СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РАСТВОРА ГАММА-ГЛОБУЛИНА, ПРЕДНАЗНАЧЕННОГО ДЛЯ ВНУТРИВЕННОГО ВВЕДЕНИЯ, И ПРОДУКТ, ПОЛУЧАЕМЫЙ ЭТИМ СПОСОБОМ Российский патент 2003 года по МПК A61K35/14 A61K39/395 

Изобретение относится к многоэтапному коммерческому процессу получения иммунного сывороточного глобулина, предназначенного для внутривенного введения и содержащего в качестве главного ингредиента IgG (g-глобулин).

Из уровня техники известны различные процессы получения растворов g-глобулина для внутривенного введения, исходным материалом для которых служат фракции человеческой плазмы (фракции Кона). Некоторые из фракций Кона содержат более высокие титры g-глобулина, чем другие. Обычно исходным материалом для получения растворов g-глобулина являются фракция Кона II или фракция Кона II + III.

В известных из уровня техники процессах используются различные методики разделения и стерилизации, постоянно вводятся модификации с целью повышения чистоты конечного продукта, его безопасности и общего выхода.

Во многих коммерческих процессах для инактивации вирусов применяется этап обработки растворителем/детергентом или этап тепловой обработки. На сегодня не известны многостадийные процессы, для которых исходным материалом служили бы паста фракции Кона II или паста II+III и которые бы включали две различные процедуры инактивации вирусов как часть эффективного процесса производства g-глобулина с высоким выходом.

В патенте США 5151499 Kameyama et al. описан процесс получения белковых композиций, согласно которому белковую композицию подвергают инактивации оболочечных вирусов обработкой белковой композиции растворителем/детергентом и инактивации безоболочечных вирусов тепловой обработкой белковой композиции. В патенте отмечается, что этап обработки растворителем/детергентом предпочтительно осуществлять первым и в присутствии ингибитора протеаз, а уже затем проводить тепловую обработку. Когда тепловую обработку проводят в жидкой фазе, то белок выделяют из смеси растворитель/детергент адсорбцией на ионообменной колонке до тепловой обработки. Тепловая обработка в жидкой фазе может осуществляться в присутствии в качестве стабилизатора сахара, сахарного спирта или аминокислот. При том, что в патенте '644 перечислены многочисленные исходные белковые композиции, приведенные примеры получения ограничиваются Фактором IX, тромбином, фибриногеном и фибронектином. Удаление денатурированного белка, образовавшегося на этапе тепловой обработки, не рассматривается.

В некоторых известных из уровня техники процессах получения предназначенных для внутривенного введения растворов g-глобулина описывается введение тепловой обработки в жидкой фазе, проводимой в присутствии сорбитола в качестве теплового стабилизатора, как этапа многостадийной процедуры очистки, исходным материалом для которой служит паста фракций Кона II+III. В патенте США 4876088 Hirao et al. фракцию Кона II+III подвергают фракционированию полиэтиленгликолем (далее ПЭГ) (сначала 8% в/о ПЭГ, затем - 12% в/о ПЭГ), затем ионобменной хроматографии (ДЕАЭ-Сефадекс), и удаляют антитела группы крови человека до тепловой обработки в жидкой фазе в присутствии сорбитола как стабилизатора белка. С другой стороны, в примере 1 патента США 4876088 Hirao et al. описывают получение раствора g-глобулина для внутривенного введения из пасты фракции II+III. При этом пасту суспендируют в воде, рН доводят до 5,5 и центрифугируют, после чего супернатант подвергают тепловой обработке для инактивации вирусов в присутствии 33% в/о сорбитола. Затем следует фракционирование ПЭГом (6%/12%), при котором удаляется денатурированный белок, и другие этапы очистки, включая ионобменную хроматографию на ДЕАЭ-Сефадексе.

Целью настоящего изобретения явилась разработка объединяющего, многоэтапного коммерческого процесса получения высокоочищенного иммунного раствора g-глобулина на основе процесса фракционирования Кона.

Другой целью настоящего изобретения явилось получение очень чистого, предназначенного для внутривенного введения раствора g-глобулина, свободного как от оболочечных вирусов, так и безоболочечных вирусов, включая все температурочувствительные вирусы.

Другой целью настоящего изобретения было создание коммерческого процесса получения g-глобулина, который предусматривал бы удаление до второй стадии инактивации вирусов любого денатурированного белка, образовавшегося при тепловой стерилизации.

Перечисленные выше и другие цели, которые очевидны для квалифицированного специалиста, были достигнуты в настоящем изобретении, согласно которому спиртовые фракции Кона, которые могут быть частично очищены, но обогащены g-глобулином, подвергают тепловой обработке в водной среде в присутствии теплового стабилизатора для инактивации вирусов, затем проводят фракционирование ПЭГом и вторую инактивацию вирусов в присутствии растворителя или, предпочтительно, смеси растворитель/детергент для разрушения оболочечных вирусов, после чего следует удаление растворителя или смеси растворитель/детергент.

Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, тепловым стабилизатором служит сорбитол, а в качестве растворителя используется триалкилфосфат.

Согласно другому предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, денатурированные продукты, образовавшиеся в результате инактивации вирусов тепловой обработкой, удаляют фракционированием ПЭГом до второй вирусной инактивации, получая тем самым дополнительно очищенный чистый, прогретый g-глобулин.

Согласно другому предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, любые присутствующие частицы удаляются до этапа обработки растворителем /детергентом.

Согласно еще одному варианту осуществления изобретения, получают стерилизованный теплом и растворителем/детергентом g-глобулин, пригодный для внутривенного введения.

В качестве исходного материала используются фракции, содержащие иммуноглобулины. Эти фракции необязательно должны быть фракциями сыворотки человека, но должны содержать иммуноглобулины. Конкретными примерами таких содержащих иммуноглобулины фракций служат фракция II+III и фракция II, получаемые при фракционировании этанолом по Кону, а также паста эквивалентных им содержащих иммуноглобулины фракций. Другими исходными материалами служат фракции I+II+III и фракция II+IIIw. Исходный материал может содержать такие примеси, как антитела группы крови человека, плазминоген, плазмин, калликреин, прекалликреин активатор, полимеры IgM, IgA, IgG (обозначаемые как "агрегаты") и т.д.

Предпочтительным исходным материалом являются фракция Кона II или фракция Кона II+III. Когда используется паста фракций II+III, рекомендуется подвергнуть ее предварительной процедуре отмывки с получением фракции II+IIIw, которая и используется в процессе согласно настоящему изобретению. Фракция II+IIIw представляет собой преципитат фракции II+III, промытый раствором динатрий фосфата.

Фракцию II+IIIw можно получить растворением преципитата фракции II+III в холодной воде для инъекций в соотношении примерно 1 кг пасты II+III на 20 объемов воды. Для солюбилизации липидов, липопротеинов и альбумина добавляют раствор фосфата натрия до конечной концентрации 0,003 М фосфата натрия. Затем добавляют холодный этанол до конечной концентрации около 20%. При добавлении спирта температуру постепенно понижают до -5±1^oС, а рН поддерживают на уровне 7,2±0,1, например, добавлением ацетатного буфера или разбавленной соляной кислоты. Образующийся преципитат фракции II+IIIw выделяют центрифугированием и/или фильтрацией при температуре -5±1^oС.

Согласно настоящему изобретению до первого этапа инактивации вирусов могут быть проведены различные предварительные этапы очистки и/или снижения количества агрегатов. Например, когда используется паста фракций II+III, содержащая около 20% спирта и более чем 70% IgG, ее можно суспендировать в от 3-х до 10-ти объемах, предпочтительно в от 3-х до 5-ти объемах холодной воды при температуре около 0-5^oС и с рН, доведенным до значений в интервале 4,5-6,0, предпочтительно в интервале 5,0-5,5, с помощью ацетатного буфера с рН 4,0 или соляной кислотой. Смесь перемешивают от двух до 15-ти часов для того, чтобы весь g-глобулин перешел в раствор. Затем такие нерастворенные белки, как альбумин и а-глобулины, можно удалить центрифугированием и/или фильтрацией.

Если в качестве исходного материала используются различные фракции Кона, то начальный этап или этапы процесса могут быть выбраны соответствущим образом, с тем, чтобы получить фракции с высоким содержанием IgG. Например, когда фракция Кона II (содержащая более 95% IgG) отделена от фракции Кона III, то первоначальная обработка фракции II может проводиться при кислом рН от 3,2 до 5,0, предпочтительно от 3,8 до 4,2, как описано Uemura et al., в патенте США 4371520, с тем чтобы разрушить агрегаты иммуноглобулинов, присутствиеющие среди мономеров и димеров иммуноглобулинов, поскольку известно, что агрегаты обладают анти-комплементарной активностью (АСА).

Альтернативно, когда в качестве исходного материала используется фракция Кона II+III, то согласно патенту США 4371520, обработка низким рН может быть осуществлена как дополнительный этап после этапа первоначальной очистки, описанного выше, и перед инактивацией вирусов тепловой обработкой.

При осуществлении этапа тепловой стерилизации белок иммуноглобулина растворяют в воде, или, если он представялет собой водную смесь, например, фильтрат, полученный после описанной выше частичной очистки, его можно использовать как есть и добавлять к нему сахар, сахарный спирт или аминокислоты в качестве теплового стабилизатора. Тепловым стабилизатором предпочтительно служит сахароза, мальтоза, сорбитол или маннитол, наиболее предпочтительно сорбитол. Сахар или сахарный спирт добавляют к раствору иммуноглобулина в виде порошка или перед добавлением смешивают с небольшим количеством воды и доводят его концентрацию в растворе до от 10 до 50 (в/о)%, до насыщения. В этот момент водный раствор иммуноглобулина содержит достаточное количество воды, так что концентрация общего белка в растворе составляет от 1 до 6%, что соответствует обычному исходному материалу фракций II+III, который содержит около 300 г белка на килограмм пасты.

После добавления теплового стабилизатора смесь нагревают до температуры 50-70^oС в течение 10-100 ч, предпочтительно до 60^oС в течение 10-20 ч для инактивации температурочувствительных вирусов. Этап тепловой обработки не только инактивирует вирусы, но, в силу своего денатурирующего воздействия, может избирательно снижать количество отдельных нежелательных белков, обычно ассоциированных с фракциями Кона II+III, таких как прекалликреин, плазмин, плазминоген и IgA.

После тепловой обработки добавляют холодную воду в таком количестве, чтобы довести концентрацию белка от 0,3 до 2,0%. Раствор охлаждают до 0-2^oС.

Затем проводят фракционирование прошедшего тепловую обработку раствора ПЭГом. Фракционирование ПЭГом является хорошо известным из уровня техники процессом, применяемым для очистки иммунологобулинов, т.е. для отделения нужных мономеров и димеров IgG от агрегатов IgG и других примесей, естественно встречающихся в исходных фракциях белков плазмы. Однако, в описываемом процессе фракционирование ПЭГом также дает возможность отделить нужные мономеры и димеры IgG от нежелательных денатурированных белковых продуктов, образовавшихся при тепловой обработке. К этим денатурированным белковым продуктам относятся денатурированный прекалликреин, плазминоген, плазмин, IgA, IgM и агрегаты.

Может быть использована любая известная из уровня техники процедура фракционирования ПЭГом. Обычно проводят двухэтапное фракционирование ПЭГом. На первом этапе фракционирования ПЭГом концентрацию ПЭГ и рН выбирают таким образом, чтобы нужные мономеры и димеры IgG оставались в растворе, а такие нежелательные белки, как агрегаты, преципитировали из раствора. После центрифугирования и/или фильтрации концентрацию ПЭГ повышают и доводят рН с тем, чтобы преципитировать нужные мономеры и димеры IgG.

Например, первый этап фракционирования ПЭГом можно проводить при рН от 5,0 до 7,5, предпочтительно в интервале значений рН от 6,5 до 7,5, если в качестве исходного материала используется паста фракций II+IIIw, и предпочтительно в интервале значений рН от 5,5 до 6,0, если в качестве исходного материала используется паста фракций II+III, и концентрация ПЭГа варьирует в пределах 4-8%, предпочтительно 4-6%, если в качестве исходного материала используется паста фракций II+IIIw, или 6-8%, если в качестве исходного материала используется паста фракций II+III. При поддержании температуры около 0-2^oС первый этап фракционирования ПЭГом занимает от 1 до 8 ч, после чего преципитат удаляют как описано выше.

Затем рН фильтрата доводят до значения 8.0-9.0, предпочтительно от 8,5 до 8,9, и добавляют еще одну порцию ПЭГ до конечной концентрации от 10 до 15%, предпочтительно около 12%. Образовавшийся преципитат, который представляет собой очищенный иммуноглобулин, удаляют фильтрацией и/или центрифугированием.

Дальнейшие детали процедур фракционирования ПЭГом, применимых для осуществления настоящего изобретения, можно найти в упоминавшихся выше патентах США 4876088 Hirao et al., и 4845199 Hirao et al.

Окончательным необходимым этапом раскрытого в настоящем изобретении процесса является этап второй инактивации вирусов с использованием растворителя или смеси растворитель/детергент. Как описано далее, последующие этапы очистки, в частности, с использованием ионообменных смол, могут осуществляться как до, так и/или после обработки растворителем/детергентом. Особые преимущества имеет процедура, сочетающая анионообменную обработку до инактивации вирусов растворителем/детергентом с катионообменной обработкой после инактивации вирусов растворителем/детергентом. В ходе этой процедуры некоторые нежелательные белковые материалы (такие как прекалликреин активатор, IgA, IgM и альбумин), обнаруживаемые в плазме человека, можно удалить из IgG при помощи анионообменника, а затем эти материалы (прекалликреин активатор, IgA, IgM, альбумин и ПЭГ), а также остатки реагентов, использованных для обработки растворителем/детергентом, можно удалить катионообменной хроматографией.

Если это не было проделано на более ранних этапах процесса, то предназначенный для обработки растворителем/детергентом раствор, должен быть освобожден от любых частиц, к которым может относиться и денатурированный белок. Поэтому предпочтительно профильтровать раствор через 1 микронный или более тонкий фильтр до добавления растворителя/детергента. Это также снизит вероятность попадания вирусов в крупные частицы, где они могли бы избежать контакта с растворителем/детергентом.

В настоящее время наиболее предпочтительным растворителем для инактивации оболочечных вирусов является триалкилфосфат. Триалкилфосфат, используемый при осуществлении настоящего изобретения, не является предметом каких-либо особых ограничений, но предпочтительно использовать три-(n-бутил)-фосфат ("TNBP"). Другими использумыми триалкилфосфатами являются три-(тер-бутил)-фосфат, три-(n-гексил)-фосфат, три-(2-этилгексил)-фосфат и т.д. Возможно применение смеси двух или более различных триалкилфосфатов.

Триалкилфосфат используют в концентрациях от 0.01 до 10 (в/о)%, предпочтительно от 0.1 до 3 (в/о)%.

Триалкилфосфат может применяться как вместе с детергентом или поверхностно активным веществом, так и без них. Предпочтительно использовать триалкилфосфат в сочетании с детергентом. Функции детергента состоят в усилении контакта содержащихся в композиции иммуноглобулина вирусов с триалкилфосфатом.

Примерами детергентов служат полиоксиэтиленовые производные жирных кислот, частичные эфиры безводного сорбитола, такие как Полисорбат 80 (Торговое название: Твин 80, и т.д.) и Полисорбат 20 (Торговое название: Твин 20, и т.д.); и такие неионные агенты, как оксиэтилированный алкилфенол (Торговое название: Тритон Х100, и т.д.), а также другие поверхностно активные вещества и такие детергенты, как цвиттерионные детергенты и т.д.

При применении детергента его не следует добавлять в критических количествах, например, его можно использовать в концентрациях от 0,001 до 10%, предпочтительно от 0,01 до 3%.

Согласно настоящему изобретению обработку иммуноглобулинсодержащей композиции триалкилфосфатом проводят при температуре от 20 до 35^oС, предпочтительно от 25 до 30^oС, на протяжении более чем одного часа, предпочтительно от 5 до 8 ч, наиболее предпочтительно от 6 до 7 ч.

Во время обработки триалкилфосфатом иммуноглобулин находится в водной среде в виде раствора с концентрацией белка от 3 до 8%.

Если анионообменная обработка не была проведена до обработки растворителем/детергентом, то ее можно осуществить с уже обработанным растворителем/детергентом иммуноглобулином. Предпочтительно хотя бы катионообенную обработку проводить с обработанным растворителем/детергентом иммуноглобулином. Ионообменную обработку проводят с иммуноглобулином, растворенным в водном растворителе, обычно с рН около 5-8, с достаточно низкой ионной силой для максимальной адсорбции IgG. Концентрация белка обычно находится в пределах 1-15 (в/о)%, более предпочтительно в пределах 3-10 (в/о)%. Ионообменник уравновешивают тем же самым водным растворителем, в котором растворяют иммуноглобулин. Можно применять как непрерывный, так и порционный (бэтч) процесс. Например, при осуществлении порционной анионообменной обработки раствор иммуноглобулина смешивают с анионообменником в количестве от 10 до 100 мл на мл предварительно обработанного анионообменника (например, 1 г смолы ДЕАЭ Сефадекс А-50 набухает приблизительно до 20 грамм влажного веса в 0,4% растворе хлорида натрия), перемешивание смеси при 0-5^oС на протяжении 0,5-5 ч, с последующим фильтрованием или центрифугированием от 6000 до 8 000 об/мин в течение 10-30 мин с получением супернатанта. При осуществлении непрерывного процесса раствор иммуноглобулина пропускают через колонку с анионообменником со скоростью от 10 до 100 мл на мл анионообменника и собирают несвязавшуюся фракцию.

Используемый анионообменник, например, содержит анионообменные группы, связанные с нерастворимым носителем. К анионообменным группам относятся диэтиламиноэтил (ДЕАЭ), группа четвертичного аминоэтила (QAE) и т.д., а к нерастворимым носителям относятся агароза, целлюлоза, декстран, полиакриламид и т.д.

К приемлемым катионообменникам относятся карбоксиметил Сефадекс (СМ-Сефадекс), СМ-целлюлоза, SP-Сефадекс, СМ-Сефароза и S-Сефароза. 1 мл предварительно обработанного катионообменника (например, 1 г смолы ДЕАЭ Сефадекс С-50 набухает приблизительно до 30-35 г влажного веса в 0,4% растворе хлорида натрия) смешивают с 0.5-5.0 мл раствора иммуноглобулина и перемешивают при 0-5^oС в течение 1 - 6 ч. Суспензию центрифугируют или фильтруют для отделения сорбировавшей IgG смолы. Может также применяться и непрерывный процесс.

При катионообменной обработке в описанных условиях IgG сорбируется и, после промывки сорбировавшей белок катионообменной смолы, IgG можно элюировать, например, 1,4 N раствором хлорида натрия.

После проведения описанных выше этапов процесса IgG осветляют, диафильтруют и концентрируют до необходимой степени. При необходимости можно добавить такой стабилизатор, как D-сорбитол и провести окончательное доведение концентраций с тем, чтобы получить раствор, содержащий около 100 мг/мл IgG и около 50 мг/мл D-сорбитола, с рН около 5,4. Этот раствор затем стерилизуют фильтрованием через стерилизованный фильтр, задерживающий бактерий, и ампулируют.

Следующие примеры приведены для иллюстрации изобретения и не ограничивают его объем.

При необходимости, с описанным выше процессом можно сочетать и другие процедуры очистки иммуноглобулинов. Например, можно использовать этап осветления бентонитом, полезный для снижения количества калликреина и прекалликреин-активатора. Иллюстрацией служит приведенный ниже пример 1.

Пример 1. g глобулин, подвергнутый тепловой обработке и обработке растворителем / детергентом
685 г пасты фракции II+IIIw суспендируют в 11,9 кг холодной воды. К суспензии добавляют раствор ацатат-тригидрата натрия до конечной концентрации около 0,04 М для избирательной солюбилизации IgG. После перемешивания в течение 15 мин рН суспензии доводят до 4,8 ацетатным буфером с рН 4,0. К суспензии добавляют холодный спирт (95%) до конечной концентрации 17%. Во время добавления спирта температуру суспензии постепенно снижают до -6^oС. К суспензии в качестве фильтрующего агента добавляют 303 г Целита 535 (Celite Corporation) до конечной концентрации около 2%. После перемешивания в течение 1 часа Целит и пасту фракции III, содержащие такие ненужные белки, как плазмин, плазминоген, IgA и IgM удаляют фильтрацией с помощью фильтровального пресса. Фильтрат затем осветляют, пропуская через фильтры 0,45 мкм и 0,2 мкм.

рН осветленного раствора фракции II+III доводят до 4.0 добавлением 0,1 N соляной кислоты и концентрируют ультрафильтрацией до объема 3,4 л (1/5 первоначального объема). К концентрированному раствору добавляют холодную воду в объеме, равном объему, удаленному при первой ультрафильтрации, и раствор опять подвергают ультрафильтрации до 1/5 первоначального объема. На этом этапе концентрация белка в растворе составляет около 2%. Раствор концентрируют до примерно 4,0% белка и подвергают диафильтрации против холодной воды до тех пор, пока проводимость раствора не падает ниже 300 мкС/см, что способствует предотвращению агрегатов и снижению денатурации при тепловой обработке. Раствор опять концентрируют до 8,8% белка. К раствору добавляют D-сорбитол до конечной концентрации около 33%. После перемешивания в течение 30 мин рН содержащего сорбитол раствора доводят до 5,5 добавленим 0,5 N гидроксида натрия. Затем раствор нагревают в течение 10 ч при 60^oС. После тепловой обработки к раствору добавляют 3 объема холодной воды и разбавленный раствор охлаждают до 0-2^oС.

рН раствора доводят до 6,9 добавленим 0,25 N гидроксида натрия и к раствору добавляют 50%-ный полиэтиленгликоль (ПЭГ) 3350 до конечной концентрации 4%. Концентрацию хлорида натрия в растворе доводят до 8 мМ для облегчения преципитации примесей и агрегатов при рН 6,9. Образовавшийся преципитат удаляют фильтрацией. рН фильтрата доводят до 4.8 добавленим 0.1 N соляной кислоты и добавляют бентонит конечной концентрации около 0,25%. рН суспензии бентонита доводят до 5,2 и суспензию фильтруют для удаления бентонита. рН фильтрата доводят до 8,5 добавленим 0,25 N гидроксида натрия и к раствору добавляют 50%-ный полиэтиленгликоль (ПЭГ) 3350 до конечной концентрации 12%. Образовавшийся преципитат (очищенный иммунный глобулин) удаляют центрифугированием.

Около 175 г пасты очищенного как описано выше иммуноглобулина суспендируют в 750 г 0,3% раствора хлорида натрия. рН суспензии доводят до 5,5 и суспензию перемешивают 2,5 ч.

К раствору добавляют 62 г предварительно уравновешенной (0,3%-ным раствором хлорида натрия с рН 5,5) смолы СМ-Сефадекс А-50 и суспензию перемешивают 2 ч. Затем суспензию фильтруют для удаления смолы. Концентрацию хлорида натрия доводят до 0.4% и к фильтрату добавляют смесь три-n-бутил фосфата (TNBP) и Полисорбата 80, так, чтобы конечная концентрация TNBP составляла 0,3%, а Полисорбата 80 -1%. После инкубации в течение ночи рН раствора доводят до 5,8 и добавляют 860 г предварительно уравновешенной (0,4%-ным раствором хлорида натрия с рН 5,8) смолы СМ-Сефадекс С-50. После перемешивания в течение 2 ч суспензию фильтруют. После трехкратной промывки смолы СМ-Сефадекс 0,3% хлоридом натрия, адсорбированный IgG элюируют 1,4 N хлоридом натрия. Элюат осветляют и подвергают диафильтрации и концентрированию. Добавляют D-сорбитол и проводят окончательное доведение концентраций с тем, чтобы получить раствор с концентрацией 100 мг/мл IgG и около 50 мг/мл D-сорбитола с рН 5,4. Затем стерилизуют фильтрованием через стерилизованный фильтр, задерживающий бактерий, и ампулируют.

Промежуточный этап обработки бентонитом, описанный в данном примере, полезен для уменьшения присутствия таких гипотензивных ферментов, как калликреин и прекалликреин активатор (см. табл.1).

Пример 2. g глобулин, подвергнутый тепловой обработке и обработке растворителем/детергентом
Один (1) кг пасты фракции II+III суспендируют в 4,5 кг холодной воды при 0-2^oС. После перемешивания в течение 1 ч рН суспензии доводят до 5,0 добавлением 1N соляной кислоты. После перемешивания в течение 3 ч при рН 5.0 преципитат удаляют центрифугированием. К центрифугату добавляют D-сорбитол до конечной концентрации 33% и смесь перемешивают 1 ч. рН суспензии доводят до 5,5 и затем ее прогревают при 60^oС в течение 10 ч. После тепловой обработки к раствору добавляют 3 объема холодной воды и разбавленный раствор охлаждают до 0-2^oС. Добавляют 50%-ный раствор ПЭГ 3350 до конечной концентрации ПЭГа 6%. рН содержащей ПЭГ суспензии доводят до 5,7 добавлением 0,5 N гидроокиси натрия и суспензию перемешивают 2 ч. Промытый кислотой Целит 535 добавляют до конечной концентрации 1,5% и суспензию перемешивают 1 ч. Преципитат вместе с целитом удаляют фильтрацией. рН фильтрата доводят до 8,8 добавлением 0,5 N гидроокиси натрия, концентрацию ПЭГа доводят до 12% добавлением 50%-ного раствора ПЭГ. рН суспензии доводят до 8,8, суспензию перемешивают 1 ч и фильтруют, собирая пасту очищенного иммуноглобулина. Было получено около 251 г пасты очищенного иммуноглобулина.

251 г пасты очищенного иммуноглобулина, полученной как описано выше, суспендируют в 1,4 кг 0,3% раствора хлорида натрия. После перемешивания в течение 1 ч рН суспензии доводят до 6,0 добавлением 5% уксусной кислоты. После полного растворения пасты добавляют 104 г предварительно уравновешенной (0,3%-ным раствором хлорида натрия с рН 6,0) смолы СМ-Сефадекс А-50 и раствор перемешивают 2 ч. Смолу удаляют фильтрацией. Затем фильтрат осветляют фильтрацией через фильтр 0,2 мкм. Концентрацию хлорида натрия в осветленном растворе доводят до 0,4%. Затем к раствору добавляют смесь три-n-бутил фосфата (TNBP) и Полисорбата 80, так, чтобы конечная концентрация TNBP составляла 0,3%, а Полисорбата 80 - 1%. Раствор инкубируют при 27^oС 1 ч и оставляют на ночь в холодильнике при 4^oС. На следующий день рН раствора доводят до 5,8 и добавляют 1,8 кг предварительно уравновешенной (0,4%-ным раствором хлорида натрия с рН 5,8) смолы СМ-Сефадекс С-50. После перемешивания в течение 2 ч смолу удаляют фильтрацией. После трехкратной промывки смолы СМ-Сефадекс 0,3% хлоридом натрия, адсорбированный IgG элюируют 1,4 N хлоридом натрия. Элюат осветляют и подвергают диафильтрации и концентрированию. Добавляют D-сорбитол и проводят окончательное доведение концентраций с тем, чтобы получить раствор с концентрацией 100 мг/мл IgG и около 50 мг/мл D-сорбитола. Раствор делят на две порции, порция А и порция В. рН порции А доводят до 5,4, а рН порции В доводят до 4,3. Затем растворы порций А и В индивидуально стерилизуют фильтрованием через стерилизованные фильтры, задерживающие бактерий, и ампулируют (см. табл.2).

Для квалифицированного специалиста очевидны возможные вариации изобретения.

Изобретение относится к медицине, точнее к препаративной биохимии. Способ получения предназначенного для внутривенного введения раствора гамма-глобулина, по существу свободного от контаминирующих вирусов, включает этапы тепловой обработки для инактивации вирусов при температуре от 50 до 70^oС в течение 10-100 ч в присутствии стабилизатора и фракционирования полиэтиленгликолем неочищенного раствора гамма-глобулина, обработку раствора гамма-глобулина ионообменной смолой с последующей обработкой очищенного гамма-глобулина растворителем-детергентом для дальнейшей инактивации вирусов. Технический результат: разработка объединяющего многоэтапного коммерческого процесса получения гамма-глобулина, который предусматривает удаление денатурированного белка, образовавшегося при тепловой стерилизации, и повышает чистоту препарата. 2 с. и 6 з.п. ф-лы, 2 табл.

1. Способ получения раствора гамма-глобулина, предназначенного для внутривенного введения, включающий: а) тепловую обработку неочищенного раствора гамма-глобулина для инактивации теплочувствительных вирусов при температуре от 50 до 70^oС в течение 10-100 ч в присутствии теплового стабилизатора, в качестве которого используют сахар или сахарный спирт, или аминокислоту; б) фракционирование полиэтиленгликолем прошедшего тепловую обработку раствора гамма-глобулина с получением очищенного раствора гамма-глобулина, при этом фракционирование полиэтиленгликолем осуществляют по меньшей мере в два этапа, примеси удаляют в виде приципитата на первом этапе фракционирования, а гамма-глобулин выделяют в виде приципитата на втором этапе фракционирования полиэтиленгликолем; в) обработку раствора гамма-глобулина анионообменной смолой; г) обработку очищенного раствора гамма-глобулина органическим растворителем для инактивации оболочечных вирусов; и после этого д) обработку раствора гамма-глобулина катионообменной смолой. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что неочищенный раствор гамма-глобулина является фракцией Кона I+II+III, фракцией Кона II+III, фракцией Кона II+IIIw, или фракцией Кона II. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что неочищенный раствор гамма-глобулина подвергают по меньшей мере одному этапу очистки до этапа тепловой обработки. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что этап тепловой обработки осуществляют при температуре около 60^oС в течение около 10 ч. 5. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве органического растворителя, применяемого на этапе (г), используют триалкилфосфат. 6. Способ по п.1, отличающийся тем, что органический растворитель содержит детергент. 7. Способ по п.1, отличающийся тем, что после первого этапа фракционирования полиэтиленгликолем осуществляют этап осветления бентонитом. 8. Раствор гамма-глобулина, предназначенный для внутривенного введения, полученный способом по п.1.