внутрибрюшинном введении веществ в дозе 50 мг/кг за 1 ч до тестирования. В ходе эксперимента было установлено, что изучаемые соединения оказывают различное по выраженности психотропное действие. Наиболее выраженное ноотропное действие проявило соединение Na₂-L-AcAsp, превосходившее по эффективности рацемический DL-аналог. При изучении ноотропного действия D-стереоизомера динатриевой соли N-ацетиласпарагиновой кислоты не было выявлено различий в динамике обучения крыс по сравнению с контролем (табл. 5, фиг. 1). Результаты статистического анализа полученных результатов показали наличие достоверных межгрупповых отличий в динамике обучения животных УРАИ [F_A(9;353) = 23,7; p < 0,01. F_B(3; 353) = 6,4; p < 0,01]. Таким образом, сравнительная оценка фармакологического эффекта соединения Na₂-L-AcAsp с его D-стереоизомером и рацемической DL-формой подтвердила правильность выбора L-формы вещества как наиболее эффективной.

Результаты экспериментов по определению возможного механизма действия соединения Na₂-L-AcAsp по его влиянию на активность различных медиаторных систем мозга в условиях in vivo не выявило его моноамин- и холинергического действия. В то же время наблюдаемое изменение реакции животных на моделях пикротоксиновых судорог и клофелиновой гипотермии косвенно свидетельствует о модулирующей BAK-ергической активности соединения Na₂-L-AcAsp.

Данные по острой суточной токсичности соединения Na₂-L-AcAsp в сравнении с аналогами и эталонными препаратами представлены в табл.6 и 7. Соединение Na₂-L-AcAsp в опытах на белых мышах проявляет в 1,4 раза меньшую токсичность по сравнению с соответствующей DL-формой. Определение параметров острой токсичности соединения Na₂-L-AcAsp в опытах на крысах при внутривенном, подкожном, внутримышечном и пероральном введении позволяет отнести эти вещество к классу малотоксичных.

Изучение влияния соединения Na₂-L-AcAsp на репродуктивную функцию крыс не выявило его отрицательного влияния на воспроизведение потомства. Соединение Na₂-L-AcAsp при его субхроническом пероральном введении в дозах 50 мг/кг (эффективная доза ЕД₅₀), 80 мг/кг (промежуточная доза) и 110 мг/кг (1/100 от ЛД₅₀) не вызывает у животных обоего пола нарушений половой функции, не влияет на внутриутробное развитие плодов и физическое развитие потомства в постнатальном периоде.

Использование комплекса тестерных систем, способных учитывать все типы генетических повреждений, не выявило у соединения Na₂-L-AcAsp мутагенной и первичной канцерогенной активности.

Таким образом, динатриевая соль N-ацетил-L-аспарагиновой кислоты является малотоксичным лекарственным веществом, обладающим более выраженным антидепрессантным и ноотропным действием по сравнению с эталонными препаратами имипрамином и пирацетамом, а также известным структурным аналогом - динатриевой солью N-ацетил-DL-аспарагиновой кислоты. Сочетание выраженных антидепрессантных и ноотропных свойств у динатриевой соли N-ацетил-L-аспарагиновой кислоты позволяет считать это соединение перспективным для лечения широкого ряда нервно-психических заболеваний.

Описывается динатриевая соль N-ацетил-L-аспарагиновой кислоты формулы I

обладающая антидепрессантной и ноотропной активностью. 1 ил., 7 табл.

Динатриевая соль N-ацетил-L-аспарагиновой кислоты формулы

обладающая антидепрессантной и ноотропной активностью.