СПОСОБ ВВЕДЕНИЯ ПРИМОРДИАЛЬНЫХ ПОЛОВЫХ КЛЕТОК ПТИЦ В ЭМБРИОН "IN OVO" Российский патент 2024 года по МПК C12N5/07 C12N5/10 C12N5/16 A01K67/00 

Изобретение относится к области технологий живых систем, в частности, к группе клеточных технологий получения и введения донорских эмбриональных примордиальных половых клеток птиц без переноса содержимого яйца в специализированную кювету [C12N 5/00, A01K 41/00, A01K 67/00, G01N 1/00].

Из уровня техники известна ПЕРЕДАЧА ПО ЗАРОДЫШЕВОЙ ЛИНИИ ПЕРВИЧНЫХ ПОЛОВЫХ КЛЕТОК ЦЫПЛЯТ (PGCS) [US 2017086431 (A1), ОПУБЛ. 30.03.2017], при которой один трансфицированный PGC получают путем прямого культивирования цельной крови, полученной из куриного эмбриона на стадии 12-17, пассированного в течение по меньшей мере 40 дней in vitro.

Недостатком данного метода является то, что примордиальные половые клетки получают из крови куриного эмбриона путем вскрытия скорлупы яйца и перемещения содержимого яйца в специализированную кювету, что приводит к чрезмерной травматизации и микробной контаминации эмбриона курицы.

Также известны СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕРВИЧНЫХ ПОЛОВЫХ КЛЕТОК И ТРАНСГЕННЫХ ВИДОВ ЖИВОТНЫХ [WO 1998016630 (A1), ОПУБЛ. 1998-04-23], включающие создание клеточных линий, происходящих из первичных зародышевых клеток, трансформацию первичных зародышевых клеток и клеточных линий, происходящих из первичных зародышевых клеток, и использование этих трансформированных клеток и клеточных линий для создания трансгенных видов животных, не являющихся грызунами.

Недостатком данного метода является то, что примордиальные половые клетки получают из крови куриного эмбриона путем вскрытия скорлупы яйца и перемещения содержимого яйца в специализированную кювету, что приводит к чрезмерной травматизации и микробной контаминации эмбриона курицы.

Наиболее близким по технической сущности является СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ ПЕРВИЧНЫХ ЗАРОДЫШЕВЫХ КЛЕТОК КУРИЦЫ ДЛЯ СОХРАНЕНИЯ СЕМЕННОГО РЕСУРСА ШТАММА [CN 116410933 (A), ОПУБЛ. 11.07.2023], включающий следующие этапы: отбор свежих яиц с зеленой скорлупой в качестве доноров развитых до 180 часов, вскрытие яичной скорлупы, вынимание куриного эмбриона и исследование его под микроскопом, отделение гонад после развития куриных эмбрионов до 132 часов, расщепление гонад на отдельные клетки трипсином, фильтрация отдельных клеток через сито с ячейками 40 мк и культивирование отдельных клеток при плотности 900 клеток на микролитр культуральной среды, замораживание в жидком азоте, и размораживание путем добавления свежей суспензии, а также инъекция примордиальных зародышевых клеток цыплят белоногим цыплятам, которые развиваются в течение 60 часов, методом периферической сосудистой инъекции и непрерывного вылупления, при этом количество инъекционных клеток составляет 20000-30000, защита ресурсов штамма слоя зеленой скорлупы каждого инъекция эмбрионов.

Основной технической проблемой прототипа, содержащего этапы получения примордиальных клеток и получения химерных цыплят, является то, что примордиальные половые клетки получают из крови куриного эмбриона путем вскрытия скорлупы яйца и перемещения содержимого яйца в специализированную кювету, что приводит к чрезмерной травматизации и микробной контаминации эмбриона курицы, а также низкое количество полученных примордиальных половых клеток данным способом, которое обусловлено тем, что количество примордиальных половых клеток в гонадах на стадии формирования низкое, поскольку они дифференцируются и участвуют в закладке ткани гонад, а большая их часть до 7 дня культивирования циркулирует в кровяном русле эмбриона.

Задача изобретения является устранение недостатков прототипа.

Технический результат изобретения заключается в увеличении эффективности процессов переноса примордиальных половых клеток реципиенту и получения эмбрионов птиц и цыплят с введенными донорскими (возможно генетически отредактированными) примордиальными половыми клетками за счет значительного снижения уровня травматизации эмбриона, а также уменьшения микробной контаминации, следовательно, в повышении выживаемости эмбрионов, а также в увеличении количества полученных примордиальных половых клеток с одного эмбриона.

1. Указанный технический результат достигается за счет того, что способ получения примордиальных половых клеток птиц и введения их в эмбрион in ovo характеризуется тем, что отбирают и инкубируют яйца птицы, проводят круговой надпил скорлупы яйца птицы, затем через отверстие в скорлупе яйца микроинъектором со стеклянной микроиглой из дорсальной аорты эмбриона птицы отбирают образец крови для культивирования, для введения примордиальных половых клеток кур с отредактированным геномом, в эмбрион-реципиент осуществляют круговой надпил скорлупы яйца-реципиента, далее через отверстие в скорлупе яйца-реципиента с помощью микроинъектора со стеклянной микроиглой, заполненной примордиальными половыми клетками, проводят инъекцию в дорсальную аорту эмбриона-реципиента примордиальных половых клеток.

В частности, используют яйца индейки, курицы, перепела, фазана или утки, а также диких редких и исчезающих видов птиц.

В частности, инкубацию проводят до получения эмбриона птицы на стадии 13-14 по Гамбургеру-Гамильтону.

В частности, иглу при отборе образца крови из дорсальной аорты эмбриона или инъекции примордиальных половых клеток в дорсальную аорту эмбриона проводят параллельно артерии, против направления кровотока эмбриона.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 представлен способ получения нативных примордиальных половых клеток и введения донорских примордиальных половых клеток in ovo.

Осуществление изобретения

Способ получения примордиальных половых клеток птиц и введения их в эмбрион in ovo относится к биотехнологии и может быть использован для переноса донорских примордиальных половых клеток птиц, в том числе с отредактированным геномом, в эмбрионы-реципиенты, а также для получения стабильной эмбриональной клеточной линии примордиальных половых клеток птиц. Способ получения и введения примордиальных половых клеток птиц включает следующие этапы: отбор и подготовка яиц для инкубации, инкубация, вскрытие яйца и введение клеток или получение образцов крови, культивирование в специально подобранной среде с добавлением фактором роста клеток, оценка и подсчет примордиальных половых клеток, выделенных из эмбриона, криоконсервация и размораживание полученных примордиальных половых клеток.

Данный способ позволяет получить примордиальные половые клетки из кровотока эмбриона на 4-5 день культивирования в максимальном количестве. Кроме того, на данном этапе культивирования еще не запущены процессы дифференциации примордиальных половых клеток, что позволяет получить клетки с высоким уровнем плюрипотентности.

В случае получения примордиальных половых клеток общепринятыми методами ферментативной обработки и механической диссоциации в культуре клеток, кроме примордиальных половых клеток присутствуют эмбриональные фибробласты, оставшиеся в клеточной суспензии после отделения других клеток, поскольку эти методы предполагают диссоциацию целого эмбриона, в котором присутствует набор клеток всех типов. Преимущество метода in ovo перед общепринятыми методами заключается в том, что при получении PGC через дорсальную аорту на 4-5 сутки инкубации методом in ovo, в образце присутствуют клетки крови, которые в течении 10 дней деградируют и остаются только PGC. Наличие PGC в культуре подтверждено с помощью анализа экспрессии специфичных для PGC генов.

Способ получения примордиальных половых клеток птиц и введения их в эмбрион in ovo осуществляется следующим образом.

Первым этапом производят отбор неповрежденных и без дефектов яиц птиц в течение двух-трех дней до инкубации. Затем яйца перед закладкой в инкубатор дезинфицируют 70% раствором этанола и маркируют с указанием на них даты закладки, индивидуального номера и породы птицы. Инкубацию проводят до получения эмбриона птицы на стадии 13-14 по Гамбургеру-Гамильтону.

После инкубации проводится вскрытие яйца и яйца-реципиента с помощью электроинструмента дремель. С тупого конца яиц осуществляется круговой надпил скорлупы без повреждения оболочечной мембраны, отделяющей воздушный мешок от эмбриона. Через полученное отверстие с помощью микроинъектора со стеклянной микроиглой из дорсальной аорты эмбриона птицы отбирают образец крови. В то же время при введении донорских примордиальных половых клеток в эмбрион-реципиент в микроиглу предварительно набирается отмытый в PBS и сконцентрированный с помощью центрифугирования образец прокультивированных примордиальных половых клеток и инъецируется в дорсальную аорту эмбриона-реципиента. Не осуществляют перенос содержимого из яйца в специализированную кювету, все манипуляции (получение и введение) проводят внутри яйца под невскрытой оболочечной пленкой. Иглу при отборе образца крови из дорсальной аорты эмбриона или инъекции примордиальных половых клеток в дорсальную аорту эмбриона вводят параллельно артерии, против направления кровотока, которое хорошо видно при выведении изображения на экран (фиг. 1).

Отобранные из эмбриона пробы крови вносят в подготовленные пробирки с культуральной средой и хранят в термошкафу при температуре 37°C до момента переноса на культуральный планшет. Дальнейшие работы с примордиальными половыми клетками птиц с момента переноса образцов из пробирок в культуральные планшеты проводятся в стерильных условиях под ламинаром. Следующим этапом проводят культивирование примордиальных половых клеток в луночном планшете с культуральной средой с факторами роста клеток при температуре 37°С в течение 21 дня. После 10 дней культивирования в культуре примордиальных половых клеток не идентифицируются эмбриональные клетки других типов, поэтому с 10-12 дня культивирования примордиальных половых осуществляется количественная оценка культур примордиальных половых клеток, поскольку сразу после взятия образца крови из эмбриона птицы примордиальные клетки не видны, так как их количество в образце невелико по отношению к форменным элементам крови, и они полностью закрыты клетками крови. Способ дает возможность получить примордиальные половые клетки с концентрацией 1,5-2 млн из одного эмбриона.

Для обеспечения длительного хранения полученных примордиальных половых клеток с целью создания биоресурсных коллекций, а также для хранения материала для биотехнологических процедур, например, для редактирования генома, используют методы криоконсервации и хранения в жидком азоте. Для проведения декриоконсервации примордиальных половых клеток пробирки с замороженной суспензией клеток достают пинцетом из жидкого азота, выдерживают при комнатной температуре до прекращения парения и размораживают, погружая в водяную баню при +4°С.

Пример использования изобретения.

Способ получения примордиальных половых клеток птиц и введения их в эмбрион in ovo используется для получения линии примордиальных половых клеток курицы, которые после культивирования могут быть подвергнуты процессу генного редактирования, после чего введены данным методом in ovo в эмбрион-реципиент, или введению нативных культивируемых примордиальных половых клеток в эмбрионы-реципиенты с целью сохранения редких и исчезающих пород и диких видов птиц.

В иных вариантах исполнения данного способа проводят получение и введение примордиальных половых клеток индейки, перепела, фазана или утки, а также диких редких и исчезающих видов птиц.

Представленные варианты реализации заявленного изобретения с использованием яиц разных видов птиц позволяют достичь технический результат, так как обеспечивается повышение выживаемости эмбрионов птиц, увеличение количества полученных примордиальных половых клеток с одного эмбриона, а также увеличение эффективности процессов переноса примордиальных половых клеток реципиенту.

У заранее подготовленных и проинкубированных куриных яиц и куриных яиц-реципиентов вскрывают скорлупу с тупого конца яйца с помощью электроинструмента дремель. Осуществляется круговой надпил скорлупы диаметром 10-15 мм без повреждения оболочечной мембраны. Через данное отверстие под бинокуляром с помощью микроинъектора со стеклянной микроиглой из дорсальной аорты эмбриона курицы отбирают образец крови в объеме 3-5 мкл. В случае введения донорских примордиальных половых клеток в виде суспензии в объеме до 5 мкл делают инъекцию в дорсальную аорту эмбриона-реципиента курицы. Микроинъекции проводят против направления кровотока эмбрионов.

В первом случае отобранный образец крови вносят в подготовленные пробирки с культуральной средой и отправляют далее на культивирование и длительное хранение для дальнейшего использования. Во втором случае после введения примордиальных половых клеток в эмбрион курицы отверстие в яйце закрывают и яйцо инкубируют до вылупления.

Технический результат изобретения заключается в увеличении эффективности процессов переноса примордиальных половых клеток реципиенту и получения эмбрионов птиц и цыплят с введенными донорскими (возможно генетически отредактированными) примордиальными половыми клетками за счет значительного снижения уровня травматизации эмбриона, а также уменьшения микробной контаминации, следовательно, в повышении выживаемости эмбрионов, а также в увеличении количества полученных примордиальных половых клеток с одного эмбриона.

Указанный технический результат достигается за счет того, что способ получения примордиальных половых клеток птиц и введения их в эмбрион in ovo характеризуется тем, что отбирают и инкубируют яйца птицы, проводят круговой надпил скорлупы яйца птицы, затем через отверстие в скорлупе яйца микроинъектором со стеклянной микроиглой из дорсальной аорты эмбриона птицы отбирают образец крови для культивирования, для введения примордиальных половых клеток кур с отредактированным геномом, в эмбрион-реципиент осуществляют круговой надпил скорлупы яйца-реципиента, далее через отверстие в скорлупе яйца-реципиента с помощью микроинъектора со стеклянной микроиглой, заполненной примордиальными половыми клетками, проводят инъекцию в дорсальную аорту эмбриона-реципиента примордиальных половых клеток.

Для подтверждения достижения технического результата провели количественное определение числа полученных примордиальных половых клеток и количества выживших эмбрионов куриц после получения и введения примордиальных половых клеток. Исследования проводили заявленным способом без извлечения содержимого яйца в специализированную кювету и способом прототипа на 100 яйцах (по 50 яиц на каждый способ). По результатам исследований в полученном образце заявленным способом среднее количество примордиальных половых клеток от одного эмбриона составила около 1,5 млн клеток/эмбрион, в то же время получить способом прототипа удалось только чуть более чем 2000 клеток/эмбрион. В первом случае (заявленный способ) количество выживших эмбрионов составила 48 эмбрионов из 50, а во втором случае (прототип) выжило всего 29 эмбрионов из 50 исследуемых.

Таким образом, заявленное изобретение позволяет увеличить эффективность процессов переноса примордиальных половых клеток реципиенту и получения эмбрионов птиц и цыплят с введенными донорскими, уменьшить уровень травматизации эмбриона и микробную контаминацию за счет отсутствия переноса содержимого яйца в специализированную кювету для взятия образца крови эмбриона и введения примордиальных половых клеток в аорту эмбриона-реципиента, а также повысить выживаемость эмбрионов на 38% в сравнении с прототипом, увеличить количество полученных примордиальных половых клеток с одного эмбриона в 750 раз и увеличить эффективность процессов переноса примордиальных половых клеток эмбриону реципиенту.

Изобретение относится к области технологий живых систем, в частности к группе клеточных технологий получения и введения донорских эмбриональных примордиальных половых клеток птиц без переноса содержимого яйца в специализированную кювету. Получают примордиальные половые клетки птиц путем отбора и инкубации яиц птиц, проводят круговой надпил скорлупы яйца птицы, через отверстие в скорлупе яйца под невскрытой оболочечной пленкой микроинъектором со стеклянной микроиглой из дорсальной аорты эмбриона птицы отбирают образец крови для культивирования. Причем при отборе образца крови из дорсальной аорты эмбриона иглу вводят параллельно артерии, против направления кровотока. Отобранные из эмбриона пробы крови вносят в подготовленные пробирки с культуральной средой и хранят в термошкафу при температуре 37°C до момента переноса на культуральный планшет. Проводят культивирование примордиальных половых клеток в луночном планшете с культуральной средой с факторами роста клеток при температуре 37°С в течение 21 дня. Осуществляют количественную оценку культур примордиальных половых клеток, затем для введения примордиальных половых клеток птиц с отредактированным геномом в эмбрион-реципиент осуществляют круговой надпил скорлупы яйца-реципиента. Далее через отверстие в скорлупе яйца-реципиента под невскрытой оболочечной пленкой с помощью микроинъектора со стеклянной микроиглой, заполненной примордиальными половыми клетками, проводят инъекцию в дорсальную аорту эмбриона-реципиента примордиальных половых клеток. Причем иглу вводят параллельно артерии, против направления кровотока. Изобретение обеспечивает увеличение эффективности процессов получения и переноса примордиальных половых клеток реципиенту и получения эмбрионов птиц и цыплят с введенными донорскими, возможно генетически отредактированными, примордиальными половыми клетками за счет значительного снижения уровня травматизации эмбриона, а также уменьшения микробной контаминации, следовательно, повышение выживаемости эмбрионов, а также увеличение количества полученных примордиальных половых клеток с одного эмбриона. 1 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 пр.

1. Способ введения примордиальных половых клеток птиц в эмбрион in ovo, характеризующийся тем, что получают примордиальные половые клетки птиц путем отбора и инкубации яиц птиц, проведения кругового надпила скорлупы яйца птицы, через отверстие в скорлупе яйца под невскрытой оболочечной пленкой микроинъектором со стеклянной микроиглой из дорсальной аорты эмбриона птицы отбирают образец крови для культивирования, причем при отборе образца крови из дорсальной аорты эмбриона иглу вводят параллельно артерии, против направления кровотока, отобранные из эмбриона пробы крови вносят в подготовленные пробирки с культуральной средой и хранят в термошкафу при температуре 37°C до момента переноса на культуральный планшет, проводят культивирование примордиальных половых клеток в луночном планшете с культуральной средой с факторами роста клеток при температуре 37°С в течение 21 дня, осуществляют количественную оценку культур примордиальных половых клеток, затем для введения примордиальных половых клеток птиц с отредактированным геномом в эмбрион-реципиент осуществляют круговой надпил скорлупы яйца-реципиента, далее через отверстие в скорлупе яйца-реципиента под невскрытой оболочечной пленкой с помощью микроинъектора со стеклянной микроиглой, заполненной примордиальными половыми клетками, проводят инъекцию в дорсальную аорту эмбриона-реципиента примордиальных половых клеток, причем иглу вводят параллельно артерии, против направления кровотока.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что используют яйца индейки, курицы, перепела, фазана или утки, а также диких редких и исчезающих видов птиц.