АТТЕНУИРОВАННЫЙ ШТАММ Bacillus anthracis ДЛЯ РАЗРАБОТКИ СРЕДСТВ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ Российский патент 2015 года по МПК C12N1/20 A61K39/07 

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии, касается бескапсульного природно ослабленного штамма Bacillus anthracis 363/11 и может быть использовано в научно-исследовательских и биотехнологических центрах для создания средств специфической профилактики сибирской язвы.

В связи с широким распространением сибирской язвы на территории Российской Федерации в прошлом и способностью спор сибиреязвенного микроба сохраняться в почвенных очагах десятками и даже сотнями лет благополучие по данной болезни, главным образом, сохраняется за счет проведения поголовной вакцинации с/х животных. Несмотря на это в России ежегодно регистрируется от 2-х до 16 спорадических случаев сибирской язвы среди восприимчивых животных, большая часть из которых подвергалась профилактической иммунизации. К числу основных причин возникновения вспышек сибирской язвы можно отнести неэффективно проведенные вакцинации, нарушение условий хранения биопрепаратов и циркуляцию в природе изолятов, иммунологически не соответствующих применяемым вакцинным штаммам [Ю.О. Селянинов, И.Ю. Егорова, 2012].

В настоящее время в Российской Федерации для обеспечения биологической безопасности по сибиреязвенной инфекции в животноводстве используется вакцина живая из бескапсульного авирулентного вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ, а в здравоохранении - из бескапсульного вакцинного штамма СТИ-1. За рубежом для профилактики этой болезни у животных и людей применяются вакцины из штаммов В. anthracis Sterne (34 F₂), Вейбридж (Европа, США и др.), Ихтиман (Болгария), K79Z (Украина), 1190-R (Румыния) и др. [Г.Г. Онищенко и др., 1999]. Все перечисленные вакцинные штаммы не содержат плазмиды pXO2, отвечающей за выработку капсулы, основного фактора патогенности сибиреязвенного микроба.

Получение штаммов В. anthracis, перспективных для создания на их основе живых вакцин, проводили двумя основными способами: искусственной элиминацией плазмиды pXO2 у ослабленных капсулообразующих штаммов с последующей селекцией бескапсульных вариантов и отбором бескапсульных штаммов В. anthracis из природно ослабленных полевых изолятов.

Первым способом из вирулентных капсулообразующих изолятов сибиреязвенного микроба были получены вакцинные штаммы 1190-R (1934), Sterne (1937), Вейбридж (1939), Takahaschi (1939), Мактесвар (1939), СТИ (1940), НИИЭГ K-II (1940), Шуя-15 (1949), вторым - штамм Ихтиман и 55-ВНИИВВиМ [Э.Н. Шляхов, 1960; R.S. Slavtchev, 1967; Г.Г. Онищенко и др., 1999]. Однако при сравнительном изучении специфической активности наиболее известных вакцинных штаммов (СТИ, ГНКИ, Ихтиман, 34-F₂, 55-ВНИИВВиМ) была установлена достоверная и существенная разница в их иммуногенности и защитных спектрах по отношению к некоторым полевым изолятам, вплоть до полной незащищенности от заражения [И.А. Бакулов, В.А. Гаврилов, 1991]. Для преодоления указанных недостатков авторы предлагают использовать химические вакцины на основе протективного антигена, комбинированные вакцины на основе спор одного штамма и протективного антигена другого штамма, двух- и трехвалентные вакцины на основе различных штаммов, а также вести поиск новых штаммов, обладающих наиболее полноценным антигенным составом.

Близким аналогом предлагаемого изобретения является бескапсульный авирулентный штамм 55-ВНИИВВиМ, полученный селекцией во ВНИИВВиМ из изолята С-63, выделенного сотрудниками Харьковского зооветинститута из трупа свиньи в 1963 году, и используемый для изготовления вакцины против сибирской язвы животных. Штамм 55-ВНИИВВиМ в прививных дозах 12,5×10⁷ и 25,0×10⁷ спор индуцирует выработку напряженного противосибиреязвенного иммунитета в организме вакцинированных животных (мелкий и крупный рогатый скот, соответственно) и защищает от 40 до 100% поголовья от заражения полевыми вирулентными изолятами [И.А. Бакулов, В.А. Гаврилов, 1991].

Недостатками штамма являются его низкая антигенность, недостаточно широкий спектр защитного действия по отношению к полевым изолятам, циркулирующим на территории России и остаточная реактогенность. При получении сибиреязвенных гипериммунных сывороток с использованием 4 различных схем иммунизации титры антител к антигенам штамма 55-ВНИИВВиМ во всех случаях были в 2-8 раз ниже, чем к антигенам штамма Sterne (34F₂). Изучение сотрудниками ГНУ ВНИИВВиМ геномного полиморфизма музейных культур В. anthracis показало, что некоторые из них имеют уникальные генотипы, существенно отличающиеся от молекулярных типов большинства изученных изолятов возбудителя сибирской язвы, в том числе и штамма 55-ВНИИВВиМ. Так изолят, выделенный в Удмуртской ССР в 1989 году, отличающийся по генотипу от штамма 55-ВНИИВВиМ, вызвал заболевание крупного рогатого скота спустя месяц после его иммунизации вакциной из штамма 55-ВНИИВВиМ. О наличии у вакцины из штамма 55-ВНИИВВиМ реактогенности свидетельствуют сообщения ветеринарных специалистов о поствакцинальных осложнениях у коз - образование серозных отеков на месте введения препарата.

Целью изобретения является получение нового авирулентного штамма Bacillus anthracis, обладающего более широким спектром защитного действия, большей иммуногенностью и меньшими, по сравнению со штаммом-аналогом, реактогенностью и иммунизирующей дозой.

Поставленная цель достигается путем выделения нового природно ослабленного бескапсульного штамма сибиреязвенного микроба. Заявляемый штамм 363/11 выделен сотрудниками ГНУ ВНИИВВиМ в 2011 году от павшего подсвинка.

Штамм 363/11 депонирован в Коллекции штаммов микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии под инв. №363.

Штамм Bacillus anthracis 363/11 характеризуется следующими культурально-морфологическими, иммунобиологическими и биохимическими признаками.

Культуральные свойства. Факультативный аэроб. Оптимальная температура роста на твердых и жидких питательных средах (36±1)°C, оптимум pH (7,4±0,2). Имеет типичные для вида В. anthracis культурально-морфологические свойства: при культивировании в жидких питательных средах бульон остается прозрачным, на дне формируется осадок в виде комочка ваты; на твердых питательных средах образует матовые, шероховатые колонии R-, реже RO-формы, диаметром 3-4 мм. На средах, содержащих сыворотку крови лошади и в присутствии CO₂, а также в организме восприимчивых лабораторных животных не образует капсульного полипептида.

Морфологические свойства. Существует в двух морфологических формах: вегетативной и споровой. В мазках с питательных сред грамположительные палочки располагаются в виде длинных цепочек, которые в местах их соединения выглядят обрубленными или слегка вогнутыми. Споры, окрашенные по Циль-Нильсену, имеют овальную форму, располагаются преимущественно центрально. Клетки жгутиков не имеют, неподвижны.

In vivo (в организме белых мышей) формирует цепочки, состоящие из 4, 8, 16, 21 и более члеников.

Биохимические свойства. Вызывает α-гемолиз эритроцитов барана. Ферментирует с образованием кислоты без газат целлобиозу, сахарозу, трегалозу. Не разлагает аргинин. Окисляет глюкозу до ацетоина. Восстанавливает нитраты до нитритов. Продуцирует каталазу, не образует щелочную фосфатазу.

Антигенные свойства. Соматический антиген штамма 363/11, полученный путем термоэкстракции, вступает в специфическое взаимодействие с сибиреязвенной преципитирующей сывороткой, а супернатан суточной бульонной культуры - с глобулином противосибиреязвенным из сыворотки крови лошади.

При подкожном введении овцам споровой суспензии штамм индуцирует выработку агглютинирующих антител.

Слабо чувствителен к воздействию сибиреязвенного фага Fah-ВНИИВВиМ и высокочувствителен к фагу Rd/Ph/6.

Плазмидный состав. Содержит в геноме последовательности pag- гена, гены капсульного оперона отсутствуют (pXO1⁺pXO2^-).

Остаточная вирулентность. LD₅₀ для аутбредных белых мышей живой массой 18-20 г составляет 3,162×10⁵ спор, для морских свинок живой массой 200-300 г - свыше 10⁸ спор.

Реверсибельность. Не восстанавливает способность к капсулообразованию на протяжении 7 последовательных пассажей на морских свинках (на 8 пассаже прекращает размножаться в организме морских свинок) и 10 пассажей на аутбредных белых мышах.

Реактогенность. Слабореактогенен для морских свинок: при подкожном введении 10⁷ спор на месте введения образуются серозные отеки, редко с последующими изъязвлениями. Не реактогенен для овец при введении 10⁷ спор подкожно в области бесшерстного участка подмышечной впадины.

Иммуногенные свойства. В прививной дозе 10⁶-10⁷ спор вызывает формирование у привитых животных (морских свинок, овец) напряженного иммунитета против капсулообразующих референс-заражающих штаммов (II вакцина Ценковского, 17JB) и полевых изолятов.

Для подтверждения преимущества настоящего изобретения приведены примеры конкретного его исполнения.

Пример 1. Описание основных биологических свойств вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ и бескапсульного природно ослабленного штамма 363/11.

Характеристика биологических свойств штаммов 55-ВНИИВВиМ и 363/11 представлена в таблице 1.

Таблица 1 Характеристика биологических свойств штаммов 55-ВНИИВВиМ и 363/11 № п/п Признаки Характеристика штамма 55-ВНИИВВиМ 363/11 1. Морфология in vitro палочки, споры палочки, споры 2. Морфология in vivo палочки, соединенные в цепочки по 2, 4, 6 и иногда 8 членников палочки, соединенные в цепочки по 4, 8, 16, 21 и более члеников 3. Подвижность отсутствует отсутствует 4. Окраска по Граму грамположительная грамположительная 5. Рост в МПБ «комок ваты» в прозрачном бульоне, формирование на 5-е сутки пристеночного кольца «комок ваты» в прозрачном бульоне 6. Рост на плотных питательных средах R-формы с типичными «локонами» R и RO-формы с типичными «локонами» 7. Тип гемолиза, уровень продукции экзотоксина β-гемолиз, средний α-гемолиз, высокий 8. Чувствительность к фагу Fah-ВНИИВВиМ слабо чувствителен слабо чувствителен 9. Чувствительность к фагу Rd/Ph/6 чувствителен (#) чувствителен (#) 10. Наличие капсулы отсутствует отсутствует 11. Продукция токсина in vitro и in vivo продуцирует продуцирует 12. Наличие pag-гена имеется имеется 13. Наличие cap-гена отсутствует отсутствует

Представленные в таблице 1 данные свидетельствуют о наличии у обоих штаммов свойств, типичных для вакцинных штаммов (стойкая утрата капсулообразования). Различия между штаммами заключаются в способности экспрессировать in vitro различные виды гемолизинов на разных уровнях.

Пример 2

Остаточная вирулентность штаммов 55-ВНИИВВиМ и 363/11 определена на модели аутбредных белых мышей живой массой 18-20 г и морских свинках живой массой 200-300 г путем подкожной инокуляции последним в объеме 0,25 см³ споровых суспензий серийных разведений патогенов, приготовленных с пятикратным шагом. Наблюдение за животными проводилось в течение 10 суток. По окончании срока наблюдения определяли отношение числа животных, павших от введения данной дозы, к общему числу животных, которым была введена эта доза. Величина LD₅₀ рассчитывалась по формуле Кербера в модификации И.П. Ашмарина и А.А. Воробьева (табл.2).

Таблица 2 Сравнительная оценка остаточной вирулентности штаммов 55-ВНИИВВиМ и 363/11 Вид животных Показатели LD₅₀ для штаммов, спор   55-ВНИИВВиМ 363/11 Аутбредные белые мыши 115,0×10⁵ 3,162×10⁵ Морские свинки свыше 10⁸ свыше 10⁸

Данные таблицы 2 свидетельствуют о том, что оба штамма характеризуются сходными показателями LD₅₀ для морских свинок и относятся к группе авирулентных штаммов. По показателю LD₅₀ для аутбредных белых мышей штаммы 363/11 и 55-ВНИИВВиМ имеют отличия, но по классификации Э.Н. Шляхова и Е.В. Груз (1978) оба штамма также относятся к группе авирулентных культур.

Пример 3.

В экспериментах на морских свинках определены показатели иммунизирующих доз штаммов 55-ВНИИВВиМ и 363/11, защищающих от гибели 50% вакцинированных животных (ИмД₅₀) после заражения референс-заражающей культурой сибиреязвенного микроба штамма №71/12 в дозе 200 ЛД₅₀. Результаты сравнительного определения на морских свинках ИмД₅₀ штаммов В. anthracis 55-ВНИИВВиМ и 363/11 приведены в табл.3.

Таблица 3 Показатели ИмД₅₀ для морских свинок штаммов В. anthracis 55-ВНИИВВиМ и 363/11 Показатель Штамм 55-ВНИИВВиМ Штамм 363/11 ИмД₅₀ для морских свинок в отношении референс-заражающего штамма №71/12 (2,9-3,4)×10⁵ спор 2,951×10⁴ спор

Данные таблицы 3 свидетельствуют о том, что показатель ИмД₅₀ для штамма 363/11 в 10 раз ниже, чем для штамма 55-ВНИИИВВиМ, т.е. для индукции у морских свинок защитного иммунитета, предохраняющего 50% вакцинированных животных от гибели после введения спор штамма №71/12 в дозе 200 ЛД₅₀, требуется в 10 раз меньшая вакцинирующая доза.

Пример 4.

В экспериментах на морских свинках показано, что спектр защитного действия штамма 363/11 шире, чем штамма 55-ВНИИВВиМ. Процент выживаемости вакцинированных штаммом 363/11 морских свинок, зараженных референс-заражающими культурами сибиреязвенного микроба (№№71/12, 17JB, 76) и полевыми изолятами, выделенными в различных регионах России и в разное время (№№81, 304, 364), был выше, чем для морских свинок, вакцинированных штаммом 55-ВНИИВВиМ (табл. 4).

Таблица 4 Иммуногенные свойства штаммов В. anthracis 55-ВНИИВВиМ и 363/11 в испытаниях на морских свинках Штамм В. anthracis Иммунизирующая доза, спор Процент защиты вакцинированных животных от заражения различными сибиреязвенными штаммами (заражающая доза 200 ЛД₅₀) 71/12 76 81 304 364** 17JB 363/11 10⁷ 80 100* 100* 50 40 100 55-ВНИИВВиМ 1,2×10⁷ 80 100*** 40*** 25 10 100 Примечание:* - прививная доза штамма составила 10⁶ спор; ** - заражающая доза штамма составила 1200 ЛД₅₀; *** - данные Бакулова И.А. и Гаврилова В.А. (1991)

Из представленных в таблице 4 данных видно, что вакцинация животных штаммом 363/11 защищает 100, 50 и 40 процентов морских свинок от заражения культурами вирулентных полевых изолятов В. anthracis штаммы №№81, 304, 364, соответственно, в то время как процент защиты вакцинированных животных штаммом 55-ВНИИВВиМ для указанных полевых изолятов составляет 40, 25 и 10%, соответственно. Иммуногенная активность штаммов 363/11 и 55-ВНИИВВиМ в отношении референс-заражающих культур штаммов №№71/12, 17JB, 76 отличий не имела.

Пример 5.

Иммуногенную активность штаммов определяли в опытах на овцах возрастом 1-1,5 года из стада, не подвергавшегося вакцинации против сибирской язвы. Овцам вводили под кожу по 10-12 млн спор испытуемых штаммов в объеме 1 мл.

Через 21 день вакцинированных овец заражали внутрикожным введением споровых культур высоковирулентных сибиреязвенных штаммов в дозах, составляющих для овцы не менее 10 безусловно смертельных доз. Наблюдение за зараженными животными вели в течение 10 дней. Овцы, у которых сформировался напряженный иммунитет против соответствующего заражающего штамма, оставались клинически здоровыми. Незащищенные животные погибли в течение 3-5 дней после заражения с признаками острой формы сибирской язвы. Специфический характер гибели овец подтверждался микроскопией мазков крови и бактериологическим анализом.

Таблица 4 Иммуногенные свойства штаммов В. anthracis 55-ВНИИВВиМ и 363/11 на овцах Штамм В. anthracis Иммунизирующая доза, спор Штаммы, использованные для заражения (200 LD₅₀) №76 №304 №81 363/11 10⁷ выжила выжила выжила 55-ВНИИВВиМ 1,2×10⁷ выжила пала пала

Данные таблиц свидетельствуют о том, что спектр защитного действия штамма 363/11 шире, чем у штамма 55-ВНИИВВиМ. Т.е. иммунизация животных штаммом 363/11, в отличие от штамма 55-ВНИИВВиМ предохраняет их от заражения полевыми изолятами В. anthracis, иммунологически не соответствующими штамму 55-ВНИИВВиМ (№№304 и 81).

Источники информации

1. Ашмарин, И.П. Статистические методы в микробиологических исследованиях / И.П. Ашмарин, А.А. Воробьев. - Л.: Медгиз, 1962. - С.85.

2. Бакулов, И.А. Иммунопрофилактика сибирской язвы животных /И.А. Бакулов, В.А. Гаврилов // Вести, с.-х. науки. - 1991. - №8. - С.128-131.

3. Селянинов, Ю.О. О некоторых причинах недостаточной эффективности мероприятий по специфической профилактике сибирской язвы в РФ / Ю.О. Селянинов, И.Ю. Егорова // Актуальные проблемы болезней, общих для человека и животных: Матер. Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участ. - Ставрополь. - 2012. - С.69-70.

4. Сибирская язва: актуальные аспекты микробиологии, эпидемиологии, клиники, диагностики, лечения и профилактики / Г.Г. Онищенко [и др.] - М.: ВУНМЦ МЗ РФ, 1999. - 448 с.

5. Шляхов, Э.Н. Эпидемиология, диагностика и профилактика сибирской язвы / Э.Н. Шляхов. - Кишинев: Картя Молдовеняскэ, 1960. - 116 с.

6. Шляхов, Э.Н. Титрация ЛД₅₀ на мышах как метод определения вирулентности сибиреязвенных бацилл / Э.Н. Шляхов, Е.В. Груз // Достижения и перспективы борьбы с сибирской язвой в СССР: Матер. Х пленарного заседания межведомственной комиссии по борьбе с сибирской язвой. - М., 1978. - С.97-99.

7. Slavtchev, R.S. Etude comparative de la propriete oedematogene L′une nouvelle souche acapsulogene de Bacillus anthracis (souche Ihtiman) / R.S. Slavtchev // Arch. Inst. Pasteur, Tunis. - 1967. - V.44, №2-3. - P.229-233.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к бескапсульному природно-ослабленному штамму Bacillus anthracis. Штамм В. anthracis 363/11 депонирован в коллекции штаммов микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии под №363. Штамм предназначен для разработки средств специфической профилактики сибирской язвы. Изобретение позволяет расширить спектр защитного действия, увеличить иммуногенность, уменьшить иммунизирующую дозу и реактогенность вакцинного штамма против сибирской язвы. 5 табл., 5 пр.

Аттенуированный штамм 363/11 В.anthracis для разработки средств специфической профилактики сибирской язвы, депонирован в Коллекции микроорганизмов ГНУ Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии под №363.