СПОСОБ ПОДДЕРЖАНИЯ СИБИРЕЯЗВЕННОГО ВАКЦИННОГО ШТАММА СТИ-1 Российский патент 1999 года по МПК C12N1/20 A61K39/07 C12N1/20 C12R1/07 

Изобретение относится к технологии приготовления медицинских препаратов, в частности к способам поддержания сибиреязвенного вакцинного штамма СТИ-1, обеспечивающим стабильность его биологических свойств с сохранением высокой иммуногенности, и может быть использовано в практике производства высококачественных сибиреязвенных вакцин.

Известный в микробиологической практике способ поддержания культур сибиреязвенного вакцинного штамма СТИ-1 заключался в периодическом пересеве микробной популяции с использованием питательных сред для получения биомассы из спор. (Регламент производства живой сибиреязвенной вакцины СТИ сухой. НИИВС Тбилиси от 19 апреля 1983; Экспериментально-производственный регламент N 364-92 Вакцина сибиреязвенная, живая сухая для подкожного и скарификационного применения).

Недостатком существующего способа является отсутствие условий, позволяющих из гетерогенной популяции проводить отбор токсинообразующих клонов с полноценным набором иммунологически значимых детерминант (pag, lef, cya).

Задачей изобретения является стабилизация основных биологических свойств культуры сибиреязвенного вакцинного штамма СТИ-1, в частности, сохранение иммуногенности.

Решение задачи достигается пассированием микробной популяции через организм восприимчивого животного с последующим высевом анализируемой культуры на среду специального состава, позволяющую выделять токсинообразующие клоны под контролем полноценности наиболее иммунологически значимых детерминант (pag, lef, cya) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Сущность предложенного способа заключается в использовании совокупности методов селекции и контроля генетической полноценности отдельных клонов из гетерогенной популяции сибиреязвенного вакцинного штамма СТИ-1, обеспечивающих получение культуры с высокими иммунобиологическими показателями.

Возможность осуществления заявляемого изобретения показана следующими примерами.

Пример 1. Пассирование культуры сибиреязвенного вакцинного штамма СТИ-1 через организм восприимчивого животного и его выделение.

Исходную споровую суспензию маточной культуры штамма СТИ-1 вводят тестикулярно по 0,5 мл в дозе 50...100 млн. спор по счету в камере Горяева трем морским свинкам (самцам) массой 400...450 г. На третьи сутки животных усыпляют хлороформом, вскрывают, извлекают селезенку и делают мазки отпечатки на поверхность агаровой среды с противосибиреязвенным гамма-глобулином, приготовленным по прописи, г/л:
мясо-пептонный бульон, мл - 750,0
агар, г - 25,0
калий фосфорнокислый однозамещенный трехводный, г - 1,5
глюкоза, г - 2,5
магний сернокислый семиводный, г - 1,0
марганец сернокислый пятиводный, г - 0,013
кальций хлористый шестиводный, г - 0,016
железо сернокислое семиводное, г - 0,02
урацил, г - 0,0014
аденин сульфат, г - 0,0021
тиамин гидрохлорид, г - 0,002
феноловый красный, г - 0,024
натрия бикарбонат 10% раствор, мл - 100,0
глобулин противосибиреязвенный 10% раствор, мл - 100,0
pH, ед. - 7,8 - 8,4
Нанесенное на поверхность агара содержимое селезенки последовательно распределяют шпателем на 4...5 чашек. Чашки помещают в эксикатор и инкубируют при 35...37^oC в атмосфере CO₂.

На вторые сутки чашки вынимают из эксикатора и предварительно их просматривают для отбора колоний с хорошо видимой зоной преципитации. Зона преципитации может образовываться как вокруг, так и под колонией. Для более четкого проявления зон преципитации время инкубирования чашек можно продлить до 3. . . 4 суток при комнатной температуре в атмосфере воздуха. Колонии, образующие зоны преципитации, отбирают бактериологической петлей для проведения анализа полноценности детерминант токсинообразования методом ПЦР.

Пример 2. Проведение клонового анализа культуры штамма СТИ-1, выделенной из селезенки восприимчивого животного, методом ПЦР.

Отобранную для приготовления матричной ДНК колонию ресуспендируют в 10.. .30 микропробирках со 100 мкл лизирующего раствора (20 мМ NaOH, 100 мМ трис, 2,5% додецилсульфатом натрия) и инкубируют 15 мин при 70^oC, после чего смешивают с равным объемом смеси фенола и хлороформа (1:1) и центрифугируют в течение 5 мин при 15000 об/мин на микроцентрифуге "Eppendorf". Водную фазу осаждают этанолом и центрифугируют в течение 10 мин. Надосадочную жидкость удаляют, осадок высушивают на воздухе и ресуспендируют в 10...30 мкл буфера ТЕ (10 мМ трис, 1 мМ ЭДТА, pH 7,4).

Для постановки ПЦР непосредственно перед анализом готовят инкубационную смесь следующего состава (из расчета на 100 мкл реакционной смеси):
буфер для амплификации ("Бион") - 33,3 мкл;
праймеры к исследуемому гену (см. табл 1.) - по 10 рМ каждого;
ДНК-полимераза Taq - 2,5 ЕД;
смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов - до конечной концентрации 0,4 мМ;
дистиллированная вода - до 100 мкл.

Инкубационную смесь для выравнивания условий ферментативного синтеза готовят одновременно для контрольной и всех анализируемых проб, тщательно перемешивают и разливают по пробиркам для амплификации в объеме 20...25 мкл. В пробирки вносят по 1 мкл исследуемого лизата, в контрольную пробирку 1 мкл стандартного образца ДНК сибиреязвенного микроба, полученного при лизисе клеток второй вакцины Ценковского. Для предотвращения испарения поверх инкубационной смеси наносят каплю вазелинового масла и помещают пробирки в штатив программируемого термостата. ПЦР проводят в течение 30 циклов со следующими температурными режимами: плавление ДНК (15 секунд при 94^oC), отжиг праймеров (15 секунд при 48^oC), синтез комплементарной цепи ДНК (30... 180 секунд при 72^oC, в зависимости от длины амплифицируемого участка).

По окончании процесса ферментативного синтеза ДНК пробы амплификатов вносят в 1,5% агарозный гель с бромистым этидием, помещенный в прибор для субмаринного горизонтального электрофореза.

Наличие и одинаковая, в сравнении со стандартным образцом, электрофоретическая подвижность (т.е. размеры ампликона) свидетельствуют об интактности анализируемого гена в исследуемом клоне. Большая электрофоретическая подвижность амликона свидетельствует об его меньших размерах (делеции части гена внутри фланкирующих праймеров). Причиной отсутствия амплификации в одном из анализируемых образцов может быть полное отсутствие данного гена, делеция участка гена комплиментарного одному из фланкирующих праймеров или методическая ошибка при выделении ДНК. Отсутствие ферментативного синтеза при использовании внутренних праймеров, особенно при наличии амплификации с праймерами к другим детерминантам, свидетельствует о полной утрате анализируемого гена.

Пример 3. Доказательство возможности использования метода ПЦР для анализа токсинообразующих генов (pag, lef, cya).

Из приведенных в табл.2 данных видно, что у культур, подвергшихся многократному пересеву, накапливаются мутации, повреждающие детерминанты токсинообразования. При использовании ПЦР выявляется гетерогенность микробной популяции исследованных культур, прежде всего по наличию гена pag. Проведение культуры через организм животного уменьшает генов гетерогенность микробной популяции по признакам наличия и полноразмерности токсинообразования.

Пример 4. Доказательство возможности приготовления высокоиммуногенной культуры штамма СТИ-1.

Приготовленные по новой схеме с использованием однократного пассажа через организм морской свинки и отбора полноценных по токсинопродукции клонов методом ПЦР три серии культуры вакцинного штамма СТИ-1 отличались стабильностью детерминант токсинообразования и существенно превосходили исходную культуру 1972 г. приготовления по иммуногенности (см. табл.3).

Таким образом, данная методика позволила из культуры со сниженной иммуногенностью и высокой гетерогенностью получить высокоиммуногенные культуры и предупредить возможное увеличение диссоциации их свойств при частых пересевах в неселективных условиях.

Изобретение предназначено для производства стабильных высококачественных вакцинных сибиреязвенных препаратов. Микробную популяцию пассируют через организм восприимчивого животного, высевают анализируемую культуру на агаровую среду с противосибиреязвенным глобулином. Среда позволяет выявлять токсинообразующие клоны. Выявление клонов проводят под контролем полноценности наиболее иммунологически значимых детерминант pag, lef, cya методом полимеразной цепной реакции. Изобретение позволяет из гетерогенных культур вакцинного штамма СТИ-1 со сниженной иммуногенностью получать однородные по детерминантам токсинообразования высокоиммуногенные культуры и предупреждать возможное увеличение диссоциации свойств культур при частых пересевах в неселективных условиях. 3 табл.

Способ поддержания сибиреязвенного вакцинного штамма СТИ-1 путем проведения пассажей, отличающийся тем, что пассирование проводят через организм восприимчивого животного с последующим высевом пассированной культуры на агаровую среду с противосибиреязвенным глобулином и контролем иммунологически значимых детерминант pag, lef, cya методом полимеразной цепной реакции.