ШТАММ ДИПЛОИДНЫХ КЛЕТОК ФИБРОБЛАСТОВ ЛЕГКИХ ЭМБРИОНА ЧЕЛОВЕКА, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ ВИРУСА Российский патент 2000 года по МПК C12N5/08 C12N7/00 

Изобретение относится к новому штамму диплоидных клеток фибробластов легких эмбриона человека, пригодных для получения вируса, и к способу получения вируса Varicella zoster с помощью упомянутого штамма в качестве клетки-хозяина.

Описание предшествующего уровня техники.

Вирусы вызывают различные заболевания, такие как корь, краснуха, эпидемический паротит, ветряная оспа, геморрагическая лихорадка с почечным синдромом, японский энцефалит B, детский полиомиелит, гепатит A, гепатит B, гепатит C и натуральная оспа. Эти вирусные заболевания можно предотвратить путем инокуляции вакцин, полученных из инактивированных или ослабленных патогенных вирусов.

Обычно в качестве клеток-хозяев для получения таких вирусных вакцин используют куриные эмбрионы, клетки мозга крысят и диплоидные клетки млекопитающих. Несмотря на то что куриные эмбрионы или клетки мозга крысят могут использоваться в качестве клеток-хозяев для снижения стоимости производства, их использование невыгодно из-за низкой восприимчивости к вирусам, сложных способов очистки и побочных эффектов, возникающих вследствие наличия контаминантов в виде чужеродных белков. Напротив, использование нормальных диплоидных клеток человека может уменьшить побочные эффекты, вызываемые чужеродными балками, и, следовательно, они являются более предпочтительными для получения вирусных вакцин.

Типичные диплоидные клетки человека включают клеточный штамм MRC-5 (АТСС, CCL 171), клеточный штамм WI-38 (АТСС, CCL 75) и клеточный штамм HEL 299 (АТСС, CCL 137): особенно, клеточный штамм MRC-5, получаемый из легочной ткани 14-недельных эмбрионов мужского пола (Proc. Symp. Human Diploid Cells, Yugoslavia. Acad. Sci. Arts. Zagreb., стр. 43-45 (1970); и Nature (London), 227, стр. 168-170 (1970)); WI-38, получаемый из легочной ткани 3-месячных эмбрионов женского пола (Exp.Cell Res., 25, стр. 585 (1961) и Am.J.Hyg., 75, стр. 240 (1962)) и клеточный штамм HEL 299, получаемый из легочной ткани эмбрионов мужского пола (W. D.Peterson, Jr. et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 128, стр. 772 (1968)).

Ветряная оспа является высококонтагиозным заболеванием, которое поражает детей, пожилых людей и пациентов со сниженным иммунитетом вследствие инфицирования вирусом Varicella zoster (VZV). Сообщалось, что VZV можно культивировать на различных клетках, таких как клетки амниона человека, клетки щитовидной железы человека, клетки легких человека, клетки шейки матки человека Hela и клетки почки обезьяны (см. E.V. Meurisse et al., J .Microbiol., 2, 317 (1969)). Далее, патент США N 3985615 раскрывает получение вакцины VZV путем многократной аттенуации вируса Oka на клетках первичной эмбриональной ткани морских свинок (GPEC); патент США N 4000256 описывает получение вакцины VZV путем субкультивирования от 10 до 80 раз клеточного штамма эмбриональных фибробластов человека WI-38, содержащего вирус VZV; патент США N 4000317 описывает получение чувствительного к температуре мутанта VZV на клеточном штамме WI-38 и патент США N 5360736 раскрывает усовершенствованный способ получения вакцины VZV на клеточном штамме MRC-5.

Однако выход VZV при использовании клеток GPEC очень мал. Далее, клеточные штаммы WI-38 и MRC-5 многократно пассируются, снижая таким образом свою способность вырабатывать VZV. Таким образом, вышеупомянутый способ не может применяться для широкомасштабного производства вакцины VZV. Далее, VZV имеет тенденцию инактивироваться в среде, лишенной клеток, вследствие своих клеточно-зависимых свойств.

Краткое изложение сущности изобретения.

Соответственно, целью настоящего изобретения является создание нового штамма диплоидных клеток человека, обладающего высокой восприимчивостью к различным вирусам, особенно к VZV, и обеспечение высокого выхода VZV.

Другой целью настоящего изобретения является создание усовершенствованного способа для получения VZV.

В соответствии с одной особенностью настоящего изобретения создан штамм диплоидных клеток фибробластов LBHEL (KCTC 0127BP), полученный из клеток эмбриональных легких человека. В соответствии с другой особенностью настоящего изобретения создан также способ получения вируса Varicella zoster (VZV), не содержащего клеток, который включает этапы:
(а) культивирования диплоидного клеточного штамма фибробластов эмбриональных легких человека LBHEL (KCTC 0127BP) в сосуде для культивирования с целью получения культивируемых клеток LBHEL;
(b) инфицирования культивируемых клеток LBHEL с помощью VZV с целью получения VZV-инфицированных клеток;
(с) культивирования и сбора VZV-инфицированных клеток;
(d) разрушения собранных клеток с целью получения клеточного гомогената и
(е) центрифугирования клеточного гомогената с целью получения супернатанта, содержащего VZV, лишенного клеток.

Краткое описание чертежей.

Вышеперечисленные и прочие цели и признаки настоящего изобретения будут понятны из следующего их описания в сочетании с прилагаемыми чертежами, в которых:
фиг. 1-1 и 1-2 показывают кариотип клеточного штамма LBHEL настоящего изобретения;
фиг. 2 представляет кривые роста: клеточного штамма LBHEL настоящего изобретения клеточного штамма MRC-5 (▪) и клеточного штамма HEL299
фиг. 3 изображает количество клеток, подсчитанное после культивирования клеточного штамма LBHEL настоящего изобретения, клеточного штамма MRC-5 и клеточного штамма HEL299 на модифицированной по способу Дульбекко среде Игла, содержавшей 5% или 10% сыворотки плода коровы;
фиг. 4 представляет изменение количества бляшкообразующих единиц (БОЕ) VZV, не содержащего клеток, на клеточном штамме LBHEL настоящего изобретения в зависимости от множественности инфицирования;
фиг. 5 показывает зависимость цитопатогенного эффекта от количества БОЕ VZV, не содержащего клеток, на клеточном штамме LBHEL настоящего изобретения;
фиг. 6 показывает изменение БОЕ VZV, не содержащего клеток, в зависимости от содержания неинфицированных клеток штамма LBHEL и
фиг. 7 иллюстрирует как изменяется количество БОЕ VZV, не содержащего клеток, в зависимости от степени покрывания клетками поверхности сосуда для культивирования клеток.

Подробное описание изобретения.

Используемый в настоящем документе термин "вирус, не содержащий клеток," означает вирус, который не связан с его клеткой-хозяином.

Новый клеточный штамм LBHEL настоящего изобретения, полученный из диплоидных клеток фибробластов эмбриональных легких человека, можно получить следующим образом.

Сначала берут малую порцию ткани эмбриональных легких человека у 20-недельного эмбриона женского пола, имеющего кариотип, показанный на фиг. 1-1 и 1-2. Эту ткань измельчают на маленькие кусочки и отмывают фосфатным буфером (pH от 7,1 до 7,3). Ткань затем культивируют в фосфатном буфере, содержащем коллагеназу и диспазу ("ферментный раствор") при температуре от 36 до 37^oC в атмосфере, содержащей 5% CO₂, в течение 5-10 минут. Полученную культуру центрифугируют при 30-50g и осажденную легочную ткань культивируют в вышеупомянутом ферментном растворе при температуре от 36 до 37^oC в течение 20-40 минут. Супернатант полученной культуры затем нейтрализуют 5%-ной (по объему) сывороткой плода коровы (СПК). Эту ферментативную обработку повторяют 3-4 раза до тех пор, пока не останется только соединительная ткань.

Затем объединенный тканевый экстракт оставляют стоять при температуре от 4 до 5^oC в течение приблизительно 1 часа для выпадения клеточных агрегатов, а полученный супернатант, содержащий отдельные клетки, отделяют и центрифугируют на 800-100 об./мин в течение 1-2 минут. Осажденные клетки собирают, диспергируют в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла, содержащей 5-10% (о./о.) СПК до концентрации 5-10•10⁶ клеток в мл, а затем культивируют во флаконе Т80 при 36-37^oC до тех пор, пока поверхность сосуда для культивирования не покроется клетками. После обработки трипсином культивируемые клетки подвергаются серийному субкультивированию.

Клеточный штамм LBHEL настоящего изобретения, полученный как описано выше, депонирован 9 ноября 1994 г. в Корейской коллекции типовых культур (KCTC) (адрес: GERI, KIST, P.O. Box 115, Yusong, Taejon, 305-600, Republic of Korea) под номером KCTC 0127 BP в соответствии с условиями Будапештского договора по международному признанию депозита микроорганизма для целей процедуры выдачи патента.

Тестом на хромосомные аномалии подтверждено, что клеточный штамм LBHEL настоящего изобретения является обычным диплоидным клеточным штаммом и не вызывает образования опухолей в экспериментах на животных. Далее, он растет гораздо быстрее, чем традиционные клеточные штаммы, такие как MRC-5 и HEL299, и имеет повышенную восприимчивость к различным вирусам. Более того, он сохраняет ту же скорость роста даже после 30 поколений субкультур.

Новый клеточный штамм LBHEL настоящего изобретения имеет следующие характеристики:
(1) Скорость роста клеток.

По сравнению со стандартным клеточным штаммом MRC-5 клеточный штамм LBHEL растет быстрее приблизительно в 2 раза, а количество клеток, получающихся из него на фиксированной площади поверхности, превышает таковое у MRC-5 в 1,7 и более раз.

(2) Идентификация бляшек.

Когда клеточный штамм LBHEL настоящего изобретения используется в качестве клетки-хозяина для определения титра вируса, образующиеся бляшки можно легко идентифицировать, а его воспроизводимость лучше, чем у MRC-5.

(3) Содержание СПК.

Стандартные штаммы диплоидных нормальных клеток человека, включая MRC-5, WI-38 и HEL299, обычно культивируют на среде, содержащей 10% (о./о.) СПК, в то время как клеточный штамм LBHEL настоящего изобретения хорошо растет на среде, содержание СПК в которой составляет только 5%. Поскольку СПК стоит дорого, клеточный штамм LBHEL предлагает значительную выгоду в сокращении стоимости производства.

(4) Восприимчивость к VZV.

Как показано в таблице 1, клеточный штамм LBHEL настоящего изобретения имеет гораздо более высокую восприимчивость к VZV по сравнению со стандартными штаммами диплоидных нормальных клеток человека, включая MRC-5, HEL299 и Lu18. Это предполагает, что VZV лучше растет на клеточном штамме LBHEL настоящего изобретения, чем на стандартных штаммах диплоидных нормальных клеток человека, упомянутых выше.

Клеточный штамм LBHEL настоящего изобретения может использоваться как клетка-хозяин для получения различных вирусов, таких как вирусы кори, краснухи, гепатита A и вакцины натуральной оспы.

VZV, не содержащий клеток, может быть получен с помощью клеточного штамма LBHEL настоящего изобретения следующим образом:
(1) Клеточная культура.

Клеточный штамм LBHEL настоящего изобретения можно культивировать на модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (Gibco BRL, USA, N в каталоге 12800-082), содержащей 5-10% (о. /о.) СПК при температуре от 36 до 37^oC в атмосфере, содержащей 5% CO₂ для формирования монослоя.

Коэффициент разведения клеток в монослойной культуре может варьировать от 1:5 до 1:10. Клеточную культуру предпочтительно поддерживают до тех пор, пока 70-80% поверхности сосуда для культивирования не покроется клетками, а затем культивируемые клетки подвергаются серийному субкультивированию.

(2) Размножение VZV.

VZV можно инокулировать в культивируемый клеточный штамм LBHEL, полученный как описано выше, при множественности инфицирования от 1:15 до 1:20. Через 1-1,5 часа после инокуляции инфицированные клетки можно культивировать на модифицированной по способу Дульбекко среде Игла, содержащей 2-5% СПК, при температуре от 36 до 37^oC в атмосфере, содержащей 5% CO₂, в течение 40-48 часов. Инфицированные клетки можно собирать, когда цитопатогенный эффект, наблюдаемый под микроскопом (100х), достигает 50% или менее, предпочтительно от 30 до 45%. Конкретно, клеточную культуру отмывают фосфатным буфером (pH 7,2) и обрабатывают 0,01-0,03% ЭДТК. Затем ее культивируют в течение 5 минут, после чего центрифугируют для сбора VZV-инфицированных клеток.

(3) Разрушение клеток и выделение VZV, не содержащего клеток.

VZV-инфицированные клетки, собранные как описано выше, можно разрушить любым известным способом, таким как обработка ультразвуком и стеклянными бусами. Затем продукты распада клеток можно удалить любым известным способом, таким как центрифугирование и фильтрование, для получения супернатанта, содержащего лишенный клеток VZV.

Когда VZV находится вне клетки-хозяина, в силу клеточно-зависимого свойства его жизнеспособность практически нулевая. Соответственно, этот вирус легко инактивируется, когда инфицированная вирусом клетка разрушается. Упомянутый выше патент США N 4000256 описывает попытку защитить VZV во время этапа разрушения клеток путем добавления приблизительно 7,5 вес.% сахарозы в фосфатном буфере. Когда VZV-инфицированные клетки разрушаются ультразвуковой волной, сам вирус часто разрушается и инактивируется, снижая таким образом выход вируса, не содержащего клеток. Однако использование сахарозной "подушки" не может предотвратить это разрушение и инактивацию вируса.

Снижение выхода вируса, не содержащего клеток, во время обработки ультразвуком можно эффективно предотвратить путем смешивания перед этапом ультразвуковой обработки неинфицированных клеток LBHEL с инфицированными. В осуществлении на практике настоящего изобретения неинфицированные клетки LBHEL смешивают с инфицированными клетками LBHEL в соотношении от 1:4 до 3: 2.

Тем не менее, описанный выше способ часто вызывает образование большого количества продуктов распада клеток, приводя, таким образом, к некоторой потере вируса, не содержащего клеток, во время этапа очистки, такого как фильтрование и центрифугирование. С целью решения этой проблемы настоящее изобретение во время этапа очистки, такого как центрифугирование, применяет раствор сахарозы. Концентрация сахарозы может составлять 15 вес.% или более, предпочтительно от 15 до 45 вес.%.

Полученный описанным выше способом VZV можно использовать для изготовления вакцин обычными способами, такими как аттенуация вируса или добавление вирусных антигенов.

Настоящее изобретение далее описывается и иллюстрируется примерами и тест-примерами, которые, однако, не предназначены для ограничения объема притязаний настоящего изобретения.

В примерах использовали коммерчески доступный VZV, вирус Varicella Biken Oka (АТСС VR-795, N 6w). В настоящем документе, выше и ниже, MRC-5, HEL299 и Lu18, полученные из АТСС, нумеруются как пассаж N1.

Термины и аббревиатуры в настоящем документе используются в их общепринятом значении, если не указывается иное, например: "^oC" относится к градусам по Цельсию; "M" относится к молярности; "о./о." относится к объему на объем и "в./о." относится к весу на объем.

Пример 1. Получение клеточного штамма LBHEL.

Малую порцию ткани эмбриональных легких человека брали у 20-недельного эмбриона женского пола, имеющего кариотип, показанный на фиг 1. Эту ткань измельчали на маленькие кусочки (2 х 2 мм) и трижды отмывали фосфатным буфером (pH от 7,2). Полученные кусочки ткани культивировали" при температуре 36^oC в течение 5 минут в фосфатном буфере (pH от 7,2), содержащем 130 единиц/мл коллагеназы и 1 мг/мл диспазы ("ферментный раствор"). Культуру центрифугировали при 200g в течение 2 минут для осаждения легочной ткани. Ткань собирали и культивировали в вышеупомянутом ферментном растворе при температуре 37^oC в течение 30 минут. Культуру центрифугировали при 50g в течение 2 минут, а супернатант нейтрализовали добавлением 5%-ной сыворотки плода коровы (СПК). Эту ферментативную обработку повторяли 4 раза до тех пор, пока не осталась только соединительная ткань.

Объединенный супернатант нейтрализовали 5% СПК, оставляли стоять при температуре 4^oC в течение 1 часа для выпадения клеточных агрегатов, а полученный супернатант, содержащий отдельные клетки, центрифугировали на 1000 об. /мин в течение 2 минут. Осажденные клетки собирали, диспергировали в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (Gibco BRL, USA, N в каталоге 12800-082), содержащей 10% (о./о.) СПК до концентрации 3•10⁶ клеток в мл, а затем культивировали в T-флаконе при 37^oC до тех пор, пока поверхность сосуда для культивирования не покрывалась клетками. После обработки 0,25%-ным раствором трипсина клетки подвергали серийному субкультивированию.

Пример 2. Получение вируса VZV на клеточном штамме LBHEL.

Стадия 1. Клеточная культура.

Клеточный штамм LBHEL, приготовленный в примере 1, культивировали на модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (Gibco BRL, USA, N в каталоге 12800-082), содержащей 5% СПК при 37^oC в атмосфере, содержавшей 5% CO₂, для формирования монослоя.

Коэффициент разведения клеток в монослойной культуре был доведен до 1:4. Культуру поддерживали до тех пор, пока 85-95% поверхности сосуда для культивирования не покрылись клетками, а затем культивируемые клетки подвергали серийному субкультивированию.

Стадия 2. Размножение VZV.

Вирус Varicella Biken Oka (ATCC VR-795, N 6w) инокулировали в культивируемый клеточный штамм LBHEL при множественности инфицирования 1:20. Активность вируса составляла от 100000 до 200000 бляшкообразующих клеток (БОК) на флакон Т80 (2 мл). VZV-инфициpoвaнныe клетки культивировали при 37^oC в атмосфере, содержавшей 5% CO₂. Когда цитопатогенный эффект, наблюдавшийся под микроскопом, достигал 25-45%, культуру трижды отмывали фосфатным буфером (pH 7,2), а затем обрабатывали 0,02% ЭДТК. Затем ее культивировали в течение 5 минут, после чего инфицированные клетки собирали и центрифугировали на 1000 об./мин для сбора инфицированных клеток.

Стадия 3. Разрушение клеток.

Инфицированные клетки LBHEL суспендировали в разрушающем растворе SPGE (pH 7,2, 7,5% (в./о.) сахарозы, 0,0038 М одноосновного фосфата калия, 0,0072 М двухосновного фосфата калия, 0,0049 М глутамата натрия, 0,2% ЭДТК) до концентрации 5-10•10⁶ клеток/1 мл. Клетки разрушали с помощью игольчатого наконечника (флакон Т80) или "рога" (многопланшетная установка, CF-10) с помощью ультразвукового дезинтегратора (Sonifier, Branson 450) в ледяной бане, до тех пор, пока не оставалось больше протоплазмы.

Стадия 4. Выделение VZV, не содержащего клеток.

Полученное центрифугировали на 1000 об./мин в течение 10 минут для получения супернатанта, содержащего VZV.

Тест-пример 1: Нормальность клеточного штамма LBHEL.

1). Тест на хромосомные аномалии.

Клеточный штамм LBHEL, полученный в примере 1, подвергали тестам на хромосомные аномалии, включавшие хромосомный полиплоидный тест, тест на диплоидность, тест на аномалии формы, тест на расщепленные хромосомы и тест по анализу кариотипа. Все тесты выполняли, используя клеточный штамм MRC-5 в качестве отрицательного контроля в соответствии с положениями "Biological formulation standard and test method therefor (1992)", опубликованного Министерством здравоохранения Кореи. Фиг. 1-1 и 1-2 показывают кариотип клеточного штамма LBHEL настоящего изобретения.

2). Тест на онкогенность.

Приблизительно по 2•10⁶ клеток клеточного штамма LBHEL, полученного в примере 1, и клеточного штамма Hela, полученного из АТСС, инъецировали подкожно 5 или более голых мышей, имевших дефицит клеточного иммунитета. Спустя 28 дней после инъекции у мышей, которым инъецировали LBHEL, опухолей не наблюдалось, в то время как у всех мышей, получивших инъекцию клеточного штамма Hela, развились опухоли.

Эти экспериментальные результаты подтверждают, что клеточный штамм фибробластов эмбриональных легких человека LBHEL настоящего изобретения представляет из себя нормальную диплоидную клетку.

Тест-пример 2: Сравнение кривых роста клеток штаммов.

Кривую роста клеток штамма LBHEL настоящего изобретения (KCTC 0127BP) строили путем определения количества клеток как функции от времени роста следующим образом, а затем сравнивали с таковыми клеточных штаммов MRC-5 (АТСС CCL 171) и HEL299 (АТСС CCL 137).

Каждый из испытуемых клеточных штаммов культивировали во флаконах Т80 для получения монослоя в соответствии с процедурой этапа 1 примера 2. Клетки трижды отмывали фосфатным буфером (pH 7,2) и обрабатывали 0,25%-ным трипсином. Спустя 2 минуты клетки собирали и центрифугировали на 1000 об./мин в течение приблизительно 3 минут.

Осажденные клетки суспендировали в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла, содержавшей 5% СПК для LBHEL и 10% СПК - для MRC-5 и HEL299, а затем добавляли во флаконы Т80 в количестве 2•10⁶ клеток на флакон. Клетки культивировали при 37^oC в атмосфере, содержавшей 5% CO₂.

Через каждые 24 часа количество клеток определяли следующим образом: сначала культуру трижды отмывали фосфатным буфером (pH 7,2) и обрабатывали 0,25% трипсином. Спустя 2 минуты клетки собирали и центрифугировали на 1000 об./мин в течение приблизительно 3 минут. Осажденные клетки суспендировали в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла и каплю этой суспензии помещали в гемоцитометр (Hausser Scientific). Количество клеток подсчитывали под микроскопом (100х).

Фиг. 2 иллюстрирует количество клеток, подсчитанных как функция от времени культивирования, для клеточного штамма LBHEL настоящего изобретения клеточного штамма MRC-5 (▪) и клеточного штамма HEL299 Как показано на фиг. 2, клеточный штамм LBHEL демонстрировал лог-фазу на один день раньше по сравнению с клеточными штаммами MRC-5 и HEL299, а количество клеток клеточного штамма LBHEL было больше, чем MRC-5 и HEL299, приблизительно в 1,5 раза.

Фиг. 3 изображает количество клеток клеточного штамма LBHEL настоящего изобретения, клеточного штамма MRC-5 и клеточного штамма HEL299 после культивирования на модифицированной по способу Дульбекко среде Игла, содержавшей 5% или 10% СПК, в течение 10 дней. Как показано на фиг. 3, количество клеток LBHEL, культивированных на среде, содержавшей 5% СПК, было приблизительно таким же, как и при культивировании на среде, содержавшей 10% СПК. Напротив, клеточный штамм MRC-5 или HEL299 не показывал хорошего роста на среде, содержавшей 5% СПК. Это позволяет предполагать, что LBHEL настоящего изобретения более выгоден экономически, чем другие общеизвестные клеточные штаммы.

Далее, клеточный штамм LBHEL настоящего изобретения хорошо рос после 20 пассажей. Он также хорошо рос на многопланшетной установке (Nunc 164327, 6000 см²), что позволяет использовать клеточный штамм LBHEL для широкомасштабного получения вируса.

Тест-пример 3: Восприимчивость к VZV.

Каждый из клеточных штаммов, представленных в таблице II, культивировали на чашках Петри диаметром 60 мм для получения монослоя, в соответствии с процедурой стадии 1 примера 2, и культивируемые клетки трижды отмывали фосфатным буфером (pH 7,2).

Вирус Varicella Biken Oka серийно разводили модифицированной по способу Дульбекко среде Игла, содержавшей 3% СПК. Разведенную вакцину инокулировали в клетки в количестве 0,1 мл на чашку. Туда добавляли модифицированную по способу Дульбекко среду Игла, содержавшую 3% СПК, и культивировали при 37^oC в атмосфере, содержавшей 5% CO₂, в течение 7 дней.

Количество образовавшихся бляшек подсчитывали под микроскопом (40х) и определяли БОЕ для оценки чувствительности каждого клеточного штамма к вирусу. Результаты представлены в таблице II.

Как показано в таблице II, восприимчивость клеточного штамма LBHEL по сравнению с таковой клеточных штаммов MRC-5, HEL299 и Lul8 больше приблизительно в 10 раз. Следовательно, клеточный штамм LBHEL настоящего изобретения пригоден для производства вакцины VZV.

Тест-пример 4: Размножение VZV на клеточных штаммах.

Стадия 1. Инокуляция VZV и сбор инфицированных клеток.

Каждый из клеточных штаммов, представленных в таблице III, культивировали на флаконах Т80 для получения монослоя в соответствии с процедурой стадии 1 примера 2, и культивируемые клетки трижды отмывали фосфатным буфером (pH 7,2).

Клетки MRC-5, инфицированные вирусом Varicella Biken Oka, инокулировали в клетки при активности вируса 100000 - 200000 БОЕ на флакон (2 мл).

Спустя 1 час туда добавляли модифицированную по способу Дульбекко среду Игла, содержавшую 3% СПК, и культивировали при 37^oC в атмосфере, содержавшей 5% CO₂, в течение приблизительно 48 часов. Когда цитопатический эффект достигал 25-45%, культуру трижды отмывали фосфатным буфером (pH 7,2), а затем обрабатывали 0,02% ЭДТК. Полученное культивировали в течение 5 минут, и инфицированные клетки собирали и центрифугировали на 1000 об./мин в течение приблизительно 3 минут для сбора инфицированных клеток.

Стадия 2. Выделение вируса.

Инфицированные клетки, полученные как описано выше, добавляли к разрушающему раствору SPGE (pH 7,2, 7,5% (в./о.) сахарозы, 0,0038 М одноосновного фосфата калия, 0,0072 М двуохсновного фосфата калия, 0,0049 М глутамата натрия, 0,2% ЭДТК) до концентрации 5-10•10⁶ клеток/1 мл.

Клетки разрушали с помощью ультразвукового дезинтегратора (Sonifier, Branson 450), используя игольчатый наконечник для флакона Т80 или "рога" - для многопланшетной установки (CF-10) в ледяной бане, до тех пор, пока не оставалось больше интактных клеток. Полученное центрифугировали при 4^oC и 1000 об./мин в течение 10 мин для получения супернатанта, содержащего вирус.

Стадия 3. Активность вируса.

Клеточный штамм LBHEL культивировали на чашках Петри диаметром 60 мм для получения монослоя в соответствии с процедурой стадии 1 примера 2, и культивируемые клетки трижды отмывали фосфатным буфером (pH 7,2). Инфицированные клетки, собранные на этапе 1, добавляли к монослою культивируемых клеток в количестве 0,3 мл на чашку для определения активности инфицированных клеток. Далее, супернатант, содержавший вирус, который получили на стадии 2, последовательно разводили 4-кратным объемом модифицированной по способу Дульбекко среды Игла и добавляли к монослою культивированных клеток в количестве 0,1 мл на чашку для определения активности вируса, не содержавшего клеток. Вирусу позволяли адсорбироваться на клетках, поддерживая температуру культуры 37^oC в атмосфере, содержавшей 5% CO₂, в течение 60 минут. Затем туда добавляли модифицированную по способу Дульбекко среду Игла, содержавшую 3% СПК, и культивирование продолжали при указанных выше условиях.

Спустя 6 дней количество образовавшихся бляшек подсчитывали под микроскопом (40х) и определяли количество БОК и БОЕ для оценки активности инфицированных клеток и вируса, не содержавшего клеток, соответственно. Результаты представлены в таблице III.

Как показано в таблице III, активность VZV в LBHEL настоящего изобретения была выше, чем у других общеизвестных клеточных штаммов. В частности, количество БОК у других общеизвестных клеточных штаммов составляло приблизительно 50% от такового для клеток LBHEL, в то время как количество БОЕ у них достигало самое большее 30% от такового для клеток LBHEL.

Тест-пример 5: Влияние множественности инфицирования (МИ).

В соответствии с процедурой стадии 1 тест-примера 4 получали монослойную культуру клеток-хозяев LBHEL и инокулировали в нее клетки MRC-5, инфицированные вирусом Varicella Biken Oka, при МИ 1:10, 1:15, 1:20, 1:25 и 1:50 соответственно. Количество БОЕ определяли в соответствии с процедурами этапов 2 и 3 тест-примера 4.

Фиг. 4 представляет изменение в активности VZV, не содержащего клеток (БОЕ), на клеточном штамме LBHEL настоящего изобретения в зависимости от МИ. Как показано на фиг. 4, выход вируса, не содержащего клеток, был наиболее высоким при МИ 1:20.

Тест-пример 6: Влияние цитопатогенного эффекта на БОЕ.

В соответствии с процедурой стадии 1 тест-примера 4 получали монослойную культуру клеток LBHEL и инокулировали в нее клетки MRC-5, инфицированные вирусом Varic lla Biken Oka, при МИ 1:20. Инфицированные клетки собирали, когда цитопатогенный эффект достигал 12,5, 25, 37,5, 50, 62,5, 75 и 87,5%. Собранные клетки разрушали ультразвуком и определяли БОЕ в соответствии с процедурами стадий 2 и 3 тест-примера 4.

Фиг. 5 показывает активность VZV, не содержащего клеток (БОЕ), на клеточном штамме LBHEL настоящего изобретения в различных цитопатогенных эффектах. Выход вируса, не содержащего клеток, был высоким, если цитопатогенный эффект составлял менее 50%.

Тест-пример 7: Эффект стабилизации неинфицированных клеток.

Клетки LBHEL, инфицированные VZV, получали в соответствии с процедурой стадии 1 тест-примера 4, и к инфицированным клеткам LBHEL добавляли неинфицированные клетки LBHEL в количестве 0, 20, 40, 60 и 80%, от общего количества клеток LBHEL. Эту смесь обрабатывали ультразвуком и определяли количество БОЕ в соответствии с процедурами стадий 2 и 3 тест-примера 4.

Фиг. 6 показывает изменение активности VZV, не содержащего клеток (БОЕ), в зависимости от содержания неинфицированных клеток LBHEL. Как показано на фиг. 6, активность вируса, не содержащего клеток, возрастала в присутствии неинфицированных клеток и была самой высокой при содержании неинфицированных клеток от 20 до 60% от общего количества клеток LBHEL.

Далее, эффект смешивания с неинфицированными клетками оценивали с помощью многопланшетной установки (CF-10); результаты представлены в таблице IV.

Как показано в таблице IV, неинфицированные клетки можно эффективно использовать для стабилизации VZV, не содержащего клеток, при широкомасштабном производстве вируса.

Тест-пример 8: Эффект сахарозы.

Инфицированные клетки LBHEL получали и разрушали ультразвуком в соответствии со стадиями 1 и 2 тест-примера 4.

Полученное центрифугировали на 1000 об./мин в течение 10 минут в отсутствие или в присутствии раствора сахарозы (pH 7,2, 15-37,5% (в./о.) сахарозы, 0,0038 М одноосновного фосфата калия, 0,0072 М двухосновного фосфата калия, 0,0049 М глутамата натрия, 0,2% ЭДТК), как показано в таблице V, и собирали супернатант, содержавший вирус. Затем определяли количество БОЕ в соответствии с процедурой стадии 3 тест-примера 4. Результаты представлены в таблице V.

Как показано в таблице V, добавление раствора сахарозы в концентрации от 15 до 37,5% (в./о.) стабилизирует VZV.

Тест-пример 9: Эффект насыщения клетками поверхности сосуда для культивирования.

Клеточный штамм LBHEL настоящего изобретения культивировали на флаконе Т80 в соответствии со стадией 1 примера 2 для получения монослоя, покрывающего 50, 75 или 100% общей площади поверхности сосуда для культивирования. Штамм Varicella Biken Oka, инфицированный VZV, инокулировали в клетки и культивировали при 37^oС в атмосфере, содержавшей 5% CO₂, в течение 48 часов. Затем определяли количество БОЕ в соответствии с процедурами стадий 2 и 3 тест-примера 4.

Фиг. 7 показывает изменение активности VZV, не содержащего клеток (БОЕ), в зависимости от степени покрывания клетками поверхности сосуда для культивирования клеток; причем клеточный штамм LBHEL настоящего изобретения демонстрировал более высокую восприимчивость к VZV при 75% покрывания монослоем, чем при 100%-ном покрывании монослоем поверхности сосуда.

Приведенные выше результаты показывают, что клеточный штамм LBHEL настоящего изобретения пригоден для производства различных вирусных вакцин против ветряной оспы, кори, краснухи, эпидемического паротита, геморрагической лихорадки с почечным синдромом, японского энцефалита B, детского полиомиелита, гепатита A, гепатита B, гепатита C и натуральной оспы.

Поскольку варианты практического осуществления настоящего изобретения описаны и проиллюстрированы, понятно, что в них могут вноситься изменения и модификации без выхода за пределы существа настоящего изобретения, которое следует ограничивать только объемом прилагаемой формулы изобретения.

Изобретение относится к вирусологии и медицине и может быть использовано для получения вирусных вакцин. Штамм диплоидных клеток фибробластов легких эмбриона человека LBHEL получен из ткани легких 20-недельного эмбриона. Штамм депонирован под номером КСТС 0127 ВР. Штамм отличается быстрым ростом, высокой восприимчивостью к вирусам, особенно к вирусу Varicella zoster (VZV). Штамм хорошо растет по среде, содержащей сыворотку плода коровы в концентрации 5%. Изобретение позволяет уменьшить побочные эффекты вируссодержащих вакцин. 7 ил., 5 табл.

Штамм диплоидных клеток фибробластов легких эмбриона человека LBHEL (КСТС 0127 ВР), используемый для выращивания вируса.