СПОСОБ ОЧИСТКИ СВИНОГО ИНСУЛИНА И ИНСУЛИНА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА Российский патент 1996 года по МПК A61K38/28 C07K14/62 

Изобретение относится к технологии очистки полипептидов, а точнее к способу очистки свиного инсулина и инсулина крупного рогатого скота, широко используемого в медицинской практике для лечения сахарного диабета.

Применение в медицинской практике инсулинов низкой степени очистки приводит к ряду осложнений, таких как инсулинорезистентность и синдром хронической передозировки инсулина, развитие диабетических осложнений: ретинопатии, нефропатии и других, различного рода аллергий к инсулину, липодистрофии, и в конечном итоге, к высокой смертности больных диабетом.

Согласно ВФС 42-2150-92 и международным фармакопейным требованиям препарат инсулина должен содержать не менее 97% целевого вещества при содержании проинсулина не более 10 п.п.м. [нг/мг] Этим показателям соответствуют инсулины, получаемые с помощью хроматографии высокого давления (ВЭЖХ) в лабораторных условиях. До сих пор однако не разработана технология препаративного выделения высокоочищенного инсулина, которая могла бы быть широко использована на предприятиях фармацевтической промышленности. Наиболее доступной для промышленного освоения с точки зрения аппаратурного оформления и количественных выходов высокоочищенного инсулина является технология, основанная на препаративной колоночной хроматографии низкого давления.

Известен способ очистки свиного инсулина и инсулина крупного рогатого скота при помощи колоночной хроматографии низкого давления. Указанный способ включает пропускание через колонку Wofatit 5%-ного раствора инсулина в 1 н. СН₃СООН при соотношении раствора и смолы 5:1 (рН 4,5). Адсорбированный продукт элюируют смесью вода: ацетон (6:4 по объему) при соотношении элюента и смолы 25:1. Затем элюат упаривают в вакууме до концентрации 2-3 г/л, добавляют 20%-ный водный раствор этанола (1:6 по объему), гомогенизируют и выдерживают в течение 24 ч при t 0-5^оС. Образовавшийся кристаллический продукт отфильтровывают, промывают ацетоном и высушивают. Выход из 100 г инсулина-сырца 67 г инсулина со степенью чистоты 94% Указанный способ очистки инсулина с помощью колоночной хроматографии низкого давления характеризуется низким выходом целевого продукта и низкой степенью очистки, не превышающей 94% и несмотря на некоторые технологические преимущества (традиционное аппаратурное оформление, дешевизна процесса) по сравнению, например, с методом хроматографии высокого давления, не может быть использован для получения препаратов инсулина, удовлетворяющих современным фармакопейным требованиям.

В основу изобретения положена задача разработки путем изменения технологических операций способа очистки свиного инсулина и инсулина крупного рогатого скота, позволяющего повысить степень очистки инсулина до степени очистки, соответствующей фармакопейным требованиям, и увеличить его выход.

Задача решена тем, что в заявленном способе очистки свиного инсулина и инсулина крупного рогатого скота путем колоночной препаративной хроматографии низкого давления, включающей пропускание водного раствора инсулина-сырца через ионит с последующей элюцией инсулина и осаждения его из элюата, согласно изобретению, в качестве ионита используют продукт сополимеризации метакриловой, акриловой кислот и диметакрилата этиленгликоля, имеющий степень набухания К_наб. 4,5-4,8, полную обменную емкость 9,2-9,8 мг·экв/г, и процесс осуществляют путем пропускания водного раствора инсулина-сырца рН 3,0-3,5 через указанный ионит, предварительно уравновешенный 10-16%-ным водным раствором изопропанола рН 3,0-3,5, затем ионит промывают 10-16%-ным водным раствором изопропилового спирта (рН 3,0-3,5) и проводят элюцию инсулина 20-25% -ным водным раствором изопропилового спирта рН 3,4-3,9, содержащим 0,05-0,15 М ацетата аммония, из полученного элюата целевой продукт выделяют осаждением.

Заявленный способ позволяет повысить степень очистки инсулина до 98,7% с содержанием проинсулина 0,5-4,1 п. п.м. в сравнении с известным способом, который обеспечивает степень очистки до 94% Кроме того, заявляемый способ позволяет увеличить выход целевого продукта до 86,1 мас. (выход целевого продукта по известному способу 67 мас.).

Существенным дополнительным преимуществом заявляемого способа по сравнению с известным является значительное уменьшение количества требуемого биосорбента. Для получения 1 кг свиного инсулина и инсулина крупного рогатого скота необходимо использовать 2,2 кг ионита в заявляемом способе и 10-11,5 кг ионита Wofatit в известном способе. При этом сорбент в заявляемом способе выдерживает сотни циклов регенерации и актов сорбции-десорбции, сохраняя без изменения емкость сорбции и ее 100% обратимость.

Способ осуществляют следующим образом. Водный раствор исходного инсулина-сырца, подкисленный 0,1 н. НСl рН 3,0-3,5, пропускают через ионит-продукт радикальной сополимеризации метакриловой, акриловой кислот и диметакрилата этиленгликоля, уравновешенный 10-16%-ным водным раствором изопропилового спирта рН 3,0-3,5 при соотношении раствора и смолы 1:1. Ионит промывают 10-16%-ным водным раствором изопропилового спирта (рН 3,0-3,5), в количестве 2-3 объемов сорбционной колонки и элюируют инсулин 20-25%-ным водным раствором изопропилового спирта (рН 3,4-3,9), содержащим 0,05-0,15 М ацетата аммония. К элюату добавляют абсолютный этиловый спирт и выкристаллизовывают целевой продукт. Анализ заявляемых условий проведения процесса очистки инсулина показал следующее:
снижение рН раствора инсулина перед сорбцией до 2,0-2,8 приводит к уменьшению равновесной емкости сорбции. Повышение рН до 4,0-4,5 приводит к необратимой сорбции инсулина, а при рН > 4,7 происходит агрегация и выпадение в осадок инсулина;
увеличение концентрации водного раствора изопропилового спирта (> 16%) приводит к снижению чистоты целевого продукта. Уменьшение концентрации (<10% ) водного раствора изопропилового спирта также приводит к снижению чистоты целевого продукта и ухудшению его выхода;
Уменьшение концентрации изопропилового спирта на стадии элюции (<20%) приводит к увеличению объема элюата, что затрудняет проведение кристаллизации. Увеличение данной концентрации (>25%) приводит к снижению чистоты целевого продукта;
уменьшение или увеличение концентрации ацетата аммония на стадии элюции приводит к ассоциатообразованию и необратимости сорбции;
уменьшение или увеличение рН при элюции приводит к снижению чистоты целевого продукта.

Чистоту выделенного свиного инсулина и инсулина крупного рогатого скота определяют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), содержание проинсулина в препаратах инсулина методом радиоммунологического анализа (РИА).

Выход целевого продукта составляет 80,0-86,1 мас. при степени чистоты 98,0-98,7% с содержанием проинсулина 0,5-4,1 п.п.м.

П р и м е р 1. 150 мг свиного инсулина (88,4% по данным ВЭЖХ, содержание проинсулина 25400 п.п.м. по данным радиоиммунологического анализа) растворяют в 10 мл воды, подкисленной 0,1 н.НСl до рН 3,1. Полученный раствор пропускают через колонку с ионитом, представляющим собой продукт радикальной сополимеризации метакриловой, акриловой кислот и диметакрилата этиленгликоля (степень набухания К_наб. 4,5; полная обменная емкость 9,6 мг·экв/г). Предварительно ионит измельчают на гранулы 100-150 мкм, промывают водой, этанолом, водой, 0,5 н. раствором NaOH, водой, 1,0 н, раствором HCl, водой. После сушки до постоянной массы ионит уравновешивают 15%-ным водным раствором изопропанола, подкисленным 0,1 н. НСl до рН 3,1 и помещают в колонку размером d 1,5 см, Н 4,5 см, V 10 мл.

Сорбцию инсулина ведут со скоростью 5 мл/см² ·ч. В этих условиях проскока вещества нет. Сорбент в колонке промывают 20 мл 15%-ного водного раствора изопропанола (рН 3,1) и десорбируют инсулин 20%-ным водным раствором изопропанола (рН 3,5), содержащим 0,1 М ацетата аммония. К элюату (4,5 мл) добавляют 26 мл абсолютного этилового спирта. Выпавший продукт отфильтровывают, промывают ацетоном и сушат при 35^оС.

Получают 121,5 мг инсулина (выход 86,7 мас.) со степенью чистоты 98,4% (по данным ВЭЖХ) и с содержанием проинсулина 4,1 п.п.м. (по данным РИА).

П р и м е р 2. 740 мг инсулина крупного рогатого скота с 81,2% чистоты (по данным ВЭЖХ) и с содержанием проинсулина 43200 п.п.м. (по данным РИА) растворяют в 32 мл воды, подкисленной 0,1 н.НСl до рН 3,5. Полученный раствор пропускают через колонку (D 2,5 см, Н 10 см, V 35 мм) с ионитом аналогичным примеру 1, уравновешенным 18%-ным водным раствором изопропилового спирта (рН 3,5). Сорбцию ведут при скорости пропускания 10 мл/см² ·ч. В этих условиях проскока вещества нет. Сорбент в колонке промывают 70 мл 16% -ного водного изопропилового спирта, и десорбируют инсулин 22%-ным водным изопропанолом (рН3,7), содержащим 0,15 М ацетата аммония. К элюату (V 22 мл) добавляют 110 мл абсолютного этилового спирта и получают 629,1 мг инсулина крупного рогатого скота (выход 85,1 мас.) со степенью чистоты 98,1% (по данным ВЭЖХ) и с содержанием проинсулина 2,8 п.п.м. (по данным РИА).

П р и м е р 3. 2,1 г свиного инсулина с 81,8% чистоты (по данным ВЭЖХ) и содержанием проинсулина 32400 п. п.м. (по данным РИА) растворяют в 130 мл воды, подкисленной до рН 3,3. Полученный раствор пропускают через колонку (D 28 см, Н 12 см, V 140 мм), с ионитом-продуктом радикальной сополимеризации метакриловой, акриловой кислот и диметакрилата этиленгликоля (степень набухания К_наб. 4,8; полная обменная емкость 9,8 мг·экв/г), уравновешенную 16% -ным водным раствором изопропилового спирта (рН 3,3). Сорбцию ведут при скорости 12 мл/см²·ч. В этих условиях проскока вещества нет. Сорбент в колонке промывают 280 мл 16%-ным раствором изопропанола и десорбируют инсулин 23%-ным водным изопропанолом (рН 3,8), содержащим 0,1 М ацетата аммония.

К элюату (115 мл) добавляют 512 мл абсолютного этилового спирта. Получают 1,72 г свиного инсулина (выход 82 мас.) со степенью чистоты 98,6% (по данным ВЭЖХ) и содержанием проинсулина 0,5 п.п.м. (по данным РИА).

П р и м е р 4. 2,2 г инсулина крупного рогатого скота со степенью чистоты 79,8% (по данным ВЭЖХ) и с содержанием проинсулина 238 п.п.м. (по данным РИА) растворяют в 142 мл воды, подкисленной до рН 3,1. Полученный раствор пропускают через колонку (D 3,0 см, Н 12 см, V 160 мл) с ионитом продуктом сополимеризации метакриловой, акриловой кислоты и диметакрилата этиленгликоля (степень набухания К_наб. 4,5; полная обменная емкость 9,2 мг·экв/г), уравновешенную 10%-ным водным раствором изопропилового спирта (рН 3,1). Сорбцию ведут при скорости 15 мл/см²·ч. В этих условиях проскока вещества нет. Сорбент промывают 320 мл 10%-ного водного раствора изопропанола и десорбируют инсулин 22%-ным водным изопропанолом (рН 3,4), содержащим 0,12 М ацетата аммония. К элюату (130 мл) добавляют 585 мл абсолютного этанола. Получают 1,76 г инсулина крупного рогатого скота (выход 80 мас.) со степенью чистоты 98,7% (по данным ВЭЖХ) и с содержанием проинсулина 0,9 п.п.м. (по данным РИА).

П р и м е р 5. 5,7 г свиного инсулина с 79,6% чистоты (по данным ВЭЖХ) и с содержанием проинсулина 19800 п.п.м. (по данным РИА) растворяют в 340 мл воды, подкисленной 0,1 н.НСl до рН 3,4. Полученный раствор пропускают через колонку (D4 см, Р 12 см, V 380 мл) с ионитом, аналогичным примеру 1, уравновешенным 12% -ным раствором изопропилового спирта (рН 3,4). Сорбцию ведут при скорости пропускания 15 мл/см²·ч. В этих условиях проскока вещества нет. Сорбент в колонке промывают 700 мл 12%-ного раствора изопропанола (рН 3,4) и десорбируют инсулин 21%-ным водным изопропанолом (рН 3,9), содержащим 0,15 М ацетата аммония.

К элюату (279 мл) добавляют 820 мл абсолютного этилового спирта. Получают 4,84 г свиного инсулина (выход 85,1 мас.) со степенью чистоты 98,3% (по данным ВЭЖХ) и с содержанием проинсулина 1,2 п.п.м. (по данным РИА).

П р и м е р 6. 5,2 г инсулина крупного рогатого скота (степень чистоты 84,2% по данным ВЭЖХ) и с содержанием проинсулина 23200 п.п.м. (по данным РИА) растворяют в 320 мл воды, подкисленной 0,1 н. НСl до рН 3,2.

Полученный раствор пропускают через колонку (D 4 см, Н 14 см, V 390 мл) с ионитом, аналогичным примеру 1, уравновешенным 14%-ным раствором изопропилового спирта (рН 3,2). Сорбцию ведут при скорости пропускания через колонку 15 мл/см²·ч. В этих условиях проскока вещества нет. Сорбент в колонке промывают 720 мл 14%-ного водного раствора изопропанола (рН 3,2) и десорбируют инсулин 22%-ным водным раствором изопропанола (рН 3,5), содержащим 0,12 М ацетата аммония.

К элюату (242 мл) добавляют 844 мл абсолютного этилового спирта. После высушивания получают 4,48 г инсулина крупного рогатого скота (выход 85,2 мас.) со степенью чистоты 98,0 (по данным РИА).

Изобретение относится к технологии очистки полипептидов. Способ очистки свиного инсулина и инсулина крупного рогатого скота путем колоночной препаративной хроматографии низкого давления включает пропускание водного раствора инсулина - сырца рН 3,0 - 3,5 через ионит - продукт сополимеризации метакриловой, акриловой кислот и диметакрилата этиленгликоля, имеющий степень набухания K_н а б = 4,5 - 4,8 и полную обменную емкость 9,2 - 9,8 мг • экв / г, и процесс осуществляют путем пропускания водного раствора инсулина - сырца с рН 3,0 - 3,5 через указанный ионит, предварительно уравновешенный 10 - 16 %-ным водным раствором изопропанола рН 3,0 - 3,5, затем ионит промывают 10 - 16 %-ным водным раствором изопропанола ( рН 3,0 - 3,5 ) и проводят элюцию инсулина 20 - 25 %-ным водным раствором изопропанола рН 3,4 - 3,9, содержащим 0,05 - 0,15 М ацетата аммония, из полученного алюата целевой продукт выделяют осаждением. Заявляемый способ позволяет повысить степень очистки инсулина до 98,7 %.

СПОСОБ ОЧИСТКИ СВИНОГО ИНСУЛИНА И ИНСУЛИНА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА путем колоночной препаративной хроматографии низкого давления, включающий пропускание водного раствора инсулина-сырца через ионит с последующей элюцией инсулина и осаждением его из элюата, отличающийся тем, что в качестве ионита используют продукт сополимеризации метакриловой, акриловой кислот и диметакрилата этиленгликоля, имеющий степень набухания K_н а б4,5 4,8 и полную обменную емкость 9,2 9,8 мг • экв/г, процесс осуществляют путем пропускания водного раствора инсулина-сырца с pH 3,0 3,5 через укаанный ионит, предварительно уравновешенный 10 16%-ным водным раствором изопропанола с pH 3,0 3,5, затем ионит промывают 10 16%-ным водным раствором изопропилового спирта с pH 3,0 3,5 и проводят элюцию инсулина 20 25%-ным водным раствором изопропилового спирта с pH 3,4 3,9, содержащим 0,05 0,15 М ацетата аммония, из полученного элюата целевой продукт выделяют осаждением.