СПОСОБ ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ НЕЙТРОНЗАХВАТНЫХ ПРЕПАРАТОВ ОНКОЛОГИЧЕСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ Российский патент 2000 года по МПК G01N33/48 A61K51/00 

Изобретение относится к медицине, к способам оценки эффективности лекарственных препаратов и может быть использовано в экспериментальных исследованиях в качестве средств скрининговой оценки эффективности потенциальных препаратов для нейтронзахватной терапии опухолей.

В настоящее время число препаратов, используемых в нейтронзахватной терапии опухолей, весьма ограничено и составляет несколько единиц.

Наиболее узким местом в процессе создания нейтронзахватных препаратов является их первичное биологическое изучение, которое длится несколько месяцев и является весьма трудоемким и дорогостоящим. Первичное биологическое исследование основывается на традиционных фармакологических методах оценки [1].

Наиболее близким техническим решением этого вопроса, принятым за прототип, является способ оценки повышения радиочувствительности опухолевых клеток путем инкубации их в присутствии глюкозы, сопровождающийся изменением pH суспензии [2]. Способ включает инкубацию асцитных опухолевых клеток в среде 199 в присутствии глюкозы, облучение γ-лучами ¹³⁷Cs, введение под кожу передних и задних конечностей мышей и оценку радиочувствительности опухолевых клеток по сравнению с контролем. Указанный способ разработан для клеток асцитной карциномы Эрлиха и позволяет оценить изменение радиочувствительности опухолевых клеток при насыщении питательной среды глюкозой. В то же время указанный способ не позволяет оценить эффективность нейтронзахватных препаратов в поражаемости опухолевых клеток при воздействии на них потока тепловых нейтронов. По этой причине он не может быть использован в скрининге потенциальных нейтронзахватных препаратов.

Технической задачей, на которое направлено настоящее изобретение, является сокращение сроков и удешевление исследования, с учетом воздействия на процесс роста опухолевых клеток особенностей целостного организма.

Поставленная техническая задача решена тем, что в способе оценки эффективности нейтронзахватных препаратов онкологического назначения в эксперименте, включающем воздействие на культуры или суспензии клеток экспериментальных или спонтанных опухолей животных ионизирующим излучением с последующей оценкой динамики пролиферативной способности клеток, согласно изобретению суспензию или взвесь опухолевых клеток смешивают с исследуемым нейтронзахватным агентом и смесь подвергают воздействию тепловых нейтронов в различных дозах, после чего смесь вводят экспериментальным животным в бок и ежедневно регистрируют наличие и объем опухоли и сравнивают полученные результаты с контрольными животными, которым введено одинаковое количество таких же клеток опухоли, облученных в отсутствии нейтронзахватного агента.

Изобретение соответствует критерию "единства изобретения", поскольку совокупность существенных признаков: смешение нейтронзахватного агента с культурой или суспензией клеток, облучение тепловыми нейтронами полученной смеси, ее введение лабораторным животным и сравнение пролиферативной способности клеток с контролем направлена на решение одной задачи с получением единого положительного результата.

Положительный результат, полученный при реализации предложенного способа, заключается в следующем: удешевление исследований в несколько раз /3-7 раз/, сокращение продолжительности исследования на 30 - 40%, что позволяет осуществлять скрининг потенциальных нейтронзахватных агентов и быстрый отбор перспективных агентов для дальнейших углубленных биологических исследований.

Разработана методика практического применения способа, проведены экспериментальные исследования на ее основе с положительными результатами, что позволяет считать предложение заявителя соответствующим критерию изобретения "промышленная применимость".

По сравнению с прототипом предложенный способ отличает предварительное смешение суспензии или культуры клеток с нейтронзахватным агентом и воздействие на полученную смесь тепловых нейтронов перед ее введением в организм животного, что позволяет считать предложение заявителя соответствующим критерию "новизна".

Проведенный авторами поиск по патентным и научно-техническим источникам не выявил аналогов предложенному способу, характеризуемых признаками, идентичными по своим свойствам и полученному результату в своей совокупности, существенным признаком предложенного способа, что позволяет считать предложение заявителя соответствующим критерию "изобретательский уровень".

Сущность изобретения заключается в том, что для отбора наиболее перспективных агентов для нейтронзахватной терапии из большого числа гадолиний - и борсодержащих соединений, последние смешивают с суспензией или культурой опухолевых клеток животных. Объем суспензии или клеток - 1,5 мл с содержанием клеток 10⁷ - 10⁹/мл. Количество препарата должно обеспечивать содержание бора 0,3 - 0,4 мг/мл или гадолиния 70 - 90 мг/мл. Приготовленную смесь с бор- и/или гадолинийсодержащим соединением облучают потоком тепловых нейтронов (10⁸ - 10⁹ тн/см²•с) в течение 30 - 60 мин. В качестве контроля используют лабораторных животных с перевитыми опухолями. Результаты - наличие и объем опухолей в опытной группе последовательно сравнивают с результатами следующих контрольных групп, состоящих из животных с перевитыми опухолями: опухоли без каких-либо воздействий, опухоли, облученные тепловыми нейтронами без применения препарата, а также животные с перевитыми опухолями с препаратом без воздействия тепловых нейтронов. Результаты представлены на чертеже.

При воздействии на суспензию опухолевых клеток тепловых нейтронов в течение 1 часа отсутствие роста наблюдали у 4 крыс из 9 (44%). У оставшихся 5 животных отмечено существенное замедление темпов роста опухоли. Коэффициент торможения роста (I_t = S_экс.t/S_контр.t • 100%) составил на 15 сутки - 77%, а на 31 сутки - 46%. Добавление в суспензию перед облучением ¹⁵⁷Cs в концентрации 0,175 мл раствора на 1 мл суспензии, или ¹⁰B в концентрации 0,1 мл раствора на 1 мл суспензии, или комплекса, состоящего из смеси ¹⁵⁷Gd и ¹⁰B в концентрации 0,2 мл раствора на 1 мл суспензии, привело к полному отсутствию роста опухоли у животных (табл. 2). В то же время добавление этих препаратов в одинаковых концентрациях в суспензию без облучения никак не повлияло на рост опухоли.

При воздействии рентгеновского излучения на суспензию опухолевых клеток частичная их гибель наблюдается при облучении в дозе 20 Гр, а полная гибель - при дозе 30 Гр (табл. 1). Воздействие тепловых нейтронов при времени экспозиции в течение 1 час приближается по эффективности к 20 Гр рентгеновского излучения, а добавление исследованных препаратов повышает эффективную дозу, что приводит к эффекту, сопоставимому с облучением в дозе 30 Гр рентгеновского излучения.

Сравнительная пролиферативная способность опухолевых клеток, подвергнутых различным воздействием, приведена на фиг. 1.

Следовательно, терапевтический выигрыш от добавления нейтронзахватных агентов к клеткам составляет - 30%.

Сущность предлагаемого изобретения иллюстрируется следующим примером.

Пример 1 /п. формулы 1, 2/.

Гомогенизируют опухоль /саркома Уокера, Йенсена, C-45/, полученный гомогенат разбавляют стерильным раствором Хенкса в отношении 1:1. Суспензию, по 1,5 мл, переносят в стерильные пластиковые пробирки объемом 2 мл. Контроль 1 - пробирки с интактной суспензией находятся в тех же условиях, что и экспериментальные пробирки, но без облучения. Контроль 2 - пробирки с суспензией, в которые добавлен нейтронзахватный агент (Магневист, Дипентаст и т.д.) так, чтобы содержание гадолиния в суспензии было равным 70 - 90 мг Gd, а содержание ¹⁰B - 0,3 - 0,4 мг в 1 мл исходного гомогената клеток опухоли, пробирки не подвергаются воздействию облучения. Контроль 3 - пробирки с интактной суспензией, облученной потоком тепловых нейтронов. "Опытными" служат пробирки, содержащие суспензию опухолевых клеток с добавленным нейтронзахватным агентом в указанных выше концентрациях и облученные потоком тепловых нейтронов 9 • 10⁸ тн/см²•с. После облучения к контрольным и опытным суспензиям добавляли раствор Хенкса так, чтобы соотношение объема гомогената клеток опухоли и раствора Хенкса равнялось 1:3 (1,5 мл суспензии клеток и 4,5 мл раствора Хенкса). Крысам массой 110 - 120 г инокулировали 0,5 мл рабочей суспензии клеток в подмышечную область. При этом каждой крысе вводили как облученную (в левую подмышечную область), так и контрольную суспензию (в правую подмышечную область). Такое двойное введение позволяет исключить фактор влияния организма животных на развитие опухоли из инокулированных клеток. Каждые три дня измеряют размеры опухоли для оценки скорости ее роста. По достижению диаметра опухоли 4 см животное забивали. Результаты представлены в таблице 2.

В качестве стандартного излучения использовали воздействие рентгеновских лучей на указанное выше количество суспензий опухолевых клеток на установке РУМ-17 в одной из доз (10, 20, 30, 40 Гр) (см. табл. 1).

Источники информации, используемые при составлении описания
1. V.F. Khokhlov et al., in 8-th International Symp. on. Neutron Capture Therapy of Cancer, California, USA, 1997, E-46, p. 78.

2. Шмакова Н. Л. Лазэр К., Ушакова Г.С., Фадеева Т.А., Радиобиология, 1984, т. 24, в. 4. с. 472 - 475.

Способ может быть использован в медицине, а именно к экспериментальной онкологии. Отбирают наиболее перспективные агенты для нейтронзахватной терапии из большого числа гадолиний и борсодержащих соединений. Соединения смешивают с суспензией или культурой опухолевых клеток животных. Объем суспензии или клеток - 1,5 мл с содержанием клеток 10⁷-10⁹/мл, количество препарата должно обеспечивать содержание бора 0,3 -0,4 мг/мл или гадолиния 70-90 мг/мл. Приготовленную смесь с бор- и/или гадолинийсодержащим соединением облучают потоком тепловых нейтронов (10⁸-10⁹тн/см²•с) в течение 30-60 мин. В качестве контроля используют лабораторных животных с перевитыми опухолями. Результаты: наличие и объем опухолей в опытной группе последовательно сравнивают с результатами следующих контрольных групп, состоящих из животных с перевитыми опухолями. Способ обеспечивает сокращение времени исследования. 2 табл., 1 ил.

Способ оценки эффективности нейтронзахватных препаратов онкологического назначения в эксперименте, включающий воздействие на культуры или суспензии клеток экспериментальных или спонтанных опухолей животных ионизирующим излучением с последующей оценкой динамики пролиферативной способности клеток, отличающийся тем, что суспензию или взвесь опухолевых клеток смешивают с исследуемым нейтронозахватным агентом и смесь подвергают воздействию потока тепловых нейтронов не менее 10⁸ тн/см² • с в течение 30 - 60 мин, после чего смесь вводят экспериментальным животным в бок, ежедневно регистрируют наличие и объем опухоли и сравнивают полученные результаты с контрольными животными, которым введено одинаковое количество таких же клеток опухоли, облученных в отсутствии нейтронзахватного агента.