СПОСОБ КРУПНОМАСШТАБНОГО ПРОИЗВОДСТВА УСТОЙЧИВОЙ ПРИ ХРАНЕНИИ КОМПОЗИЦИИ ТРОМБИНА ТЕРАПЕВТИЧЕСКОЙ СТЕПЕНИ ЧИСТОТЫ Российский патент 2000 года по МПК C12N9/74 A61K35/16 A61K38/48 

1. Область изобретения
Изобретение относится к продуктам тромбина терапевтической степени чистоты для клинического (включая ветеринарное) использования. Тромбин характеризуется высокой вирусной безопасностью, высокой удельной активностью, устойчивостью при хранении и низкой пирогенностью. Изобретение далее относится к способам получения продуктов тромбина, которые являются эффективными, экономичными и достаточно пригодными для производства в коммерческом масштабе.

Тромбин широко используется в клинической практике в качестве фактора свертывания для остановки кровотечения из ран путем превращения фибриногена в фибрин. Он является обычным компонентом хирургических повязок и использовался в комбинации с фибриногеном и другими белками свертывания в двухкомпонентных гемостатических системах, таких как фибриновые клеи, лейкопластыри и герметики. Как плазма человека, так и бычья плазма, признаны в качестве источника тромбина для клинического использования у людей. Однако в значительной степени вследствие трудности очистки тромбина из неаутологичной плазмы человека, которая обеспечивала бы существенное удаление или инактивацию любых вирусов, которые могут присутствовать в исходной плазме, продукты тромбина терапевтической степени чистоты для использования у человека, которые в большинстве случаев имеются в продаже, получены из бычьей плазмы. Бычья плазма имеет низкий свойственный ей потенциал накопления патогенных для людей вирусов, несмотря на общепризнанный иммуногенный потенциал бычьего тромбина у людей, который имеет большое клиническое значение.

Для клинического использования тромбин, как правило, получают из плазмы крови в виде белкового комплекса с протромбином, обычно с последующим превращением профермента в тромбин путем реакции с тромбопластином в присутствии ионов кальция. Неочищенный продукт тромбина затем обрабатывают для отделения тромбина от загрязняющих белков крови и для инактивации или удаления любых токсинов или патогенов, которые могут присутствовать. В идеале выделенный продукт является тромбином терапевтической степени чистоты (тромбин, соответствующий стандартам Администрации пищевых продуктов и лекарственных препаратов США, для использования у людей), который имеет высокую удельную активность, хорошую устойчивость при хранении, низкую пирогенность и который по существу свободен от вирусов.

Этот идеал встречается редко, если вообще встречается. При способах очистки, которые, как правило, используются для получения тромбина терапевтической степени чистоты, выделение тромбина высокой очистки обычно достигается за счет значительных количеств активного тромбина вследствие потери или инактивации тромбина в исходном материале во время очистки. В менее чистых продуктах присутствие посторонних белков плазмы (либо бычьих, или не аутологичных белков человека), повышает опасность вероятно тяжелых иммунологических реакций у пациента, и, как правило, неблагоприятно влияет на свойства продукта. В частности, используемые в настоящее время способы очистки, как правило, позволяют производить очистку только очень ограниченного количества плазмы в плане вирусных загрязнителей, без неприемлемой потери активности тромбина. Кроме того, многие способы очистки тромбина, которые, как сообщалось, являются сравнительно эффективными в лабораторных условиях для получения терапевтически привлекательных продуктов тромбина, непригодны для экономичного широкомасштабного коммерческого производства. В результате этого продукты тромбина, которые были предложены для клинического использования у людей, в различной степени представляют значительную опасность токсического действия, не обладают стойкой высокой эффективностью и/или требуют применения сложных способов получения, которые неприменимы при широкомасштабном производстве. Кроме того, у известных способов очистки или их продуктов нет многосторонности в применении: например, продукты как практический материал, как правило, неприменимы в ветеринарной практике, а способы слишком сложны или неэффективны для использования в клинических учреждениях для очистки аутологичной плазмы.

2. ОБСУЖДЕНИЕ ПРЕДШЕСТВУЮЩЕГО УРОВНЯ ТЕХНИКИ
Тромбин обычно очищается из неочищенного продукта тромбина с помощью хроматографии с использованием в качестве разделительных сред различных ионообменных полимеров, в частности, активированных полисахаридов, таких как агароза, декстран или целлюлоза. Для получения продукта тромбина, имеющего адекватно высокую удельную активность, из исходного материала неочищенного тромбина обычно используется многоэтапная хроматография с перемежающимся использованием анионно- и катионообменных сред, например, ДЭАЭ (диэтиламиноэтил) Sepharose^® в качестве анионообменной среды и СМ или S-Sepharose^® в качестве катионообменной среды (см. патент США 5 149 540, выданный Kunihiro et al, 22 сентября 1992 г. или патент США 4 965 203, выданный Silbering et al, 23 октября 1990 г.). Эти множественные этапы хроматографии связаны с затратами времени, увеличивают стоимость этого способа и часто неприемлемы для широкомасштабного производства тромбина терапевтической степени чистоты.

Как известно в этой области, тромбин может обрабатываться в ходе процедуры очистки для инактивации содержащих липиды вирионов композицией растворителя-детергента (РД), включающего неионный детергент и органический растворитель, способный разрушать вирусные липиды, и инактивировать вирус без денатурации тромбина. Хотя такие очищенные продукты тромбина иногда характеризуются как "безвирусные" (см., например, Европейский патент ЕР 0 443 724 A1, опубликованный 28 августа 1991 г.), они часто таковыми не являются. Хотя обработка РД материала, содержащего тромбин, обычно эффективна для инактивации имеющих оболочку вирионов, лишенные оболочки вирионы, такие как парвовирусы, не инактивируются этим способом, и любые такие вирионы, присутствующие в исходном материале, могут быть пронесены через весь процесс очистки и остаться активными в конечном продукте тромбина, представляя клиническую опасность. Хотя эта проблема была признана, ее трудно было решить, поскольку другие стандартные способы обработки для инактивации вирусов, такие как нагревание или ультрафиолетовое облучение, также инактивируют тромбин, с неприемлемой потерей активного тромбина для коммерческого применения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение соответственно обеспечивает при достаточном выходе продукта устойчивый при хранении концентрат тромбина терапевтической степени чистоты, имеющий высокую удельную активность и низкую пирогенность, в значительной степени очищенный от вирионов. Процесс очистки включает этапы: 1) инкубации исходного материала неочищенного тромбина с уничтожающей вирусы композицией для инактивации имеющих оболочку вирионов, содержащих липиды; 2) последовательной ионообменной хроматографии инкубированного материала на одной катионообменной среде с использованием возрастающих концентраций солевого раствора и активированной сульфалкилом полисахаридной среды, такой как агароза, декстран или целлюлоза, имеющей высокое избирательное сродство к тромбину, с выделением конечного элюата, содержащего солевой раствор тромбина, высоко очищенный в плане загрязнителей, включая другие белки крови, токсины, содержащие липиды вирионы с оболочкой и остаток вирицидного препарата; 3) замены фосфатного хроматографического буфера конечного элюата на физиологически совместимую буферную композицию для получения композиционного раствора высоко очищенного тромбина; 4) фильтрации композиционного раствора тромбина через мембранный противовирусный фильтр для удаления не содержащих липиды вирионов; 5) необязательной обработки сухим жаром профильтрованного и лиофилизированного тромбина для обеспечения инактивации любых возможных остающихся вирионов (инфекционные вирусные материалы). Примерами являются водные солевые композиционные буферы с pH приблизительно от 7,2 до 7,4, включающие соль лимонной кислоты и 1) бычий альбумин для бычьего тромбина, предназначенного для применения в ветеринарии, или 2) альбумин человека для бычьего и человеческого тромбина, предназначенного для применения у людей. Композиционные растворы изобретения (более подробно описанные ниже) наряду с другим широко способствуют стабилизации ферментативной активности тромбина во время постхроматографической обработки и во время хранения; использованная композиция также стабилизирует тромбин от потери активности во время противовирусной обработки сухим жаром в соответствии с этапом (5).

Продукт представляет собой устойчивый при хранении тромбин терапевтической степени чистоты с высокой вирусной безопасностью и удельной активностью для использования в общей клинической практике, включая использование в ветеринарии. Высокая удельная активность в сочетании с достаточным выходом продукта отражает эффективность способа очистки необработанного тромбина в плане загрязняющих белков, других посторонних и потенциально токсичных компонентов исходного материала, остатков уничтожающей вирусы композиции и вирионов, без существенной потери или инактивации исходного тромбина. Обычно достигается уровень остатков уничтожающей вирусы композиции менее приблизительно 15 мкг/г. Была достигнута устойчивость продукта против существенной потери активности, в течение, по крайней мере, года при хранении при температуре приблизительно 4^oС. Способ применим для тромбина из любого полезного источника, в частности, человеческого и бычьего, и особенно полезен для широкомасштабного производства тромбина терапевтической степени чистоты. Для применений, при которых не требуется в значительной степени полная вирусная безопасность продукта, или напротив, когда вирусная безопасность не считается проблемой, фильтрация через противовирусные фильтры и тепловая обработка (этапы 4 и 5) могут быть пропущены.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В примере варианта воплощения изобретения для клинического использования у людей препарат необработанного тромбина человека сначала инкубируют с разрушающей липиды уничтожающей вирусы композицией для инактивации вирионов, содержащих липиды. Обработанный препарат затем последовательно очищают ионообменной хроматографией с использованием сульфопропил-Spherodex^® в качестве единственной адсорбционной среды, и возрастающих концентраций солевого раствора при каждом пассаже, для получения конечного элюата, включающего концентрированный раствор тромбина, в значительной степени очищенный в плане активных, содержащих липиды вирионов, загрязняющих белки, и остатков уничтожающей вирусы композиции. В собранный раствор с максимальной концентрацией тромбина добавляют стабилизирующий альбумин и затем производят замену хроматографического буфера на композиционный буферный раствор путем диафильтрации. Полученный в результате композиционный раствор тромбина, включающий композиционные буферные компоненты, альбумин, воду и очищенный тромбин, затем фильтруют для удаления не содержащих липиды вирионов. Очищенный от вирусов тромбин затем растворяют до требуемой концентрации в композиционном буфере, конечную концентрацию стабилизирующего альбумина доводят до 2%, раствор стерилизуют фильтрацией, лиофилизируют и хранят приблизительно при 4^oC. Для обеспечения получения свободного от вириона продукта отфильтрованный от вирусов, лиофилизированный тромбин подвергают обработке сухим жаром при температуре приблизительно 100^oC для инактивации любых остающихся активных вирусов.

ПРЕПАРАТ НЕОБРАБОТАННОГО ТРОМБИНА
Любой подходящий препарат, содержащий тромбин, может использоваться в качестве исходного материала для реализации способа изобретения, включая закупленные препараты. Настоящее изобретение делает возможным безопасное использование плазмы человека в качестве источника тромбина, и для клинического использования у людей, соответственно, в целом предпочтительна плазма человека, так как это уменьшает опасность аллергических реакций у реципиента. Бычья плазма является в целом предпочтительным исходным материалом для продуктов тромбина, в соответствии с изобретением, для использования в ветеринарии. Как известно в данной области, необработанный тромбин можно получить из подкисленной свежей плазмы, криосупернатанта, супернатанта после солевой преципитации или из любой другой фракции плазмы, содержащей этот белок. Пример способа получения исходного материала необработанного тромбина, полезный в настоящем изобретении, описан в Ann. pharma-ceutique francaise 48 (part 3): 129-1,1990. В широком смысле описанный способ включает разведение исходной плазмы или фракции плазмы дистиллированной водой для уменьшения концентрации соли ниже приблизительно 10% первоначальной концентрации в свежей плазме с доведением pH разведенного раствора до уровня приблизительно 5,3; центрифугирование раствора для получения преципитата, содержащего неочищенный тромбин; растворение преципитата в растворе NaCl с доводкой pH приблизительно до 7,0; добавление ионов кальция в полученный в результате раствор с инкубацией по крайней мере в течение приблизительно 2 часов при комнатной температуре для превращения протромбина в тромбин. Раствор тромбина затем центрифугируют для получения надосадочной жидкости, содержащей неочищенный тромбин, пригодный для использования в качестве исходного материала для изобретения; затем надосадочную жидкость смешивают с уничтожающей вирусы композицией, как описано ниже, и преципитат выбрасывают. В предпочтительном варианте воплощения, особенно применимом для широкомасштабного производства тромбина, описанный выше способ усовершенствуется в соответствии с настоящим изобретением, путем использования диафильтрации, в частности, диафильтрации с использованием приблизительно 0,015 М раствора NaCl вместо воды в качестве буфера для восполнения, с целью уменьшения концентрации соли в исходной плазме, в то же время сохраняя почти первоначальный объем материала; диафильтрация может включать либо ультрафильтрацию постоянного объема с продолжающимся добавлением свежего буфера, или повторную ультрафильтрацию с добавлением свежего буфера после каждого цикла концентрирования. Это эффективно уменьшает концентрацию соли в исходной плазме до желаемого уровня, в то же время исключая слишком большое увеличение объема материала, подлежащего центрифугированию, для получения неочищенного преципитата протромбина в результате разведения в соответствии с известными способами.

ПРОТИВОВИРУСНОЕ СРЕДСТВО
Для инактивации содержащих липиды вирусов может быть использовано любое подходящее противовирусное средство, известное в данной области; в настоящее время рекомендуется применение композиций, включающих неионный детергент, такой как полиоксиэтиленсорбитановый детергент из серии Tween^® или Span^® и/или органический растворитель, такой как ди- или триалкил фосфат, который разрушает вирусные липиды, и инактивирует содержащие липиды вирионы без существенной денатурации тромбина. Такие противовирусные композиции повсеместно упоминаются в настоящем описании как композиции "растворитель - детергент" или композиции РД. Примером являются композиции РД, включающие ди- или триалкилфосфат, необязательно в комбинации с неионным детергентом в качестве увлажняющего агента, и/или спиртом или эфиром, инкубированные с загрязненным белком, как описано в патенте США 4,540 573, выданном 10 сентября 1985 г., Neurath, et al (включено в настоящее описание в виде ссылки). В соответствии со способом настоящего изобретения выбранная композиция растворителя/детергента инкубируется с исходным материалом неочищенного тромбина перед хроматографией с удалением во время хроматографии (ниже) остатков противовирусной композиции и загрязняющих компонентов, в частности, других факторов свертывания, содержащихся в исходном материале. Предпочтительная неденатурирующая РД композиция для использования в соответствии с изобретением основана на С₂-С₁₀-триалкилфосфате, таком как три-п-бутилфосфат и полиоксиалкиленовое производное частичного эфира сорбитола/жирной кислоты, такого как Tween 80 (полиоксиэтиленсорбитан моноолеат) при физиологическом pH.

ИОНООБМЕННАЯ ОЧИСТКА
В соответствии с изобретением обработанный противовирусной композицией исходный материал неочищенного тромбина очищается с помощью последовательной колоночной хроматографии с использованием одной адсорбционной среды с возрастающими концентрациями буфера при каждом определении. Подходящие хроматографические параметры хорошо известны в этой области; усовершенствованный способ в соответствии с изобретением включает проведение хроматографического отделения при температуре приблизительно 12^oC, а не как обычно при комнатной температуре (около 20^oC), что значительно увеличивает выход продукта. Хроматографическая очистка тромбина из исходного материала неочищенного тромбина, инкубированного с противовирусной композицией, описана здесь с точки зрения колоночной хроматографии. Однако может использоваться любое другое сравнимое физическое приспособление, такое как картриджи, для обеспечения контактирования адсорбционной среды с препаратом тромбина. С использованием способа изобретения процесс ионообменной очистки дает продукт тромбина высокой удельной активности и достаточный выход продукта, отражая высоко эффективную и успешную очистку неочищенного тромбина с точки зрения посторонних материалов в неочищенном препарате, в частности, других белков крови или бактериальных токсинов, и остатков противовирусной композиции.

А. АДСОРБЦИОННЫЕ СРЕДЫ
Могут быть использованы любые катионообменные адсорбционные среды, пригодные для отделения тромбина из неочищенного, обработанного противовирусной композицией исходного материала, для получения продукта терапевтической степени чистоты в частности, среды, высоко избирательные для тромбина, такие как Sepharose^® или SP-Sephadex^®, поступающими в продажу из компании " Sigma Chemical Co.", St. Louis, МО, USA. B варианте воплощения настоящего изобретения, который особенно предпочтителен для широкомасштабного производства, в качестве ионообменной среды применяется гель сульфопропил-Spherodex (поставляемый компанией "Sepracor Inc. ", Maribourgh, MA, USA). Эта среда представляет собой несжимаемый композитный ригидный гель, включающий частицы кремния, равномерно покрытые активированным сульфопропилом декстраном, который имеет как высокую способность адсорбировать тромбин, так и отличные свойства текучести, позволяющие быстро и эффективно произвести очистку. Кроме того, среда быстро и удобно обновляется после использования путем смывания, например, раствором гидроксида натрия как для санитарной обработки, так и для удаления белков или других материалов из колонки. Вообще, неригидные гели, такие как SP-Sephadex и сравнимые гели, не рекомендуются для крупномасштабной очистки тромбина, в соответствии с настоящим изобретением, так как было установлено, что значительно сниженные скорости потока во время очистки тромбина в соответствии с изобретением вызваны сжатием колонки вследствие упругости этих сред. Когда хроматографическое отделение проводится при 12^oС, конечный хроматографический элюат включает композицию бычьего тромбина, имеющую удельную активность по крайней мере 2000 единиц Национального Института Здоровья США (НИЗ) на мг нативного белка (т.е. не включающий любой добавленный белок, такой как стабилизирующий сывороточный альбумин, см. ниже), с выходом продукта по крайней мере от 70% до приблизительно 90% бычьего тромбина (от около 265 000 единиц НИЗ бычьего тромбина до около 340 000 единиц, начиная с 6 граммов имеющегося в продаже неочищенного тромбина с удельной активностью 100 ед. НИЗ/мг), или композиции тромбина человека, имеющей удельную активность, по крайней мере, около 1000 единиц НИЗ на мг нативного белка (т. е. не включающий любой добавленный белок, такой как стабилизирующий сывороточный альбумин, см. ниже), с выходом продукта, по крайней мере, от около 70% до около 90% тромбина человека (от, по крайней мере, около 150 000 единиц НИЗ тромбина человека до около 180 000 единиц, начиная с 5 л супернатанта плазмы после солевой преципитации. Когда хроматографическое отделение проводится при 20^oC, удельная активность тромбина человека составляет, по крайней мере около 400 единиц НИЗ на мг нативного белка. Процент потери активности во время обработки Р/Д и вследствие вариации от партии к партии включен в данный диапазон единиц).

В. ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЙ БУФЕР
Хроматографический буфер может включать водный фосфатный раствор, включающий KH₂PO₄/Na₂HPO₄ (для бычьего тромбина) и KH₂PO₄/K₂HPO₄ (для тромбина человека); компоненты отдельных буферных растворов смешиваются с (предпочтительно дистиллированной) водой по существу в эквимолярных пропорциях, затем одноосновный и двуосновный фосфатные растворы смешиваются в пропорциях, обеспечивающих конечный буферный раствор, имеющий pH, равный 6,5. Колонка сначала уравновешивается низкой концентрацией фосфатного буфера (около 0,025 М) и промывается возрастающими концентрациями этого же буфера до тех пор, пока не произойдет элюирование всего материала, абсорбирующего ультрафиолетовое излучение. Выделяется конечный элюат (раствор с максимальной концентрацией тромбина), подвергается противовирусной обработке, как описано ниже, для обеспечения вирусной безопасности в соответствии с предполагаемым применением. Для бычьего тромбина колонка предпочтительно промывается тремя возрастающими концентрациями буфера (приблизительно 0,025 М, 0,35 М и 0,4 М); третье промывание буфером 0,4 М элюирует раствор с максимальной концентрацией тромбина. Остатки противовирусной композиции и загрязняющие белки удаляются во время первых двух промываний.

Для тромбина человека колонка предпочтительно промывается четырьмя возрастающими концентрациями буфера (приблизительно 0,025М, 0,15М, 0,20М и 0,25М); четвертое промывание буфером 0,25М элюирует раствор с максимальной концентрацией тромбина. Остатки противовирусной композиции и загрязняющие белки удаляются во время первых трех промываний.

Альтернативно хроматография может выполняться с помощью линейного градиента возрастающей концентрации раствора хлорида натрия. Очистка тромбина человека достигалась с использованием колонки, уравновешенной в 80 мМ NaCl, и отмытой линейным градиентом раствора NaCl с возрастающей молярностью (от 80 до 150 мМ). Тромбин элюируется в 400 мМ растворе NaCl. Этот эксперимент выполнялся при 20^oC, и удельная активность была сравнима (500 ед. НИЗ) с активностью, полученной при такой же температуре при использовании возрастающего ступенчатого градиента фосфатного буфера (> 400 ед. НИЗ). Поэтому буферный или солевой раствор, используемый во время хроматографической очистки, не имеет принципиального значения, при условии, что он пригоден для очистки тромбина с учетом ионной силы и pH. Поэтому опытный специалист может легко найти эквиваленты использованных выше буферных и солевых растворов, для достижения аналогичной очистки.

С. ЗАМЕНА БУФЕРА
Выделенный из указанной выше композиции раствор с максимальной концентрацией тромбина подвергается диафильтрации или другим способам обработки в соответствии с известными способами для замены хроматографического буферного раствора на композиционный буферный раствор. Для предполагаемого применения может использоваться любой композиционный буферный раствор, в котором растворим тромбин и который стабилизирует раствор тромбина на описанных последующих этапах процесса, в частности, растворы Tris-HCl (приблизительно от 0,20 до 0,30 мас.% от всей композиции) в водном солевом растворе (приблизительно от 0,40 до приблизительно 0,50 мас.% NaCl от всей композиции). В соответствии с настоящим изобретением особенно хорошие результаты для стабилизации тромбина против распада, вызываемого обработкой противовирусной композицией после хроматографии и хранением, получены, например, при использовании композиционного буферного раствора, включающего водный раствор приблизительно 0,25% цитрата натрия, 0,45% хлорида натрия, 0,25% Tris-HCl (все в % мас./об.); pH 73.

Для получения самых лучших результатов бычий сывороточный альбумин или сывороточный альбумин человека (в соответствии с предполагаемым использованием) предварительно добавляется в раствор с максимальной концентрацией тромбина, перед заменой хроматографического буфера композиционным буферным раствором в количестве, приблизительно в 20 раз превышающем общее содержание белка в растворе (т.е., "нативного белка") на основании мас. %. После разведения раствора до требуемой концентрации в конце процесса, непосредственно перед заполнением, конечная концентрация альбумина увеличивается до 2% (мас. /об. ). Для замены буферов выделенный раствор с максимальной концентрацией тромбина предпочтительно подвергают диафильтрации с использованием, например, объема композиционного буфера, равного приблизительно 8-кратному объему раствора с максимальной концентрацией тромбина, и мембраны, задерживающей вещества с мол. массой более 30 000, или другой подходящей мембраны, которая задерживает тромбин (мол. вес 36 000, незначительно варьирующий в соответствии с источником), и альбумин (мол. вес 66 000, незначительно варьирующий в соответствии с источником), но не более мелкие белки. Хотя улучшенные результаты могут быть получены путем добавления альбумина (или, менее предпочтительно в настоящее время, любого другого стабилизирующего белка) в любое время перед хранением, предпочтительно, чтобы альбумин был включен в композиционный раствор перед тем, как он заменяется на хроматографический буферный раствор, поскольку альбумин вносит вклад в стабилизацию тромбина во время всех постхроматографических этапов. Как указано выше, наиболее предпочтительно, чтобы альбумин добавлялся в раствор с максимальной концентрацией тромбина, перед этапом замены буфера. Подходящий сывороточный альбумин для использования в практике изобретения широко доступен в торговой сети; например, подходящий сывороточный альбумин человека включает Plasbumin-25^® (Miles Canada Inc., Etobicoke, Ontario, Canada), включающий 25% раствор альбумина по Фармакопее США, дополнительно содержащий два стабилизатора: 0,02М ацетилтриптофан и 0,02М каприлат натрия, без консервантов, изготовленный из плазмы смешанной венозной донорской крови человека, с использованием методики Кона холодового фракционирования этанолом, и обработанный теплом при 60^oC в течение 10 часов для исключения возможности передачи вирусов гепатита. На предпочтительном этапе в соответствии с настоящей заявкой сначала добавляют приблизительно 10 мл раствора альбумина в приблизительно 500 мл раствора с максимальной концентрацией тромбина, с последующей диафильтрацией модифицированного альбумином раствора с максимальной концентрацией, приблизительно 8-кратным объемом композиционного буфера для замены буфера. Посредством этого этапа, по крайней мере приблизительно 99%, более часто приблизительно 99,99% загрязняющих веществ с низкой молекулярной массой, заменяются композиционным буфером, оставляя внутри все белки, более крупные, чем те, которые задерживают, благодаря зависимой от молекулярной массы антифильтрационной способности диафильтрационной мембраны. Предпочтительно, чтобы сывороточный альбумин человека использовался как для тромбина человека, так и для бычьего тромбина, предназначенных для применения у людей, а бычий сывороточный альбумин использовался для бычьего тромбина, предназначенного для применения в ветеринарии.

В зависимости от предполагаемого использования очищенный тромбиновый продукт в указанном выше композиционном буфере может использоваться так же как после составления конечной композиции, стабилизационной фильтрации и лиофилизации, в частности, очищенный бычий тромбин для ветеринарного использования. Для применения у людей продукт предпочтительно подвергается дальнейшей противовирусной очистке, как указано ниже.

D. ФИЛЬТРАЦИЯ ЧЕРЕЗ МЕМБРАННЫЕ ПРОТИВОВИРУСНЫЕ ФИЛЬТРЫ
Для дальнейшей очистки тромбина в плане не содержащих липиды вирусов выделенный тромбин в композиционном буфере, предпочтительно включающем сывороточный альбумин или другой стабилизирующий белок, фильтруется через половолоконную мембрану, такую как микропористая мембрана ВММ (Bemberg; Microporous Membrane Development, Asahi Chemical Industries), содержащую регенерированное купраммонием волокно целлюлозы, имеющую размер пор приблизительно 15 нм, типа той, которая производится фирмой "Asahi Chemical Industries", Tokyo, Japan, и имеется в продаже под торговой маркой "Planova ВММ". Эта методика в значительной степени удаляет не содержащие липиды вирионы, которые не могут быть инактивированы обработкой РД способа. Фильтр особенно пригоден для очистки тромбина, так как он может регулировать высокую концентрацию тромбина при низком объеме раствора: например, начиная с 5 литров плазмы человека, объем приблизительно 125 мл подученного раствора очищенного тромбина (600-800 ед. НИЗ/мд) фильтровали через фильтр Planova ВММ площадью 0,01 м² и с размером пор 15 нм. В этих условиях испытанная степень снижения концентрации мелкого вируса полиомиелита была более 7 десятичных логарифмов.

E. ОБРАБОТКА СУХИМ ЖАРОМ
Хотя описанная обработка РД обычно удаляет от 4 до 6 десятичных логарифмов, содержащих липиды вирусов, а фильтрация через противовирусные фильтры с размером пор 15 нм от 4 до 8 десятичных логарифмов любых вирусов, выживших после обработки РД, для гарантии вирусной безопасности, препараты тромбина, лиофилизированные в ампулах, могут быть дополнительно подвергнуты обработке сухим жаром при температуре приблизительно 100^oC в течение приблизительно от 1 до 2 часов. Во избежании нежелательной дезактивации тромбина важно, чтобы во время обработки в продукте было низкое содержание влаги.

ПРИМЕРЫ
Пример 1. Производство бычьего тромбина с обработкой растворителем-детергентом
Шесть граммов неочищенного имеющегося в продаже бычьего тромбина (приобретенного в компании "GenTrac, Inc.", Middleton, Wl, USA), имеющего удельную активность 100 ед. НИЗ, растворяют в 75 мл водного буфера, содержащего 1% Tris-НСl и 1,62% цитрат натрия (все в мас./об.%), с pH 7,0. Добавляют 75 мл водного раствора растворителя детергента (1% Tris-HCl, 1,62% цитрат натрия, 2% Tween 80^®, 0,6 три-п-бутилфосфат (ТпВР), все в мас./об.%), с pH 7,0 и смесь перемешивают в течение 6 часов при 25^oC.

Смесь помещают непосредственно в колонку сульфопропил-Spherodex (2,5 см х 13 см, Pharmacia), уравновешивают 0,025М KH₂PO₄/Na₂PO₄ в водном растворе (приготовленном, как описано выше), при pH 6,5. Колонку промывают тремя возрастающими концентрациями этого буфера (0,025М, 0,35М и 0,4М, все при pH 6,5) до тех пор, пока не элюируется весь материал, поглощающий ультрафиолетовое излучение. Материал, элюированный 0,025М и 0,35М буферами, содержит компоненты смеси РД и загрязняющие белки, и его удаляют. Третье элюирование 0,4М буфером содержит очищенный, подвергнутый противовирусной обработке растворителем-детергентом бычий тромбин с удельной активностью более чем 2 000 единиц НИЗ на мг белка, с выходом продукта от 70 до 90%. Очистку выполняют при 12^oС. Бычий сывороточный альбумин добавляют в собранный раствор с максимальной концентрацией тромбина в количестве, равном 20-кратному общему количеству белка, полученный в результате раствор подвергают диафильтрации в 8-кратном объеме с использованием мембраны, задерживающей вещества с молекулярной массой более 30 000 (мембрана Amicon YM 30, Amicon Division, W.R. Grace & Co. Conn. , Beverly, Massachusetts, USA), с заменой хроматографического буфера на следующий композиционный буфер: 0,25% цитрат натрия, 0,45% хлорид натрия, 0,25% Tris-HCl (трис (гидроксиметил) аминометан гидрохлорид) (все количества в мас./об.%), в водном растворе при pH 7,3. После диафильтрации раствор тромбина разводят до концентрации 220 ед. НИЗ/мл тем же композиционным буфером, содержание бычьего сывороточного альбумина увеличивают до 2%, раствор стерильно фильтруют через мембранный противовирусный фильтр, заливают в ампулы и диофилизируют. Ампулы хранят при 4^oС. Перед добавлением сывороточного альбумина удельная активность тромбина выше чем 2 000 ед. НИЗ/мг белка. Остаток РД, присутствующий в конечном продукте, растворенном в 1 мл воды, содержит: Tween 80 < 15 мкг/г; TпBP < 15 мкг/г. Каждую ампулу заполняют 220 ед. НИЗ бычьего тромбина. Ускоренные исследования устойчивости при 37^oC в течение 2 месяцев (соответствующие 6 месяцам при 4^oC) не выявляют существенной потери активности тромбина.

Пример 2. Тромбин человека после двойной противовирусной обработки
Пять литров фракции плазмы человека, оставшейся после солевой преципитации белков свертывания, использованных в производстве фибринового герметика, обрабатывают в соответствии с процедурой, описанной в "Ann. pharmaceutique francaise", op.cit., supra, с использованием этапа диафильтрации, а не описанной выше процедуры разведения. Исходную фракцию плазмы диафильтрируют водным раствором 0,015М NaCl до концентрации, составляющей приблизительно 10% начальной концентрации в свежей плазме, и pH доводят до 5,32% уксусной кислотой, смесь перемешивают в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем материал центрифугируют в течение 20 мин при 4200 об/мин, полученный в результате осадок растворяют в 250 мл 0,9% NaCl на литр плазмы с доведением pH до 7,02% карбонатом натрия. Протромбин прекращают в тромбин добавлением хлорида кальция для получения конечной концентрации 21 мМ с последующей инкубацией при комнатной температуре в течение 2 час и центрифугированием при 4 200 об/мин в течение 20 мин. Из 5 л исходной фракции плазмы получают 200 000-250 000 единиц НИЗ неочищенного тромбина.

Концентрацию белка в препарате неочищенного тромбина доводят приблизительно до 10-15 мг/мл, раствор подвергают противовирусной обработке растворителем-детергентом путем добавления равного объема следующей композиции РД: водный раствор 1% Tris-HCI, 1,62% цитрата натрия, 2% Tween 80^® (Sigma Chemical Co. ) и 0,6% три-п-бутилфосфат (все в мас./об.%) с перемешиванием в течение 6 час при 25^oC.

После инкубации материал неочищенного тромбина помещают непосредственно в колонку сульфопропил-Spherodex (5 см х 13 см, Pharmacia), уравновешенную 0,025М фосфатным буфером, как в примере 1. Колонку промывают четырьмя возрастающими концентрациями фосфатного буфера (см. ниже) до тех пор, пока не элюируется весь материал, поглощающий ультрафиолетовое излучение.

Материал, элюированный первыми тремя буферами (0,025М, 0,15М и 0,20М), и содержащий компоненты смеси РД и загрязняющие белки, удаляют. Четвертое элюирование 0,25М буфером содержит очищенный РД и подвергнутый противовирусной обработке тромбин человека с удельной активностью 1200 единиц НИЗ на мг белка, полученный с выходом продукта 90%. Проводят хроматографию при 12^oC. В собранный раствор с максимальной концентрацией тромбина добавляют раствор человеческого сывороточного альбумина, допущенный к использованию у людей (Plasbumin-25^®) в количестве, равном 20- кратному (по массе) общему количеству белка, присутствующего в растворе тромбина с максимальной концентрацией, и раствор подвергают диафильтрации в 8-кратном объеме с использованием мембраны, задерживающей вещества с молекулярной массой более 30 000, и следующего стерильного композиционного буфера: 0,25% цитрат натрия, 0,45% хлорид натрия, 0,25% Tris-HCl (все в мас./об.%), в водном растворе при pH 7,3.

Затем раствор тромбина фильтруют через противовирусный фильтр с использованием фильтра Planova ВММ (Asahi Chemical Co., см. выше) площадью 0,01 м² (площадь фильтрации) и размером пор 15 нм при давлении 10 Па. Отфильтрованный тромбин разводят до требуемой концентрации (в этом случае - 220 ед. НИЗ/мл) тем же стерильным композиционным буфером, концентрацию человеческого альбумина увеличивают до 2%, раствор стерилизуют фильтрацией через антибактеральные фильтры, заливают в ампулы, лиофилизируют и хранят при 4^oC. Ампулы заполняют 200 ед. НИЗ тромбина человека и проводят ускоренные исследования устойчивости при 37^oC в течение 2 месяцев, соответствующие 6 месяцам при 4^oC. Не отмечено существенной потери активности тромбина (по данным измерения с помощью стандартных методик сгусткообразования). Поэтому удельная активность продукта сохранялась во время хранения.

Пример 3. Тромбин человека, подвергнутый тройной противовирусной обработке
Ампулы, содержащие лиофилизированный человеческий тромбин, подвергают нагреванию при 100^oC в течение 1-2 час. Потери активности тромбина не наблюдают.

Процедуры, приведенные в примерах 1, 2 и 3 легко масштабируются для коммерческого производства.

Изобретение представляет усовершенствованный способ крупномасштабного производства композиции тромбина терапевтической степени чистоты с отличной вирусной безопасностью и устойчивостью при хранении, включающий очистку обработанного противовирусной композицией неочищенного тромбина с помощью ионообменной хроматографии на одиночной колонке с использованием активированного сульфалкилом полисахарида, в частности сульфопропил-Spherodex^®, в качестве ионообменной среды, и возрастающих концентраций фосфатного буфера для элюирования. После извлечения тромбина в конечном элюате фосфатный буфер заменяют на стабилизирующий композиционный буфер и стабилизированный тромбин подвергают противовирусной фильтрации и необязательной обработке сухим жаром для дальнейшей инактивации вирусов. Конечный продукт имеет высокую удельную активность и получается с хорошим выходом продукта. 12 з.п.ф-лы.

1. Способ крупномасштабного производства устойчивой при хранении композиции тромбина терапевтической степени чистоты, по существу свободной от липидсодержащих вирусов, предусматривающий: а) инкубирование неочищенного тромбина с вирицидом против липидсодержащих вирусов в количестве, достаточном для инактивации этих вирусов в случае их присутствия; b) очистку инкубированного материала последующей ионообменной хроматографией с использованием одной активированной сульфалкилом полисахаридной катионообменной среды, выбранной из группы, состоящей из активированной сульфалкилом полиагарозы, активированного сульфалкилом полидекстрана и несжимаемой композиционной среды из активированного сульфалкилом декстрана и частиц диоксида кремния, имеющей высокую избирательность в отношении тромбина, с использованием в качестве элюирующего агента, по меньшей мере, трех и возрастающих концентраций водного буферного раствора, состоящего по существу из КН₂РО₄ и натриевой или калиевой соли НРО₄, имеющего рН ~ 6,5, в качестве элюирующего агента для бычьего тромбина и рН ~ 6,35 для человеческого тромбина; и с) извлечение элюата пика тромбина из хроматографии в) и замену буфера этого элюата физиологически совместимым стабилизирующим композиционным буфером для стабилизации извлекаемого тромбина и извлечение раствора тромбина в композиционном буфере. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что катионообменная среда представляет собой по существу несжимаемую композиционную среду активированного сульфалкилом декстрана и частиц диоксида кремния. 3. Способ по п.2, отличающийся тем, что катионообменная среда представляет собой по существу несжимаемую композиционную среду активированного сульфопропилом декстрана и частиц диоксида кремния. 4. Способ по п.1, дополнительно включающий в себя фильтрование раствора тромбина в композиционном буфере через медно-аммиачную целлюлозную мембрану из полых волокон для отфильтровывания вирионов, присутствующих в композиционном буферном растворе, и извлечение по существу свободного от вирионов раствора тромбина в композиционном буфере. 5. Способ по п.1, дополнительно включающий в себя лиофилизацию и обработку сухим жаром раствора тромбина в композиционном буфере после фильтрования для инактивации любых остающихся вирионов без денатурации тромбина. 6. Способ по п.4, дополнительно включающий в себя лиофилизацию и обработку сухим жаром раствора тромбина в композиционном буфере после фильтрования для инактивации любых остающихся вирионов без денатурации тромбина. 7. Способ по п.5, отличающийся тем, что композиционный буферный раствор содержит водный раствор цитратной соли, хлорида натрия, трис-HCl и сывороточного альбумина при рН ~ 7,3 в количествах, достаточных для стабилизации тромбина против существенной потери активности во время термообработки. 8. Способ по п.6, отличающийся тем, что композиционный буферный раствор содержит водный раствор цитратной соли, хлорида натрия, трис-HCl и сывороточного альбумина при рН ~ 7,3, в количествах, достаточных для стабилизации тромбина против существенной потери активности во время термообработки. 9. Способ по п.1, отличающийся тем, что неочищенный тромбин представляет собой бычий тромбин и композиция бычьего тромбина терапевтической степени чистоты имеет удельную активность, по меньшей мере, 2000 единиц НИЗ/мг нативного белка и остаток вирицида менее ~ 15 м.д. 10. Способ по п.1, отличающийся тем, что неочищенный тромбин представляет собой человеческий тромбин и композиция человеческого тромбина терапевтической степени чистоты имеет удельную активность, по меньшей мере, 1000 единиц НИЗ/мг нативного белка и остаток вирицида менее ~ 15 м.д. 11. Способ по п.7, отличающийся тем, что композиционный буферный раствор содержит водный раствор ~ 0,25% цитрата натрия, 0,45% хлорида натрия, 0,25% трис-HCl, все в % (мас./об); сывороточный альбумин в количестве, приблизительно равном 20-кратному количеству относительно общего количества белка в элюате пика тромбина, доводится перед лиофилизацией до 2% (мас./об.) и имеет рН ~ 7,3. 12. Способ по п.8, отличающийся тем, что композиционный буферный раствор содержит водный раствор ~ 0,25% цитрата натрия, 0,45% хлорида натрия, 0,25% трис-HCl, все в % (мас./об.); сывороточный альбумин в количестве приблизительно равном 20-кратному количеству относительно общего количества белка в элюате пика тромбина, доводится перед лиофилизацией до 2% (мас./об.) и имеет рН ~ 7,3. 13. Способ по п.1, отличающийся тем, что увеличивающиеся концентрации буфера состоят по существу ~ 0,025, 0,3 и 0,4 М буфера для бычьего тромбина и ~ 0,025, 0,18 и 0,25 М буфера для человеческого тромбина.