СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА Российский патент 1995 года по МПК C07K14/62 C12P21/00 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к усовершенствованному способу получения проинсулина человека из гибридного белка, продуцируемого рекомбинантными микроорганизмами, несущими ген этого белка.

Инсулин гормон поджелудочной железы, регулирующий процессы углеводного обмена и поддержания нормального уровня сахара в крови. Инсулин представляет собой глобулярный белок, содержащий 51 аминокислотный остаток и состоящий из двух полипептидных цепей А и В, связанных между собой двумя дисульфидными связями между цистеиновыми остатками А-7 и В-7, А-20 и В-19. В А-цепи имеется внутренняя дисульфидная связь между остатками цистеинов в положениях А-6 и А-11.

Инсулин в клетке синтезируется в виде одноцепочечного предшественника препроинсулина, который после удаления N-концевого сигнального пептида генерируется в проинсулин, который, в свою очередь, после протеолитического отщепления С-пептида, соединяющего конец В-цепи с началом А-цепи, превращается в инсулин.

Ввиду того, что инсулин животного происхождения не может удовлетворить потребности в этом гормоне для медицины и может вызывать аллергические реакции вследствие видовой специфичности, возникла необходимость в синтетическом инсулине. Полный химический синтез инсулина человека был осуществлен в ряде лабораторий. При этом наиболее трудоемкой частью этого синтеза оказалось замыкание дисульфидных связей в требуемых местах молекулы. Как выяснилось, эти связи эффективнее замыкать предварительно в проинсулинподобном предшественнике инсулина, где посредством соединительного пептида достигается необходимая ориентация А- и В-цепей при замыкании.

Разработана технология биосинтеза гибридного белка, включающего аминокислотную последовательность проинсулина человека. Выделенный из клеток рекомбинантных микроорганизмов гибридный белок может быть подвергнут расщеплению для получения линейной цепи проинсулина [1]
Описан способ получения проинсулина человека [2] состоящий из четырех основных стадий: окисления посредством сульфитолиза биосинтетически полученного и предварительно очищенного методом ВЭЖХ полипептида, имеющего аминокислотную последовательность проинсулина человека, с образованием проинсулина-S-сульфоната, очистки последнего ионообменной хроматографией на ДЕАЕ-целлюлозе, денатурировании полученного проинсулин-S-сульфоната и очистки целевого продукта гель-хроматографией на Сефадексе G-50.

Сульфитолиз получение проинсулин-S-сульфоната с линейными цепями проводят следующим образом: в охлажденный раствор 7 М мочевины добавляют сульфит натрия до концентрации 7,9 мг/мл, тетратионат натрия 6 мг/мл и очищенный полипептид 5 мл/мл, (соотношение полипептид сульфит натрия в реакционном растворе составляет 1:1,6), доводят рН раствора до 7,6 2N раствором гидроокиси натрия. Реакцию проводят в течение 18 ч при 6^оС и постоянном перемешивании, по окончании реакции рН раствора доводят до 9,1. Полученный проинсулин-S-сульфонат обессоливают на колонке с Сефадексом G-25 и высушивают лиофильно.

Для проведения ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе образец растворяют в 0,01 М трис-HCL буфере рН 8,5, содержащем 7,5 М мочевину и 0,001 М ЭДТА, до концентрации 44,3 мг/мл и наносят на колонку. Элюирование проинсулин-S-сульфоната осуществляют в градиенте концентрации от 0 до 0,35 М хлористого натрия в указанном буфере, обессоливают на колонке с Сефадексом G-25 и лиофилизируют.

Согласно данным, приведенным в способе-прототипе, где источником для получения проинсулин-сульфоната могут быть как природные инсулины и проинсулины, так и полученные классическим пептидным синтезом, либо методом рекомбинантных технологий, выход на стадии сульфитолиза с последующей ионообменной хроматографией и обессоливанием составляет 74%
Ренатурирование проинсулин-S-сульфоната осуществляют 2-меркаптоэтанолом, для этого в раствор, содержащий до 10 мг/мл полипептида в 0,05 М глициновом буфере рН 10,5, добавляют водный раствор 2-меркаптоэтанола, содержащий 2,1 мг/мл, из расчета (1-5) экв 2-меркаптоэтанола на каждую SSO₃^--группу, затем реакцию проводят в течение 18 ч при 6^оС и перемешивании, по окончании процесса раствор подкисляют до рН 2,9 0,1. Образовавшийся проинсулин обессоливают на колонке с Сефадексом G-25 (грубый) в 2%-ной уксусной кислоте и высушивают лиофильно.

Полученный препарат подвергают гель-хроматографии на колонке с Сефадексом G=50 (сверхтонкий) в 1 М уксусной кислоте, при этом получают две основные фракции, первая содержит агрегированную форму проинсулина, вторая мономерную. Выход белка от нанесенного на колонку составляет 94% из них 67,3% приходится на мономерную форму. Наличие проинсулина в полученной мономерной фракции подтверждается анализом аминокислотной последовательности, диск-электрофорезом в полиакриламидном геле, методом ВЭЖХ, а также при дальнейшей обработке препарата трипсином и карбоксипептидазой В с получением инсулина человека.

С учетом выхода на стадии сульфитолиза суммарный выход проинсулина составляет 47%
Недостатками способа-прототипа является сложность схемы выделения проинсулина, которая включает 5 дорогостоящих и трудоемких хроматографических процессов, что затрудняет постановку на ее основе промышленного производства этого препарата, а также невысокий выход основного вещества, составляющий 47% от количества проинсулин-S-сульфоната в исходном материале, выход основного вещества получен на основе исходного высокоочищенного методом ВЭЖХ препарата проинсулина, что делает процесс его получения еще более дорогостоящим.

Целью предполагаемого изобретения является увеличение выхода целевого продукта и упрощение процесса. Цель достигается описываемым способом получения проинсулина человека, который заключается в том, что гидролизат гибридного белка, полученного биосинтетическим способом, содержащий полипептид с аминокислотной последовательностью проинсулина человека, подвергают сульфитолизу сульфитом и тетратионатом натрия, образовавшийся проинсулин-S-сульфонат очищают ионообменной хроматографией и ренатурируют меркаптаном; способ отличается от известного тем, что сульфитолиз проводят при массовом соотношении полипептид сульфит натрия 1:(2,8-3,2), после ионообменной хроматографии проводят осаждение полученного проинсулин-S-сульфоната, ренатурирование осуществляют путем добавления к реакционному раствору, содержащему полипептид, цистин и меркаптан при их массовом соотношении 1:(0,1-0,2):(0,07-0,15), водного раствора меркаптана со скоростью (0,1-0,18) экв в час на каждую SSO₃^--группу, а после ренатурирования целевой продукт подвергают ультрафильтрации.

Использование указанной совокупности отличительных признаков позволяет значительно повысить выход проинсулина человека (до 75%) и упростить технологию его получения.

Данная совокупность отличительных признаков в известных технических решениях не описана.

Упрощение технологии получения проинсулина достигается за счет того, что в предлагаемом техническом решении в ограниченном количестве используются дорогостоящие хроматографические процессы выделения и очистки, широко применяются такие технологические методы, как осаждение белков и ультрафильтрация белковых растворов. В отличие от способа-прототипа, в схеме выделения которого имеется 5 хроматографических процессов, в предлагаемом способе только один. Для реализации способа пригодны как импортные, так и отечественные сорбенты и ультрафильтрационные мембраны.

Повышение выхода целевого продукта достигается соответствующей комбинацией методов выделения, оптимизацией условий проведения реакции сульфитолиза, так как наличие в растворе недосульфированного проинсулина может привести к значительным потерям продукта, а также оптимизацией условий проведения стадии ренатурирования проинсулин-S-сульфоната до проинсулина.

Проведение сульфитолиза при массовом соотношении полипептид сульфит натрия 1:(2,8-3,2) является оптимальным, так как при использовании сульфит натрия в количестве меньшем, чем 2,8 мас.ч. на 1 ч. полипептида, реакция не проходит полностью, а при большем, чем 3,2 наблюдается полимеризация проинсулин-S-сульфоната.

Непосредственно после сульфитолиза проводят основную очистку проинсулин-S-сульфоната методом ионообменной хроматографии. Для этих целей может быть использован любой сорбент, пригодный для ионообменной хроматографии белков, например, ДЕАЕ-Сефароза FF. Элюирование осуществляют в градиенте концентрации хлористого натрия. Однако предпочтительным вариантом осуществления способа является использование на этом этапе сорбента ДЕАП-Сферанит-ОН, так как в этом случае применяют не градиентное, а ступенчатое элюирование проинсулин-S-сульфоната. Такой прием значительно технологичнее, так как не требует аппаратурного исполнения формирующего градиент из двух буферов. Кроме того, в этом случае используют широкую невысокую колонку, что увеличивает скорость протекания элюента и сокращает время проведения процесса.

Перевод проинсулин-S-сульфоната в буфер для ренатурирования осуществляют его осаждением при разбавлении раствора водой в 4 раза, с последующим растворением осадка в глициновом буфере. Стадия осаждения представляет собой дополнительную очистку проинсулин-S-сульфоната, так как в условиях, когда этот полипептид выпадает в осадок, применены компоненты, в том числе и непросульфировавшийся проинсулин, не образуют осадка и отделяются вместе с раствором.

Затем осуществляют реакцию ренатурирования образование дисульфидных связей в молекуле проинсулина. Для этого в реакционный раствор, содержащий проинсулин-S-сульфонат, добавляют окислитель (цистин) и восстановитель меркаптан (цистеин либо 2-меркаптоэтанол) в количестве, обеспечивающем массовое соотношение полипептид цистеин меркаптан 1:(0,1-0,2):(0,07-0,15). Такое соотношение компонентов в реакционной среде обуславливает создание оптимального значения окислительно-восстановительного потенциала, около 0 мВ, в начальный момент реакции ренатурирования. Далее в течение 18 ч проводят титрование реакционного раствора водным раствором меркаптана (цистеина либо 2-меркаптоэтанола) из расчета (0,1-0,18) экв на каждую SSO₃^--группу в час. При этом окислительно-восстановительный потенциал реакционного раствора поддерживается на уровне оптимальном для проведения ренатурирования, что обеспечивает высокий выход основного вещества на этой стадии.

Непосредственно после ренатурирования проводят концентрирование раствора, содержащего проинсулин, на ультрафильтрационных мембранах, полученный сконцентрированный раствор используют для ферментативной обработки с целью выщепления С-пептида и получения инсулина.

Способ по предполагаемому изобретению позволяет увеличить суммарный выход желаемого продукта до 75% причем 97% из них приходится на мономерную форму проинсулина, в отличие от способа-прототипа, в котором используется высокоочищенный с помощью ВЭЖХ исходный препарат, где этот выход составляет 47% из них только 67,3% приходится на мономерную форму проинсулина.

Предлагаемый способ может быть использован для всех видов проинсулин-подобных предшественников инсулина.

Способ в соответствии с предполагаемым изобретением осуществляют следующим образом.

В качестве исходного материала для получения проинсулина используют гидролизат, полученный после ферментативного расщепления 300 г препарата гибридного белка, содержащего по данным электрофореза в полиакриламидном геле, 100 г полипептида с аминокислотной последовательностью проинсулина человека. Исходную смесь суспендируют в 6 л 2 М раствора NaCl, рН суспензии доводят до 4,5 25% -ным NH₄OH, осадок отделяют от раствора центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 мин и используют для наработки целевого продукта.

После промывки осадок растворяют в 50 мМ ацетатно-аммонийном буфере, содержащем 7 М мочевину до концентрации полипептида (150-200) мкг/мл, добавляют соответственно (280-320) г сульфита натрия, (120-240) г тетратионата натрия и подщелачивают раствор до рН 9,0. Реакцию проводят в течение 12 ч при перемешивании и комнатной температуре.

Полученный раствор разбавляют в 4 раза дистиллированной водой и наносят на колонку с сорбентом для ионообменной хроматографии. В качестве сорбента используют ДЕАП-Сферанит-ОН либо ДЕАЕ-Сефарозу FF. Проинсулин-S-сульфонат элюируют с колонкой, элюат разбавляют дистиллированной водой в 4 раза. Сформировавшийся после этого осадок отделяют, растворяют и используют для проведения стадии ренатурирования.

Ренатурирование проводят в реакторе с рубашкой охлаждения. Готовят 10 мМ глициновый буфер рН 10,0, в него добавляют цистин в концентрации (15-40) мг/мл, меркаптан (2-меркаптоэтанол либо цистеина (10,5-30,0) мкг/мл, а после растворения вводят раствор, содержащий проинсулин-S-сульфонат до конечной концентрации полипептида в реакционном растворе (150- 200) мкг/мл соответственно. Далее в реактор при постоянном перемешивании добавляют водный раствор меркаптана (2-меркаптоэтанола либо цистеина) со скоростью 300 мл/ч из расчета (0,1-0,18) экв на каждую SSO₃^--группу в 1 ч. Реакцию проводят в течение 18 ч при 4± 2^оС.

Полученный раствор концентрируют на ультрафильтрационных мембранах, не пропускающих проинсулин, подвергают диафильтрации и высушивают лиофильно. Согласно предполагаемому изобретению используют мембраны Биопор Т10 ВНИИОЧБ либо РТGC фирмы Миллипор.

Для лучшего понимания сущности предлагаемого технического решения ниже приводятся примеры его конкретного осуществления.

П р и м е р 1. 300 г осадка гидролизата гибридного белка, содержащего полипептид с аминокислотной последовательностью проинсулина человека, растворяют в 12 л раствора 7,5 М мочевины в 50 мМ ацетате аммония. В раствор добавляют 280 г сульфита натрия (массовое соотношение полипептид сульфит натрия составляет (1:2,8), 120 г тетратионата натрия и доводят рН раствора до 9,0 добавлением 1 М гидроокиси натрия. Реакция сульфитолиза образование линейных цепей проинсулин-S-сульфоната протекает в течение 12 ч при комнатной температуре и перемешивании. Контроль за проведением реакции осуществляют при помощи ионообменной хроматографии на колонке Protein РАК ДЕАЕ 5 PW. Выход составляет 90%
Полученный раствор, содержащий проинсулин-S-сульфонат, разбавляют дистиллированной водой в 4 раза и наносят на колонку (31х12) см, заполненную сорбентом ДЕАП-Сферанит-ОН и предварительно уравновешенную 50 мМ ацетатно-аммонийным буфером рН 6,0, со скоростью 40 л/ч. После нанесения и отмывки несорбируемых примесей уравновешивающим раствором колонку промывают 25 л 1 М уксусной кислоты с целью удаления примесных компонентов. После этого проинсулин-S-сульфонат элюируют 20 л 1 М уксусной кислоты, содержащей 1 М хлористый натрий и 7,5 М мочевину. Содержание проинсулин-S-сульфоната в элюате составляет 85 г. Колонку после уравновешивания стартовым буфером используют для следующего цикла выделения.

20 л полученного элюата разбавляют дистиллированной водой в 4 раза. Осадок формируется и оседает на дно емкости в течение 1 ч, после чего надосадочную жидкость сливают оставляя осадок в 10 л. Осадок, содержащий проинсулин-S-сульфонат, в 10 л надосадочной жидкости растворяют при доведении рН до 10,0 25%-ным раствором гидроокиси аммония при перемешивании.

В реакторе объемом 610 л, оснащенной рубашкой охлаждения и мешалкой, готовят 556 л 10 мМ глицинового буфера рН 10,0, охлаждают буфер до 4± 2^оС и добавляют в реактор 8,5 г цистина и 5,3 мл 2-меркаптоэтанола, а после растворения цистина в реактор вводят раствор проинсулин-S-сульфоната. При этом концентрация цистина в реакторе составляет 15 мкг/мл, 2-меркаптоэтанола 10,5 мкг/мл, а полипептида 150 мкг/кл. После этого в реакционный раствор при постоянном перемешивании добавляют 6 л водного раствора 2-меркаптоэтанола с концентрацией 2,47 мг/мл со скоростью 300 мл/час, что соответствует 0,175 экв на каждую SSO₃^--группу в 1 ч. Через 18 ч реакцию заканчивают.

Раствор концентрируют на ультрафильтрационных мембранах Биопор Т 10 разработки ВНИИОЧБ. Концентрат, содержащий целевой продукт, объемом 5 л подвергают диафильтрации 50 л 30 мМ ацетата аммония и высушивают лиофильно.

По данным эксклюзионной ВЭЖХ содержание проинсулина в мономерной форме в полученном препарате составляет 74,8 г, что соответствует выходу 74,8% от количества полипептида с аминокислотной последовательностью проинсулина человека в исходном материале.

П р и м е р 2. В качестве источника для получения проинсулина человека используют такой же гидролизат как в примере 1.

Сульфитолиз проводят как описано в примере 1, но к 12 л раствора гидролизата гибридного белка добавляют 320 г сульфита натрия и 240 г тетратионата натрия. При этом массовое соотношение полипептид сульфит натрия составляет (1:3,2).

После сульфитолиза полученный раствор разбавляют в 4 раза дистиллированной водой и наносят со скоростью 40 л/ч на колонку (31х12) см, заполненную сорбентом ДЕАЕ Сефарозой FF, предварительно уравновешенную 30 мМ трис- HCl буфером рН 7,5. Отмывают несорбированные примеси уравновешивающим буфером и элюируют проинсулин-S-сульфонат в градиенте концентрации от 0 до 1,0 М хлористого натрия в 30 мМ трис-HCl буфере рН 7,5. Содержание проинсулин-S-сульфоната в элюате составляет 82 г, выход 82%
Стадию осаждения проводят также как в примере 1, получают осадок в 10 л надосадочной жидкости.

Стадию ренатурирования осуществляют аналогично примеру 1, но в реакторе готовят 400 л 10 мМ глицинового буфера, к которому затем добавляют 16,4 г цистина, 12,3 г цистеина, а после растворения раствор, содержащий проинсулин-S-сульфонат. При этом концентрация компонентов составляет соответственно 40 мкг/мл, 30 мкг/мл и 200 мкг/мл для полипептида. После этого в реакционный раствор при постоянном перемешивании добавляют 6 л водного раствора цистеина с концентрацией 2,1 мг/мл со скоростью 300 мл/час, что соответствует 0,1 экв на каждую SSO₃^--группу в 1 ч.

По окончании процесса раствор концентрируют на ультрафильтрационных мембранах РТGC фирмы Миллипор. Концентрат объемом 5 л подвергают диафильтрации как в примере 1 и высушивают лиофильно.

По данным эксклюзионной ВЭЖХ содержание проинсулина в мономерной форме в полученном препарате составляет 73,7 г, что соответствует выходу 73,7% от количества полипептида с аминокислотной последовательностью проинсулина в исходном материале.

Таким образом, разработан новый способ получения проинсулина человека, который позволяет повысить выход целевого продукта в среднем до 74% и упростить технологию получения проинсулина за счет ограниченного использования хроматографических процессов и использования таких технологичных методов выделения, как осаждение белков и ультрафильтрация белковых растворов.

Область использования: биотехнология. Сущность изобретения: предлагается усовершенствованный способ получения проинсулина человека из гибридного белка, продуцируемого рекомбинантными микроорганизмами, несущими ген этого белка. Способ заключается в том, что гидролизат гибридного белка, содержащий полипептид с аминокислотной последовательностью проинсулина человека, подвергают сульфитолизу образованию линейных цепей проинсулина сульфитом натрия и тетратионатом натрия при массовом соотношении полипептид: сульфит натрия 1 (2,8 3,2), образовавшийся проинсулин-S-сульфонат очищают ионообменной хроматографией, осаждают при четырехкратном разведении реакционного раствора дистиллированной водой с целью дополнительного отделения примесных компонентов и ренатурируют проинсулин-S-сульфонат до целевого продукта путем добавления к реакционному раствору, содержащему целевой продукт, при массовом соотношении полипептид: цистин: меркаптан 1 (0,1 0,2) (0,07 0,15) водного раствора меркаптана со скоростью (0,1 0,18) экв ч на каждую SSO-3

группу, а после ренатурирования целевой протукт подвергают ультрафильтрации и высушивают лиофильно. Способ позволяет увеличить выход желаемого продукта до 74% причем 97% из них приходится на мономерную форму проинсулина, а также значительно упростить технологию его получения за счет использования технологических методов выделения и очистки, таких как осаждение, ультрафильтрация, микрофильтрация. 1 з. п. ф-лы.

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА, включающий сульфитолиз полипептида с аминокислотной последовательностью проинсулина человека тетратионатом и сульфитом натрия, очистку полученного проинсулин-S-сульфоната ионообменной хроматографией и ренатурирование последнего до целевого продукта меркаптаном, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода и упрощения процесса, сульфитолиз осуществляют при массовом соотношении полипептид сульфит натрия 1 2,8 3,2, после ионообменной хроматографии проводят осаждение полученного проинсулин-S-сульфоната, ренатурирование осуществляют путем добавления к реакционному раствору, содержащему полипептид, цистин и меркаптан при их массовом соотношении 1 0,1 0,2 0,07 0,15, водного раствора меркаптана со скоростью (0,1 0,18) экв/ч на каждую SSO-3

-группу до окончания процесса, а после ренатурирования целевой продукт подвергают ультрафильтрации. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве сорбента для ионообменной хроматографии используют ДЕАП-сферанит-ОН.