СПОСОБ ВВЕДЕНИЯ ЧУЖЕРОДНЫХ ГЕНОВ В ГЕНОМЫ ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ, ПЛАЗМИДНЫЙ ВЕКТОР РКС47М ДЛЯ ВВЕДЕНИЯ ЧУЖЕРОДНЫХ ГЕНОВ В ГЕНОМЫ ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ, СПОСОБ КОНСТРУИРОВАНИЯ ПЛАЗМИДНОГО ВЕКТОРА РКС47М Российский патент 1997 года по МПК C12N15/63 

Изобретение относится к способам введения чужеродного генетического материала в бактерии с использованием векторов в частности к способам введения чужеродных генов в геномы грамотрицательных микроорганизмов. Изобретение может быть использовано в прикладных генетических исследованиях для получения различных производных грамотрицательных микроорганизмов.

Известен способ введения чужеродных генов в геномы грамотрицательных микроорганизмов, основанный на использовании плазмиды pMTF59. Указанная плазмида содержит в своем геноме транспозоны Tn5 и Tn9 и проявляет температурную нестабильность в клетках Enterobacteriaceae (Воложанцев Н.В. Данилович В.П. Смирнов С.П. Голуб Е.И. Встраивание транспозона устойчивости к ампициллину в хромосому Escherichia coli K-12 и плазмиды // Генетика. - 1979. тXY, N 2& с. 209-219). При культивировании бактерий, содержащих pMTF59, при температуре 37^oC в питательной среде с добавлением канамицина или хлорамфеникола, транспозоны Th5(Km) и Tn9(Cm) встраиваются в хромосому хозяина, вызывая различного рода мутации, а сама плазмида при этом элиминирует их клеток.

К недостаткам этого способа следует отнести нестабильность геномов получаемых микроорганизмов. Указанный недостаток обусловлен способностью транспозонов, уже встроенных в бактериальную хромосому, к повторным актам транспозиции. Общим с заявленным способам является использование для введения чужеродной ДНК в геномы микроорганизмов плазмиды с мигрирующими генетическими элементами, а также селекция и отбор рекомбинатных штаммов.

Другой известный способ введения чужеродных генов в геномы грамотрицательных микроорганизмов основан на использовании плазмиды pGP618. Плазмида представляет собой гибрид, содержащий клонированные гены A и B фага Mu под контролем сильного термоиндуцибельного промотора PL фага и A^-B^- -фаг мини Mu (Groeneu M. A.M. Timmers E. Vaude Putte P. DNA seguences at the ends of the genome of bacteriophage Mu essential for transpositon // Proc Natl. Acad. Sci. USA. 1985. Vol. 82. P. 6087- 6091). Недостатком этого способа является нестабильность геномов получаемых вариантов микроорганизмов. Указанный недостаток обусловлен тем, что плазмида pGP618 создавалась для изучения процесса транспозиции фага Mu, поэтому при ее конструировании для транскрипции генов A и B был использован термоиндуцибельный промотор фага Mu, что обеспечивало возможность точного отсчета времени начала транспозиции фага мини-Mu. Однако использование промотора PL обусловило необходимость включения в геном бактериальной клетки и репрессора C 1857, клонированного на плазмиде или находящегося в профаге, значительно усложнившего использование плазмиды pGP618 для инсерционного мутагенеза.

Нестабильность свойств получаемых вариантов микроорганизмов также вызвана сложностью элиминирования плазмиды pGP618 из бактерий после наведения соответствующих мутаций. Длительное присутствие в бактериальной клетке данной плазмиды с функционирующими генами A и B может вызвать многократную транспозицию фага мини-Mu и, как следствие этого, накопление множественных нежелательных мутаций.

Общим заявленным способом является использование для введения чужеродной ДНК в геномы микроорганизмов плазмиды с мигрирующими генетическими элементами, а также селекция и отбор рекомбинантных штаммов.

Наиболее близким к заявленному является способ введения чужеродных генов в геномы грамотрицательных микроорганизмов, основанный на использовании рекомбинантной плазмиды pP01734 (Castilho B.A. Olfson P. Casadaban M.V. Plasmid insertion mutagenesis and iac gene fusion with mini Mu bacteriophage transposons // J. Bacteriol. 1984. Vol. 185. P. 488-495). Плазмида pP01734 сконструирована встраиванием в плазмиду pSC101 генома фага мини-Mu d11 1734, из которого предварительно были удалены отвечающие за его транспозицию гены A и B. Фаг мини-Mu d11 1734 содержит генетическую детерминанту резистентности к канамицину из транспозона Tn5, что позволяет контролировать процесс транспозиции. Для комплектации функции отсутствующих в фаге Mu d11 1734 генов A и B необходим фаг-помощник. Использование для инсерционного мутагенеза плазмидной ДНК фага Mu d11 1734 требует длительных подготовительных операций. Прежде всего, необходимо в хромосому клеток кишечной палочки, содержащих ДНК фага-помощника Mu Cts, встроить мини-Mu d11 1734. Затем в полученный штамм методом трансформации вводится плазмидная ДНК, подвергаемая мутагенезу. После индукции (путем инкубирования при температуре 42^oC) получают фаголизат, который наряду с фагом-помощником содержит гибридные фаги, образовавшиеся с помощью Mu d11 1734. Небольшая часть гибридных фагов (до 10%) содержит ДНК плазмиды, подвергаемой мутагенезу. Среди них есть рекомбинантные фаги, которые содержат плазмидную ДНК, фланкированную двумя копиями фага Mu d11 1734 в одинаковой ориентации. После введения такой молекулы трансдукцией в рецепиентный rec A^- штамм E. cjli за счет гомологичной рекомбинации образуется гибридная плазмидная ДНК, состоящая из исходной плазмиды и фага Mu d11 1734.

К недостаткам данного способа следует отнести, во-первых, ограниченность сферы его применения, т.к. он предназначен для мутагенеза только плазмидной, но не хромосомной ДНК; во-вторых, в фаголизатах присутствует фаг-помощник, который наряду с Mu d11 1734 может встраиваться в геном рецепиента и вызывать множественные мутации, влияющие на жизнеспособность бактерий, их ростовые и другие свойства тем самым снижая стабильность свойств получаемых штаммов микроорганизмов; в-третьих, круг возможных рецепиентов включает лишь те виды и штаммы бактерий, которые обладают рецепторами для фага Mu. Еще одно ограничение связано с тем, что транспозиция фага Mu d11 1734 индуцируется повышением температуры до 42^oC, однако не все виды бактерий могут расти при этой температуре. И, наконец, последний недостаток связан с трудоемкостью использования данной системы для инсерционного мутагенеза.

Общим с заявленным способом является использование для введения чужеродной ДНК в геномы микроорганизмов плазмиды с мигрирующими генетическими элементами, а также селекция и отбор рекомбинантных штаммов.

Способ конструирования плазмиды, содержащей клонированные генетические детерминанты, ответственные за транспозицию фага Mu, а также A^-B^--фаг мини-Mu d1 5086-1, в доступной литературе не описан.

Задачами объектов настоящего изобретения являются интеграция введенных чужеродных генов в ДНК хромосомы реципиента, повышение стабильности свойств получаемых штаммов микроорганизмов, расширение круга возможных реципиентов и снижение трудоемкости способа.

Для решения поставленных задач способ введения чужеродных генов в геномы грамотрицательных микроорганизмов, включающий интродукцию в бактериальную клетку плазмиды, содержащей чужеродную ДНК в транспозируемом генетическом элементе, селекцию и отбор рекомбинантных штаммов, отличается тем, что для введения чужеродных генов используют плазмидный вектор pKC47м.

Плазмидный вектор pKC47m для введения чужеродных генов в гены грамотрицательных микроорганизмов имеет размер 22,9 т.п.н. и состоит из следующих элементов:
Hind III рестрикт (5, 3 т.п.н.) из плазмиды pEG 5068 с генами A и B фага Mu и участком, ответственным за репликацию вектора (rep pMB1);
Hind III рестрикт (4, 5 т.п.н.) с геном резистентности к гентамицину из плазмиды pKC8/2 и встроенным дефектным (A^-B^-) фагом Mu (Mu d15086-1), способным при цис-комплементации к встраиванию в геном реципиентной клетки и содержащим в качестве генетического маркера ген устойчивости к мономицину, уникальный Bam HI, предназначенный для клонирования чужеродных генов, а также сайт Hind III;
Hind III рестрикт (3, 5 т.п.н.) из плазмиды pKC 8/2 с геном резистентности к хлорафениколу с расположенным в нем сайтом для Eco R1 и промотором β -лактамазы Pβ предназначенная для конститутивной экспрессии генов A и B фага Mu;
Емкость вектора 5,5 МД в грамотрицательные микроорганизмы может передаваться трансформацией и мобилизацией коньюгативными плазмидами, генетические маркеры Km^r, Gm^r и Cm^r.

Способ конструирования рекомбинантной плазмиды pKC47м, заключается в том, что на плазмиде, способной к репликации в грамотрицательном микроорганизме, клонируют in vivo гены A и B фага Mu, отвечающие за его транспозицию и заменяют собственный термоиндуцибельный промот фага Mu на конструктивный просмотр b -лактамазы, затем в геном полученного гибрида in vivo встраивают A^-B^- -фаг мини Mu d1 5086-1.

Между совокупностью существенных признаков заявляемых объектов и достигаемым техническим результатом существует причинно-следственная связь (см. таблицу).

Плазмида pKC47м имеет в своем составе три маркера резистентности к антибиотикам. Генетическая дереминанта резистентности к канамицину (мономицину) локализована в геноме фага mu d1 5086-1, а гены, отвечающие за устойчивость к гентамицину и хлорамфениколу, находятся вне фага и сцеплены с детерминантами, обусловливающими его транспозицию (генами A и B). Плазмида pKC47м, имея относительно большой размер (22,9 т.п.н.), характеризуется сегретационной нестабильностью и утрачивается после одного-двух пересевов в жидкой питательной среде без добавления гентамицина или хлорафеникола. В данном случае это является достоинством гибридной конструкции, так как позволяет при высеве культуры на среду мономицином легко получать большое количество клонов, утративших исходную pKC47м и содержащих только встроенный в геном бактерии A^-B^- -фаг мини Mu d1 5086-1. После встраивания фага мини -Mu в хромосому и элиминиции pKC47м из бактериальной клетки повторная транспозиция фага невозможна из= за отсутствия генов A и B, отвечающих за транспозицию. Плазмида pKC47м может передаваться в реципиентные клетки не только трансформацией, но и мобилизацией конъюгативными плазмидами, например R388 или RP4.

Применение pKC47м не требует фага-помощника, т.к. в отличие от прототипа, в состав генома предлагаемой рекомбинантной плазмиды включены клонированные гены A и B, ответственные за транспозицию фага Mu. В отличие от прототипа значительно уменьшены ограничения по спектру бактериальных хозяев, поскольку имеется возможность использования для переноса рекомбинантной плазмиды не только трансдукции, но и трансформации, как и мобилизации конъюгативными плазмидами R388 или RP4. Кроме того, транспозиция фага мини-Mu d1 5086-1 не зависит от температуры, так как транскрипция генов A и B осуществляется конструктивно с промотора b -лактамазы. Упрощение способа и повышение эффективности инсерционного мутагенеза по сравнению с прототипом обусловливается высокой частотой встраивания фага Mu d1 5086-1 в геном бактерии, быстрой элиминацией плазмиды pKC47м- носителя мини-Mu фага и простотой осуществления переноса этой плазмиды в реципиентные клетки путем мобилизации конъгативными плазмидами. При этом следует подчеркнуть, что в отличие от методик сайт-направленного мутагенеза, в данном случае не требуется знание нуклеотидной последовательности "выключаемого" гена, достаточно лишь иметь в наличии эффективный способ отбора нужных мутантов.

Плазмида pKC47м позволяет осуществлять мутагенез одновременно и плазмидной, и хромосомной ДНК, получать генетически стабильные мутанты (частный случай выполнения заявляемого изобретения), которые могут быть использованы при конструировании новых вакцинных штаммов и продуцентов антигенов. При условии предварительного включения в геном pKC47м по сайту Bam H1 гетерологичной ДНК в геном бактерий можно встраивать дополнительные генетические детерминанты. Последнее может быть использовано при конструировании полидетерминантных вакцинных штаммов-продуцентов биологически активных веществ.

Способ коструирования рекомбинантной плазмиды pKC47м заключается в использовании комбинации методов генетической инженерии in vitro. Первоначально были сконструированы две рекомбинантные плазмиды pEG 5086-1 и pKC4/7(см. фиг. 2). Первая из них (pEG 5086-1)содержала A^-B^- -фаг мини-Mu, не способный к транспозиции. Вторая плазмида имела в своем составе клонированные гены A и B фага Mu, транскрипция которых осуществлялась с промотора b -лактазамы. На втором этапе конструирования было необходимо встроить A^-B^- фаг мини в пазмиду pKC4/7. Для этого в штамм E.coli, содержащий pEG 5068-1, была передана трансформацией плазмида pKC4/7. В результате этого дефектный A^-B^- фаг мини-Mu приобрел способность к транспозиции в бактериальную хромосому и, с небольшой частотой (менее 10^-3), в плазмиду pKC4/7. Плазмида pEG 5086-1 носитель фага Mu при этом элиминировала из клеток E. coli, о чем свидетельствовала утрата ими резистентности к ампициллину при сохранении устойчивости к мономицину (селективный маркер фага Mu d1 5086-1). Отбор клеток E. coli содержащих плазмиду pKC4/7 со встроенным в нее фагом мини Mu d 5086-1, обычными методами селекции был трудно осуществим. По этой причине была выделена из клеточной популяции E. coli общая плазмидная ДНК, которую использовали для трансформации бесплазмидного штамма E. coli 803. Селекцию трансформаторов вели на плотной питательной среде с 10 мкг/мл мономицина. Несколько отобранных Mm^r -трансформантов содержали рекомбинантную плазмидную ДНК, состоящую из pKC4/7 и встроенного в нее фага мини Mu d1 5068-1, что свидетельствовало об эффективности предлагаемого способа конструирования рекомбинантной ДНК.

На фиг. 1 представлена рестрикционная карта плазмиды pKC47м; на фиг. 2 - схема конструирования плазмиды pKC47м.

Пример 1. Конструирование рекомбинантной плазмиды pKC47м для инсерционного мутагенеза грамотрицательных бактерий.

А. Выделение ДНК плазмид рЕG 5086 и рКС8/2.

Плазмиды pEG 5068 и pKC8/2 служили в качестве исходного генетического материала при конструировании рекомбинантной плазмиды pKC47м.

Первая из них (pEG 5068), хорошо известная по литературным данным (Groisman E. A. Casadaban M.J. Mini-Mu bacteriophage with plasmid replicons for in vivo cloning and lac gene fusing // J.Bacteriol. -1986. -Vol. 168. -P. 357-364), содержит A⁺B⁺ -фаг мини -Mu d1 5086. Вторая плазмида (pKC8/2) была ранее сконструирована встраиванием в вектор pBR328 Pstl рестрикта плазмиды R55 с геном, ответственным за резистентность к гентамицину. Полученный в результате этого гибрид используется здесь как донор двух Hind III рестриктов, 4,5 т. п. н. и 3,5 т.р.н. с генами резистентности к гентамицину и хлорамфениколу соответственно.

Клетки E. coli 803, содержащие плазмиды pEG 5068 и pKC8/2, выращивали в бульоне LB (pH 7,2) с аэрацией в течение 18 ч при 37^oC. Для амплификации плазмидной ДНК клетки E. coli обрабатывали хлорамфениколом (25 мкг/мл) с последующим подращиванием в течение 12 ч при температуре 37^oC. Затем клетки осаждали центрифугированием (5000 об./мин, в течение 10 мин при 4^oC). Последующие операции по выделению плазмидной ДНК проводили в соответствии с известной методикой (Маниатис Т. Фриг Э. Стрембрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование /Пер. с анг. под ред. А.А. Баева, К.Г. Скрябина. М. 1984.). Конечную очистку плазмидной ДНК проводили ультрацентрифугированием в градиенте плотности хлористого цезия. Полученные препараты плазмидной ДНК pEG 5086 и pKC8/2 использовали для конструирования рекомбинатных плазмид pEG 5086-1 и pKC4/7.

Б. Конструирование рекомбинатных плазмид pEG 5086 и pKC4/7.

Схема конструирования рекомбинатных плазмид pEG 5086-1 и pKC4/7 представлена на фиг. 2. На первом этапе конструирования из генома плазмиды pEG 5086 был удален Hind III рестрикт (5,3 т.п.н.), содержащий гены A и B фага Mu и один из двух участков начала репликации этой плазмиды. Образовавшаяся в результате этого плазмида pEG 5086-1 содержала A^-B^- фаг мини -Mu d1 5086-1, не способный к транспозиции. Одновременно для комплектации функции транспозиции A^-B^- -фага мини -Mu d1 5986-1 была сконструирована гибридная плазмида pKC4/7, которая содержала Hind III -рестрикт (5,3 т.п.н.) pEG 5086 с генами A и B, а также два Hind III -рестрикта, 4,5 т.п.н. и 3,5 т.п.н. плазмиды pKC8/2 с генетическими детерминантами резистентности к гентамицину и хлорафениколу соответственно. Гены A и B при конструировании pKC4/7 утратили свой собственный терморегулируемый промотор и транскрибируются конститутивно с промотора b -лактамазы, генетическая детерминанта которой была инактивирована при коструировании pKC8/2.

Системы из двух плазмид, pEG 5086-1 и pKC4/7, можно использовать как таковую для инсерционного мутагенеза, но введение в одну клетку двух близкородственных плазмид связано с определенными трудностями не всегда достижимо. Поэтому представлялось целесообразным встроить методами транспозиции in vivo A^-B^- -фаг мини -Mu d1 5086-1 входящий в pEG 5086-1, в плазмиду pKC4/7, геном которой содержит клонированные гены A и B фага Mu.

В. Конструирование рекомбинантной плазмиды pKC47м.

Для конструирования pKC47м в штамм E. coli 803, несущий плазмиду pEG 5086-1, была передана трансформацией плазмида pKC4/7. Полученный в результате штамм кишечной палочки пересевался дважды в жидкой питательной среде с добавлением 25 мкг/мл хлорамфеникола, резистентность к которому является одним из селективных маркеров плазмиды pKC4/7, и 25 мкг/мл мономицина (Mm^r - селективный маркер A^-B^- -фага -Mu d1 5086-1). После второго пересева культуры среди 100 проверенных клонов с фенотипом Mm^r, Gm^r, Cm^r не оказалось ни одного устойчивого к Ap, что свидетельствовало об элиминации плазмиды pEG 5086-1.

Входящий в состав этой плазмиды фаг мини -Mu d1 5086-1, о присутствии которых в клетках E. coli свидетельствовало наличие устойчивости к мономицину, встраивался в бактериальную хромосому и в небольшом проценте случаев в плазмиду pKC4/7. Для отбора коинтегратов pKC4/7 Mu d1 5086-1 из клеточной популяции E. coli получен препарат плазмидной ДНК, который использовали для трансформации бесплазмидного штамма E. coli 803. Для селекции трансформантов использовали плотную питательную среду с добавлением 10 мкг/мл мономицина. Полученные трансформанты, кроме резистентности к мономицину, обладали также устойчивостью к гентамицину и хлорамфениколу, что подтверждало наличие в реципиентных клетках искомых коинтегратов pKC4/7 Mu d1 5086-1. Более детально были изучены свойства одной из таких рекомбинантных плазмид, получившей наименование pKC47м. Рестрикционная карта плазмиды pKC47м представлена на фиг. 1.

Как видно из фиг. 1, рекомбинантная плазмида pKC47м, предназначенная для инсерционного мутагенеза, состоит из следующих структурных элементов:
Hind III рестрикта (5,3 т.п.н.) из плазмиды pEG 5086 c генами A и B фага Mu и участком, соответственным за репликацию вектора (rep pMB1);
Hind III рестрикта (4,5 т.р.н.) с геном резистентности к гентамицину из плазмиды pKC8/2 и встроенным дефектным (A^-B^-) фагом Mu (Mu d1 5086-1), способным при цис-комплектации к встраиванию в геном реципиентной клетки и содержащим в качестве генетического маркера ген устойчивости к мономицину, уникальный сайт Bam HI, предназначенный для клонирования чужеродных генов, а также сайт Hind III;
Hind III рестрикта (3,5 т.п.н.) из плазмиды зЛС 8/2 с геном резистентности к хлорамфениколу с расположенным в нем сайтом для Eco R1 и промотором бета-лактамазы ( Pβ ), предназначенным для конститутивной экспрессии генов A и B фага Mu;
Пример 2. Получение ауксотрофных мутантов Yersinia pseudotuberculosis посредством трансформации плазмидой pKC47м.

ДНК плазмиды pKC47м выделяли из штамма E. coli 803 (pKC47m) и очищали равновесным центрифугированием в градиенте плотности хлористого цезия с бромистым этидием. Очищенный ДНК трансформировали клетки штамма 147 Y.pseudotuberculosis. Селекцию трансформантов осуществляли на плотной питательной среде с добавлением 20 мкг/мл мономицина. В ходе последующего его изучения с помощью метода реплик клонов, выросших на этой среде, оказалось, что более 99% их устойчивы к мономицину, но чувствительны к хлорамфениколу и гентамицину. Это свидетельствовало о встраивании фага мини Mu d1 5086-1 в геном бактерии и о быстрой элиминации плазмиды pKC47м. Так как встраивание фага Mu в геном бактерий происходит случайным образом, то для выделения из популяции нужных мутантов были использованы обычные методы селекции, включая ампициллиновое обогащение (Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике /Пер. с англ. Ю.Н. Зографа, Т.С. Ильиной, В.Г. Никифорова; под ред. С.И. Алиханян. -М. 1976). В данном эксперименте стояла задача получения ауксотрофных по триптофану мутантов псевдотуберкулезного микроба, поэтому в качестве селективной использовали минимальную питательную среду A (Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике /Пер. с англ. Ю.Н. Зографа, Т.С. Ильиной, В. Г. Никифорова; под ред. С.И. Алиханян. М. 1976). с добавлением и без добавления триптофана. После двух циклов ампициллинового обогащения из 100 проверенных методом реплик было выделено 9 клонов, не способных расти на минимальной среде без триптофана. При проверке стабильности сохранения мутантного фенотипа после 10 пересевов культур в богатой жидкой питательной среде без антибиотиков не было выявлено реверантов, способных расти на минимальной среде без трептофана. Высевали "голодный" агар примерно по 10¹⁰ клеток культур мутантов, при этом не вырастало ни одной колонии, поэтому частоту спонтанных реверсий к дикому типу (если они возможны) можно оценить как <10¹⁰.

Пример 3. Получение ауксотрофных мутантов Y.pseudotuberculosis посредством мобилизации плазмиды pKC47м конъюгативными плазмидами.

Передачу плазмиды pKC47м в клетки Y.pseudotuberculosis осуществляли путем мобилизации конъюгативными плазмидами RP4 и R388. Предварительно плазмиды RP4 и R388 были введены конъюгацией в клетки E. coli 803, содержащие pKC47м. Два полученных штамма E. colli 803 (pKC47м) (RP4) и E. coli 803 (pKC47m) (R388) использовали в качестве доноров, реципиентом служил устойчивый к рифампицину спонтанный мутант штамма 147 Y.pseudotuberculosis. Скрещивание проводили по общепринятой методике ( Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике /Пер. с англ. Ю.Н. Зографа, Т.С. Ильиной, В.Г. Никифорова; под ред. С.И. Алиханян. -М. 1976) в жидкой питательной среде. Для селекции трансконъюгантов использовали богатую питательную среду с добавлением 100 миг/мл рифампицина и 20 мкг/мл мономицина. Для отбора среди трансконъюгантов ауксотрофных мутантов применяли ту же методику, что и в примере 2. Было выбрано 3-5 мутантов, ауксотрофных соответственно по аргинину и триптофану.

Приведенные выше примеры свидетельствуют об эффективности применения плазмиды pKC47м для селекции ауксотрофных мутантов Y.pseudotuberculosis. Плазмида pKC47м может быть использована также для вставочного мутагенеза Y. enterocolitica, E. coli и ряда других видов грамотрицательных бактерий, в клетки которых она способна передаваться методом трансформации или путем мобилизации плазмидами широкого спектра хозяев R388 и RP4. Положительными характеристиками методики инсерционного мутагенеза с использованием предлагаемой плазмиды являются: высокая стабильность вставки (а значит, и отсутствие реверсий к исходному фенотипу), исключение возможности повторных актов транспозиции и накопления множественных мутаций.

Пример 4. Встраивание гена fra чумного микроба в хромосому кишечной палочки.

Для этих целей использовали векторную систему pKC 1/1M Fra, которая была сконструирована in vitro путем встраивания в Bam H1-сайт плазмиды pKC47м BglII-фрагмента рекомбинантной ДНК R388 Fra (Дармов И.В. Маракулин И.В. Янов С. Н. Бывалов А.А. Абдуллин Т.Г. Cмирнов Е.В. Конструирование штаммов-продуцентов антигенов F1 и T чумного микроба // Биотехнология. -1992. -N 6. С. 59-62.) c детерминантной биосинтеза F1 антигена.

Передачу рекомбинантной плазмиды pKC1/1M Fra в бактерии E. coli HB 101 осуществляли методом трансформации. Селекцию трансформантов осуществляли на питательном агаре, содержащем одновременно мономицин (25 мкг/мл) и гентамицин (10 мкг/мл). Для индукции транспозиции мини-Mu-фага с детерминантой устойчивости к мономицину и генам биосинтеза F1-антигена в хромосому хозяина объединенную культуру выделенных трансформантов пересевали в жидкой питательной среде с добавлением мономицина в концентрации 25 мкг/мл. После пяти пересевов культуру рассевали до единичных колоний и осуществляли отбор клонов, утративших устойчивость к гентамицину (фрагмент рекомбинантной ДНК с AB генами), но сохранивших резистентность к мономицину. Из 100 изученных клоновых культур 98 имели искомый фенотип. Уровень биосинтеза F1-антигена бактериями исследуемых клоновых культур, выращенных при температуре 36.38^oC, как установлено с помощью реакции иммунопреципитации в агаре, составлял 128-256 антигенных единиц (АЕ), что соответствовало уровню продукции этого антигена бактериями вакцинного штамма EV Y. pestis. Анализ плазмидного профиля полученных продуцентов не выявил присутствия в их бактериях внехромосомной ДНК, что наряду с высокой стабильностью признака Fra свидетельствовало о встраивании мини-Mu-фага в хромосому хозяина.

Пример 5. Встраивание гена fra чумного микроба в хромосому аттенуированного штамма Y.pseudotuberculosis.

Передачу рекомбинантной плазмиды pKC1/1M-Fra в клетки Y.pseudotuberculosis осуществляли методом трансформации. Реципиентом служил аттенуированный (потенциально вакцинный ) штамм 45 Y.pseudotuberculosis. Для встраивания мини -Mu-фага с генами биосинтеза F1- антигена чумного микроба в хромосому хозяина применяли методику, что и примере 5. В результате этих экспериментов были получены клоновые культуры Y.pseudotuberculosis, продуцирующие капсульный антиген чумного микроба. Уровень биосинтеза F1-антигена бактериями полученных вариантов псевдотуберкулезного микроба, выращенных при температуре 36.38^oC, составлял 64.128 AE по результатам реакции иммунопреципитации. Бактерии вакцинного штамма EV Y. pestis в этих же условиях культивирования продуцировали F1 антиген в количестве 128.256 AE.

Пример 6. Встраивание детерминанты устойчивости к мономицину в геном природной конъюгативной плазмиды R388.

Передачу рекомбинантной плазмиды pKC47м в бактерии E. coli 803 (R388) осуществляли методом трансформации. Селекцию трансформантов осуществляли на питательном агаре с добавлением 20 мкг/мл мономицина.

В ходе изучения полученных клоновых культур трансформантов было установлено, что 98% их устойчивы к триметоприму и сульфаниламидам (маркеры плазмиды R388) и мономицину (маркер плазмиды pKC47м), но чувствительны к хлорамфениколу и гентамицину. Это свидетельствовало о встраивании фага мини-Mu d1 5088-1 в геном бактерии и быстрой элиминации плазмиды pKC47m.

Так как встраивание фага Mu в геном бактерии происходит случайным образом для селекции рекомбинантных плазмид, интегрировавших с детерминантной устойчивости к мономицину, был осуществлен конъюгативный перенос их в клетки других хозяев. Реципиентом в данном случае служил устойчивый к рифампицину штамм EV Y. pestis. Селекцию трансконъюгантов вели на плотной питательной среде с добавлением 100 мкг/мл рифампицина и 20 мкг/мл мономицина.

Последующее изучение полученных трансконъюгантов выявило наличие в их бактериях конъюгативной плазмиды с генами устойчивости к триметоприму, сульфамиламидам и мономицину, что свидетельствовало о встраивании детерминанты резистентности к мономицину в геном R388.

Использование: прикладные генетические исследования для получения производных грамотрицательных микроорганизмов, для введения чужеродного генетического материала в бактерии с использованием векторов, в частности, для введения чужеродных генов в геномы грамотрицательных микроорганизмов. Сущность изобретения: используется плазмидный вектор рКС47м размером 22,9 т.п. н. и емкостью 5,5 МД, вектор может передаваться в грамотрицательные микроорганизмы трансформацией и мобилизацией коньюктивными плазмидами; способ конструирования плазмиды рКС47м заключается в том, что на плазмиде, способной к репликации в грамотрицательном микроорганизме, клонируют in vitro гены A и B фага Mu, и заменяют собственный термоиндуцибельный промотор фага Mu на конститутивный промотор β -лактамазы, затем в геном in vitro встраивают A^-B^--фаг мини - Mud1 5086-1. 3 с.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл.

1. Способ введения чужеродных генов в геномы грамотрицательных микроорганизмов, включающий интродукцию в бактериальную клетку плазмиды, содержащей чужеродную ДНК в транспозируемом генетическом элементе, селекцию и отбор рекомбинантных штаммов, отличающийся тем, что из плазмид используют плазмидный вектор рКС47м. 2. Плазмидный вектор рКС47м для введения чужеродных генов в геномы грамотрицательных микроорганизмов, имеющий размер 22,9 т.п.н. и состоящий из:
Hind III рестрикт (5,3 т.н.п.) из плазмиды pЕС 5086 с генами A и B фага Mu и участком, ответственным за репликацию вектора (rep pМВ1);
Hind III рестрикт (4,5 т.н.п.) с геном резистентности к гентамицину из плазмиды pКС8/2 и встроенным дефектным (A^-B^-) фагом Mu (Mu d15086-1), способным при цис-комплементации к встраиванию в геном реципиентной клетки и содержащим в качестве генетического маркера ген устойчивости к мономицину, уникальный сайт Bam H1, предназначенный для клонирования чужеродных генов, а также сайт Hind III;
Hind III рестрикт (3,5 т.п.н.) из плазмиды pКС 8/2 с геном резистентности к хлорамфениколу с расположенным в нем сайтом для Eco R1 и промотором β -лактамазы (Pβ), предназначенным для конститутивной экспрессии генов A и B фага Mu;
емкостью 5,5 МД, передающийся в грамотрицательные микроорганизмы трансформацией и мобилизацией конъюгативными плазмидами, генетические маркеры Km^r, Gm^r и Cm^r. 3. Способ конструирования плазмидного вектора pКС47м, заключающийся в том, что на плазмиде, способной к репликации в грамотрицательном микроорганизме, клонируют in vitro гены A и B фага Mu, отвечающие за его транспозицию, и заменяют собственный термоиндуцибельный промотор фага Mu на конститутивный промотор β -лактамазы, затем в геном полученного гибрида in vivo встраивают A^-B^--фаг мини Mu d1 5086-1.