ШТАММ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК РАБДОМИОСАРКОМЫ КРЫСЫ РА-23, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ В КАЧЕСТВЕ МОДЕЛИ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ПРОЦЕССОВ ОРГАНОТРОПНОГО МЕТАСТАЗИРОВАНИЯ И СКРИНИНГА ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ПРЕПАРАТОВ Российский патент 1995 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в экспериментальной онкологии для изучения процессов метастазирования опухолей, обладающих быстрыми темпами роста, высоким уровнем злокачественности, а также для скрининга химиотерапевтических препаратов, подавляющих рост и метастазирование быстрорастущих опухолей.

Описаны штаммы опухолевых клеток мышей, обладающие органотропным метастазированием в легкие: мышиные меланомы В16 и К-1735, мышиные фибросаркомы UV-2237 и SF. При получении известных органотропных штаммов, как правило, использовалось лишь 2-15 циклов секции; частоты метастазирования таких штаммов в орган-мишень низки, что в значительной степени осложняет изучение метастазирующих клеточных вариантов опухолей.

Наиболее близким к заявляемому штамму является штамм рабдомиосаркомы РА-2 крыс, полученный в Институте цитологии АН СССР путем многократного отбора на аффинитет к легочной ткани. Штамм РА-2 характеризуется аффинитетом к легочной ткани и сравнительно высокой, по сравнению с аналогами, способностью к метастазированию (0,013-0,006), однако темпы формирования метастазов и клоногенная способность штамма недостаточно высокие; недостаточно высоки и темпы роста легочных метастазов: время от внутривенного введения клеток до формирования легочных метастазов массой 10-20 мг составляет 23-24 сут.

Целью предлагаемого изобретения является получение штамма клеток рабдомиосаркомы крыс с наследственно повышенной способностью к метастазированию и быстрыми темпами формирования и роста метастазов.

Заявляемый штамм РА-23 получен длительной массовой селекцией (262 цикла) на повышение метастатического потенциала и ускорение темпов формирования метастазов на основе штамма клеток РА-2.

Селекцию штамма РА-23 проводили в условиях in vivo при помощи внутривенных перевивок (через 17-19 сут) суспензии одиночных опухолевых клеток, приготовляемой из 25-30 наиболее крупных легочных метастазов с использованием ростовой среды Игла. Доза вводимых опухолевых клеток осставляла 2000 клеток на одно животное. Штамм хранится в Банке перевивных штаммов ВОНЦ АМН СССР, регистрационный N 10009.

Особенности культивирования штамма в условиях in vitro. Штамм культивировали на ростовой среде 199 с добавлением 10% сыворотки эмбриона коровы, 2 мМ глутамина, 0,08 мг/мл гентамицина. Культивировали при 37^оС в герметичных флаконах. Кратность посева 1:3 при пересеве через 72 ч. Посевная доза клеток 2х10⁵/мл. Криоконсервацию клеток проводили в той же среде с добавлением 10% , диметилсульфоксида при концентрации клеток 10⁶ клеток/мл. Жизнеспособность после размораживания составляла 80-90%.

Ростовые характеристики штамма.

Прививаемость животным при внутривенных инъекциях 2х10³ клеток/животное - 90-95% , при подкожном введении суспензий опухолевых клеток в дозе 10⁶ клеток/животное - 90%; аффинитет к легочной ткани 100% (экспериментальные метастазы зарегистрированы только в тканях легкого); частота формирования метастазов при внутривенных инъекциях клеток - 0,06-0,008. Время от внутривенного введения клеток до формирования легочных метастазов массой 10-20 мг составляет 17-18 сут.

Морфологические характеристики штамма.

Штамм представляет собой низкодифференцированную полиморфоклеточную рабдомиосаркому. Основные клеточные элементы - округлые (9-14 мкм), веретеновидные (10-23 мкм) и плеоморфные клетки. Штамм характеризуется околотетраплоидным содержанием ДНК (диплоидный индекс 1,97-2,04). Клеточная популяция РА-23 кариологически гетерогенна (39-90 хромосом) клетки модальных классов имеют 69-70 хромосом, морфологически неизменные хромосомы представлены 3-4 копиями на кариотип, охарактеризовано 17 специфических маркерных хромосом.

Радиочувствительность штамма.

Штамм РА-23 обладает сравнительно высокой радиоустойчивостью по показателю "репродуктивная гибель клеток" и низкой репаративной способностью. Значения параметров кривой выживаемости клеток штамма РА-23 после их облучения в диапазоне до 1-10 Гр и последующего тестирования методом легочных колоний равны: D_o = =2,4 Гр, D_q = 1 Гр, n = 1,5.

Особенностями штамма являются высокая метастатическая активность, быстрые темпы формирования и роста легочных метастазов, наличие охарактеризованного с помощью методов иммуноаффинной хроматографии и иммуноблотинга маркерного белка р58, - рецептора клеточной поверхности, необходимого для реализации опухолевой клеткой способности к метастазированию.

П р и м е р 1. Для изучения связи между кариотипической нестабильностью опухолевых клеток и их способностью формировать метастазы суспензию одиночных опухолевых клеток штамма РА-23 (концентрация клеток 10⁵/мл) в среде Игла вводили внутривенно 15 белым беспородным крысам (0,2 мл/животное). Через 18 сут после внутривенной прививки животных, предварительно усыпленных эфиром, забивали, извлекали легкие и подсчитывали число легочных метастазов (клонов). 30 легочных метастазов освобождали от легочной ткани, получали от каждого метастаза мазки-отпечатки клеток, после чего метастаз в среде Игла помещали в холодильник при 4^оС. Препараты клеток окрашивали по Романовскому-Гимза и определяли частоту встречаемости клеток с микроядрами (ЧМК), которая, как известно, характеризует степень кариотипической нестабильности соматических клеток. Этот показатель в исследованной выборке метастазов варьировал от 0,2 до 4,5% (при среднем значении 1,3%). Через 12 ч метастазы с высокими показателями ЧМК (4,0-4,5%) извлекали из холодильника, обрабатывали трипсином и полученную суспензию клеток вводили внутривенно по описанной выше методике. Через 17 сут определяли число легочных метастазов.

На чертеже представлен метастатический потенциал клеток РА-23, полученных от экспериментальных метастазов с низкими (а) и высокими (б) частотами встречаемости клеток с микроядрами.

Как видно из приведенных данных, опухолевые клетки с высокой частотой образования микроядер обладают пониженным метастатическим потенциалом.

П р и м е р 2. Для изучения агентов, индуцирующих восстановление репродуктивной способности опухолевых клеток штамма РА-23 в среде Игла облучали на аппарате ЛМБ-1 (мощность дозы гамма-лучей 26 Гр/мин) в дозах 150, 300 и 400 Гр. В половину флаконов с одиночными опухолевыми клетками добавляли 5-азоцитидин (20 мкг/мл), после чего помещали флаконы в термостат при 37^оС на 4 ч. Затем клетки прививали внутривенно белым беспородным крысам в дозе 2х10⁵ на животное. Через 18 сут животных, предварительно усыпленных эфиром, декапитировали, вскрывали и подвергали исследованию легкие. В контроле (прививка облученных клеток) формирования легочных колоний ни у одной из 122 привитых крыс не наблюдалось. В варианте с добавлением 5-азацитидина у 60 привитых крыс обнаружено 20 экспериментальных легочных метастазов. Таким образом, благодаря высокой метастатической активности штамма РА-23 удается обнаруживать опухолевые клетки, восстанавливающие пролиферативную активность после массивных доз облучения.

П р и м е р 3. Для изучения роли белков клеточной поверхности в органотропном метастазировании исходная суспензия клеток РА-23 была поделена на три равным части по 10⁷ клеток в каждой порции. Первая порция клеток служила контролем и, не была подвергнута какой-либо обработке, вторая порция в качестве контроля на неспецифические белки клеточной поверхности была обработана антителами против PDGF-рецептора в концентрации 800 мг/мл в течение 1 ч при 4^оС, а третья - поликлональными антителами (ПАТ) против поверхностного белка клеток рабдомиосаркомы РА-23 с мол.м. 58 кДа (р58) при тех же условиях и в той же концентрации. После этого клетки вводились внутривенно животным в дозе 10⁴ на животное (по 20 крыс на вариант). В качестве контроля на токсичность антител, а также на их влияние на пролиферативную активность клеток была использована подкожная инъекция интактных и обработанных антителами клеток в дозе 10⁶ на животное (5 крыс на вариант). Через 17 сут животных, предварительно усыпленных эфиром, забивали и производили подсчет опухолевых узлов. Результаты были следующие: контрольный вариант 1 (необработанные клетки) - 76,2+17,22; контрольный вариант 2 (клетки, инкубированные в течение 1 ч с неспецифическими IgG) 63,1+12,98; вариант с инкубацией с ПАТ против р58 - 1,8+0,64. Таким образом, было показано значительное понижение способности к метастазированию в случае применения ПАТ, направленных против белка р58. В случае подкожных инъекций не было зарегистрировано какого-либо различия между вариантами ни по количеству сформированных подкожных опухолей, ни по их размерам. Приведенные данные позволяют сделать вывод, что поверхностный белок р58 у клеток рабдомиосаркомы РА-23 играет существенную роль в процессе метастазирования, а штамм РА-23 может быть успешно использован для изучения белков клеточной поверхности.

Таким образом, заявляемый штамм, как было установлено в экспериментах, обладает значительно (в 4-5 раз) более высокой метастатической активностью (0,06+0,008), по сравнению с прототипом - штаммом РА-2 (0,013+0,006). Темпы формирования метастазов клетками заявляемого штамма сократились по отношению к прототипу на 6 сут. Из этого следует, что заявляемый штамм может быть использован в качестве эффективной модели для изучения процесса метастазирования и скриннинга противоопухолевых препаратов.

Использование: биотехнология, медицина. Сущность изобретения: штамм получен путем длительной массовой селекции /262 цикла/ на повышение метастатического потенциала и ускорение темпов формирования метастазов на основе штамма рабдомиосаркомы аффинитетной РА-2. Штамм пассируется на белых беспородных крысах путем внутривенного введения суспензии одиночных клеток через 17 - 19 сут. Штамм обладает высокой метастатической активностью, быстрыми темпами формирования и роста легочных метастазов, наличием маркерного белка р 58-рецептора клеточной поверхности, необходимого для реализации опухолевой клеткой способности к метастазированию. 1 ил.

ШТАММ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК РАБДОМИОСАРКОМЫ КРЫСЫ РА-23, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ В КАЧЕСТВЕ МОДЕЛИ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ПРОЦЕССОВ ОРГАНОТРОПНОГО МЕТАСТАЗИРОВАНИЯ И СКРИНИНГА ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ПРЕПАРАТОВ.

Штамм опухолевых клеток рабдомиосаркомы крысы РА-23 ВОНЦ N 10009, используемый в качестве модели для изучения процессов органотропного метастазирования и скрининга противоопухолевых препаратов.