СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КЛЕТОЧНЫХ ФРАКЦИЙ ДЛЯ ИСКУССТВЕННОГО РАЗМНОЖЕНИЯ ЖИВОТНЫХ Российский патент 1999 года по МПК A01K67/02 A61D19/02 

Изобретение относится к способам искусственного размножения животных и может быть использовано в экспериментальной биологии и медицине, в животноводстве и рыбоводстве.

Известен метод пересадки ядер соматических клеток в энуклеированные яйца животных. В частности, для Xenopus laevis ядра берут из клеток кишечного эпителия питающихся головастиков (см. Gurdon J.B., The developmental capacity of nuclei taken from intestinal epithelium cells of feeding tadpoles, J. Embryol exp Morph 10, 622 - 640 (1962)).

Клетку донора всасывают в микропипетку, где происходит разрыв клеточной оболочки, затем ядро с окружающей его цитоплазмой вводят в яйцо.

К недостаткам этого способа, на наш взгляд, следует отнести:
- трудоемкость и длительность методики выполнения,
- малая вероятность оплодотворения (2 - 3% от общего числа яиц),
- применение дорогой и сложной аппаратуры,
- большой опыт специалиста.

Целью изобретения является искусственное размножение животных.

Поставленная цель достигается с помощью клеточных фракций донорских клеток, инъецированных в энуклеированные и неэнуклеированные яйцеклетки реципиента. Существенным отличительным признаком заявляемого способа является применение фильтров с диаметром пор, равным диаметру ядер клеток, через которые фильтруют суспензию донорских клеток перед инъецированием в энуклеированные и неэнуклеированные яйцеклетки реципиента.

Способ осуществляют следующим образом.

В качестве доноров соматических клеток используют органы 10-дневного куриного эмбриона.

Устанавливают яйца так, чтобы конец с воздушным мешком был сверху, и оставляют под ультрафиолетом 10 минут.

Протирают яйца 70%-ным спиртовым раствором. Разбивают скорлупу над воздушным мешком и осколки скорлупы удаляют стерильным пинцетом. Затем удаляют скорлуповую мембрану и хориоаллантоисную мембрану, используя при этом стерильный пинцет. С помощью пары изогнутых пинцетов переносят эмбрион за шею в чашку Петри, диаметром 90 мм. Асептически выделяют донорский орган (печень или тонкий кишечник) и переносят его в фосфатно-солевой буфер - А. Дюльбекко (в 1 литре раствора содержатся 10,0 грамм натрия хлорида, 0,25 грамм калия хлорида, 1,44 грамм натрия гидрофосфата и 0,25 грамм калия дигидрофосфата) (ФСБ-А), в установленную на весах чашку Петри, повторяя операцию до тех пор, пока не наберется 1 грамм ткани.

Разрезают на маленькие кусочки с помощью тонких ножниц, сливают среду и добавляют 9 - 10 миллилитров ФСБ-А с 0,25%-ным раствором трипсина при 37^oC. Инкубируют 15 минут при 37^oC в термостате, насыщенном парами воды. Для этого помещают в термостат кювету с водой, обеспечивающую высокую влажность и препятствующую испарению воды из чашки с тканью. Сливают раствор трипсина и промывают дважды свежим ФСБ-А при комнатной температуре в небольшом сосуде.

Немедленно диссоциируют ткань в небольшом объеме ФСБ-А путем многократного пипетирования. Достаточно 10-кратного пропускания клеточной суспензии через иглу шприца. Дают осесть недиссоциированным фрагментам ткани и удаляют их.

Затем помещают клеточную суспензию на фильтр и фильтруют ее под атмосферным давлением, либо производят фильтрацию следующим образом:
В центрифужную пробирку помещают небольшое количество стерильного раствора ФСБ-А и фиксируют в ней фильтровальную перегородку из любого материала, нетоксичного, для клеток. После чего помещают клеточную суспензию и центрифугируют. Время центрифугирования, количество оборотов и размеры пор в фильтрах зависят от культуры ткани, ее возраста и размеров клеточных органоидов. Полученный фильтрат вводят в энуклеированные и в неэнуклеированные неоплодотворенные куриные яйца в хориоаллантоисную оболочку. Скорлупу яиц предварительно обрабатывают 70%-ным спиртовым раствором.

Инактивацию ядер яйца проводят механическим способом (раскаленной иглой), химическим (ДНК-аза) или физическим (радиационное облучение) с помощью терапевтического аппарата "Луч 1" в суммарной дозе 6 Гр и более при мощности излучения 0,01 Гр/с.

Количество вводимого фильтрата составляет 0,1 мл. После инъекции отверстие заклеивают стерильным пластырем, смазав края стерильным парафином. Яйца инкубируют при температуре 37,5 - 39,5^oC и влажности 50 - 70% (см. табл. I и II).

Преимуществами предлагаемого способа по сравнению с известным является:
- Высокая вероятность оплодотворения яиц (28 - 30%).

- Значительное сокращение сроков осуществления способа.

- Наименьшие материальные затраты.

- Простота способа выполнения.

Изобретение относится к способам искусственного размножения животных и может быть использовано в экспериментальной биологии и медицине, в животноводстве и рыбоводстве. В энуклеированные и неэнуклеированные яйцеклетки реципиента инъецируют клеточные фракции донорских клеток, полученные с помощью фильтров с диаметром пор, равным диаметру ядер клеток. Способ прост в выполнении, значительно сокращает сроки его осуществления и повышает вероятность оплодотворения яиц. 2 табл.

Способ получения клеточных фракций для искусственного размножения животных, включающий отбор клеток и последующее инъецирование их в энуклеированные и неэнуклеированные яйцеклетки реципиента, отличающийся тем, что перед инъецированием в энуклеированные и неэнуклеированные яйцеклетки реципиента суспензию донорских клеток пропускают через фильтры с диаметром пор, равным диаметру ядер клеток.