СПОСОБ ОЧИСТКИ ИНСУЛИНА Российский патент 1996 года по МПК G01N30/02 

Изобретение относится к медицинской промышленности и может быть использовано для получения препаратов инсулина, применяемых в терапии сахарного диабета.

Известен способ очистки инсулина хроматографией на анионите дауэкс 1Х2 и QAE-сефадекса А-25 [1] Недостаток этого способа низкий выход очищенного инсулина (40-60% ), а также использование при хроматографии сложных водно-органических смесей, содержащих 60% горючих и ядовитых компонентов - метанола или этанола. Кроме того, анионообменной хроматографии в описываемом способе предшествует дополнительная стадия цитратная перекристаллизация.

В другом способе очистки инсулина [2] катионообменной хроматографией на слабокислом катионите (амберлит CG 50) предшествуют пять дополнительных стадий: цитратная кристаллизация, хроматография на сефадексе G-50, высаживание хлоридом натрия, изоэлектрическое осаждение и вторая цитратная кристаллизация, а выделение очищенного инсулина после катионообменной хроматографии включает три стадии высаживание хлоридом натрия, изоэлектрическое осаждение и цитратную кристаллизацию. Недостатком этого способа, помимо сложности и трудоемкости, является невысокий выход инсулина (53%), а также применение при катионообменной хроматографии сложного буфера, включающего 0,13М фосфат натрия, 7М мочевину и 1%-ный н-бутанол.

Известен способ очистки инсулина [3] (прототип) путем сорбции инсулинсодержащего сырья на микропористом сульфокатионите с величиной частиц 20-60 мкм, смешанном с инертным силикатным наполнителем (величина частиц 40-120 мкм) в равном объемном соотношении, с последующей промывкой смеси микродисперсии и наполнителя 0,20-0,30М уксусноаммонийным буфером при pН 5,2-6,4 и десорбцией инсулина 0,02-0,3М буферным раствором (трис; фосфатный буфер; ацетат аммония) при pН 6,4-7,6.

К недостаткам известного способа относятся: необходимость применения наполнителя при хроматографии; невысокий выход инсулина после очистки (64-70% ); высокая антигенность инсулина (содержание проинсулина 0,5%). В прототипе не указан вид очищаемого инсулина свиной или крупного рогатого скота (к. р. с.), хотя различные виды инсулина могут существенно отличаться как по выходу, так и по степени очистки в одних и тех же условиях. Кроме того, в прототипе не указаны ни методы анализа фракционного состава, ни сам фракционный состав как исходного, так и очищенного инсулина.

Процесс хроматографии в прототипе возможен из-за малого размера зерен катионита лишь в присутствии наполнителя. Наличие наполнителя исключает возможность регенерирования смолы в режиме псевдоожижения, поскольку смола и наполнитель будут расслаиваться. Таким образом, применение наполнителя в прототипе является вынужденной мерой, поскольку в его отсутствии хроматография будет протекать с очень малыми скоростями.

Технической задачей изобретения является исключение применения наполнителя при хроматографии, увеличение выхода инсулина и снижение его антигенности.

Поставленная задача решается тем, что при очистке инсулина, включающей сорбцию инсулинсодержащего сырья на сульфокатионите с предварительной обработкой сульфокатионита раствором соли уксусной кислоты и элюирование инсулина раствором соли уксусной кислоты с последующим цинковым осаждением и цитратной кристаллизацией, используют сульфокатионит с размером зерен 400-600 мкм, обработку сульфокатионита проводят 0,15-0,25М раствором ацетата аммония или ацетата натрия при pН 7,0-7,3, сорбцию проводят из 0,04-0,06М раствора ацетата аммония или ацетата натрия при pН 7,4-7,6, а элюирование проводят 0,10-0,25М раствором ацетата аммония или ацетата натрия при pН 6,9-7,1.

В описываемых условиях обеспечивается, по-видимому, дифференцирование взаимодействия отрицательно заряженных групп сильного катионита с противоположно заряженными группировками (преимущественно аммониевыми и гуанидиниевыми остатками аргинина) разделяемых веществ при различных значениях pН и концентрации уксуснокислых солей натрия или аммония.

При применении ацетата натрия или ацетата аммония в описываемых условиях выход очищенного свиного инсулина составляет соответственно 90% и 79% Указанные выходы значительно превышают выход инсулина при очистке известными способами (50-70%).

Фракционный состав очищаемого инсулина свиньи и к.р.с. оценивался наряду с диск-электрофорезом методами высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и радиоиммунным (РИА). Полученные данные (в) представлены в таблице 1.

Как следует из таблицы 1, предлагаемый способ очистки инсулина позволяет увеличить содержание монофракции в случае свиного инсулина от 88,7% до >96% и в случае инсулина к.р.с. от 84,3% до 95-96% при этом содержание основной антигенной примеси проинсулина в инсулине свиньи снижается с 4,5% до 0,04-0,05% т.е. уменьшается приблизительно в 100 раз, а в инсулине к.р.с. количество проинсулина уменьшается приблизительно в 50 раз с 4,9 до 0,1% Одновременно в очищаемом инсулине существенно понижается содержание дезамидоинсулина и прочих примесей.

Способ поясняется следующими примерами.

Пример 1. 3,9 г Натриевой соли свиного инсулина, фракционный состав которой представлен в табл.1, растворяют в дистиллированной воде при подкислении до pН 2,6-3,018%-ным раствором соляной кислоты, и раствор разбавляют до значения оптической плотности Д²⁷⁷ 6,5-7,0 о.е. (оптические единицы). В раствор добавляют ацетат натрия из расчета 0,5М, 5%-ным раствором гидроксида натрия (12,5%-ным раствором гидроксида аммония для примеров 2 и 4) устанавливают pН 7,50±0,05.

На колонку с сульфокатионитом КУ-23И (размер зерен 400-600 мкм), уравновешенным 0,2М раствором ацетата натрия с pН 7,2, подают приготовленный раствор натриевой соли свиного инсулина со скоростью 0,5 V_кол/ч (V_кол объем колонки), после чего с той же скоростью подают 0,2М раствор ацетата натрия с нейтральным значением pН. Сбор инсулинсодержащих фракций начинают при регистрации в элюате оптической плотности Д²⁷⁷ 0,3-0,5 о.е. и заканчивают (после прохождения максимума на кривой элюации) при значениях Д²⁷⁷ 0,5-0,6 о.е.

Фракции, содержащие по данным диск-электрофореза в полиакриламидном геле очищенный инсулин, объединяют, разбавляют водой до Д²⁷⁷ 3,0-3,5 о.е. и 18% -ным раствором соляной кислоты устанавливают pН 3,0-3,5. Затем добавляют 10% -ный раствор ацетата цинка и осаждают цинк-инсулин при pН 6,0-6,1. Осадок цинк-инсулина отфильтровывают и кристаллизуют из цитратного буфера известным способом.

Получают 3,5 г кристаллического свиного цинк-инсулина (выход 89,7%), фракционный состав которого представлен в табл.1.

Пример 2. Очистку 3,6 г натриевой соли свиного инсулина с применением ацетата аммония проводят в условиях, аналогичных условиям примера 1, но для уравновешивания колонки, растворения инсулина и последующего элюирования вместо ацетата натрия используют ацетат аммония.

После очистки получают 2,85 г кристаллического цинк-инсулина (выход 79,2%), фракционный состав которого представлен в табл. 1.

Пример 3. Для очистки берут 40,0 г натриевой соли инсулина крупного рогатого скота (к. р. с. ). Условия очистки аналогичны условиям, описанным в примере 1 (с применением ацетата натрия).

После очистки получают 33,7 г кристаллического цинк-инсулина к.р.с. (выход 84,25%), фракционный состав которого представлен в табл. 1.

Пример 4. Для очистки берут 3,85 г натриевой соли инсулина к.р.с. Условия очистки аналогичны условиям, описанным в примере 2 (с применением ацетата аммония).

После очистки получают 2,81 г кристаллического цинк-инсулина к.р.с. (выход 73%), фракционный состав которого представлен в табл. 1. ТТТ1

Использование: в медицинской промышленности для получения препаратов инсулина. Сущность изобретения: способ очистки инсулина включает сорбцию инсулинсодержащего сырья на сульфокатионите с предварительной обработкой сульфокатионита раствором соли уксусной кислоты с последующим цинковым осаждением и цитратной кристаллизацией. Используют сульфокатионит с размером зерен 400-600 мкм. Обработку сульфокатионита проводят 0,15-0,25М раствором ацетата аммония или ацетата натрия при pН 70-7,3. Сорбцию проводят из 0,04-0,06М раствора ацетата аммония или ацетата натрия при pН 7,4-7,6. Элюирование проводят 0,10-0,25М раствором ацетата аммония или ацетата натрия при pН 6,9-7,1. 1 табл.

Способ очистки инсулина, включающий сорбцию инсулинсодержащего сырья на сульфокатионите с предварительной обработкой сульфокатионита раствором соли уксусной кислоты и элюирование инсулина раствором соли уксусной кислоты с последующим цинковым осаждением и цитратной кристаллизацией, отличающийся тем, что используют сульфокатионит с размером зерен 400-600 мкм, обработку сульфокатионита проводят 0,15-0,25 М раствором ацетата аммония или ацетата натрия при рН 7,0-7,3, сорбцию проводят из 0,04-0,06 М раствора ацетата аммония или ацетата натрия при рН 7,4-7,6, а элюирование проводят 0,10-0,25 М раствором ацетата аммония или ацетата натрия при рН 6,3-7,1.