ДРОЖЖИ SACCHAROMYCES CEREVISIAE ШТАММ ВГШ-2 ДЛЯ БРОДИЛЬНЫХ ПРОИЗВОДСТВ Российский патент 2000 года по МПК C12N1/16 C12N1/16 C12R1/865 

Изобретение относится к пищевой промышленности, к получению нового штамма Saccharomyces cerevisiae ВГШ-2, используемого в различных отраслях: спиртовой, дрожжевой и безалкогольной с применением инулинсодержащего сырья.

Наиболее близким к изобретению является штамм Saccharomyces cerevisiae paca XII. Культура дрожжей хранится в коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН г. Пущино.

К роду Saccharomyces относят дрожжи, у которых вегетативная форма преимущественно диплоидная, конъюгация наблюдается при прорастании или сразу после прорастания аскоспор, могут формироваться диплоидные аскоспоры. Аскоспоры шаровидные или эллипсоидальные с гладкой стенкой, от одной до четырех в аске. Аски устойчивые.

Раса XII обладает ценными производственными свойствами: хорошо сбраживает глюкозу, фруктозу, сахарозу, мальтозу, на 1/3 раффинозу, несколько слабее галактозу. Не сбраживает лактозу. При сбраживании крахмалсодержащего сырья накапливают 6 - 8,5% спирта (по объему), зернокартофельного - до 13 об. %. Дрожжи расы XII развиваются в интервале температур 5-38^oC с оптимумом 30-33^oC. Раса XII - верхнебродящая, дрожжи пылевидные, не образующие хлопьев. Оптимум pH 3,8 - 4,0. После сбраживания зерно-картофельных заторов расой XII остаются неиспользованными около 0,1% галактозы, 0,4% декстринов и 0,5% пентоз.

Культивирование дрожжей осуществляют в анаэробных условиях. При этом наряду с основным продуктом брожения - этиловым спиртом в зрелой бражке образуется глицерин, высшие спирты, альдегиды, органические кислоты, эфир и диоксид углерода.

Недостатками XII расы можно считать достаточно высокое содержание примесей в бражке к концу брожения, неспособность синтезировать ферменты, позволяющие гидролизовать полисахариды, в частности, инулин, считающийся дополнительным углеводным источником, который тоже может использоваться для получения спирта и безалкогольных напитков.

Цель изобретения - создание штамма дрожжей более эффективного при производства спирта (дающего меньшее содержание примесей, обеспечивающего больший выход целевого продукта), а также обладающего способностью синтезировать ферменты, гидролизующие полисахариды, в частности, инулин, для применения его в дрожжевой и пиво-безалкогольной отраслях промышленности.

Поставленная цель достигается методом индуцированной селекции, а именно тем, что на клетки исходной расы (Saccharomyces cerevisiae р. XII) действуют УФ-лучами; УФ-лучами в комплексе с химическими мутагенами.

Полученный штамм обладает в 2,5 - 3 раза большей β-фруктофуранозидазной активностью, синтезирует инулазу.

Раса Saccharomyces cerevisiae ВГШ-2 обладает следующими свойствами.

Морфология
Клетки овальной, яйцевидной формы, размером 6 - 7 • 8 - 9 мкм.

Вегетативная фаза диплоидная, редко высшей плоидности. Аскоспоры имеют гладкую стенку, в основном эллипсоидальной формы, редко овальные, 4 споры в аске.

Физиология.

Дрожжи нацело сбраживают мальтозу, глюкозу, сахарозу. Не сбраживают лактозу, арабинозу, рамнозу. Частично сбраживают галактозу.

Ассимилируют инулин; характерно максимальное потребление сахарозы. Незначительно ассимилируют галактозу, не ассимилируют целлобиозу, трегалозу, мелибиозу, рибозу, рибит, D-маннит.

Из источников азота не способны употреблять триптофан, гистидин, пролин, фенилаланин, потребляют аспарагиновую кислоту, метионин, глутаминовую кислоту, аргинин, лейцин, валин, треонин.

Культуральные признаки.

На глюкозно-пептонном дрожжевом агаре рост обильный, консистенция пастообразная, цвет штриха белый, слегка кремоватого оттенка. Клетки крупные, яйцевидные. На сусло-агаре рост также обильный, колонии белого, слегка кремового цвета, консистенция плотная, с гладкой поверхностью, рост равномерный, клетки крупные, овальные.

На синтетической среде с 0,5% (NH₄)₂SO₄, 4% глюкозы, 0,5% дрожжевого экстракта, 0,1% KH₂PO₄; 0,05% MgSO₄ • 7H_nO; 0,01% CaCl₂ • 2H₂O, 0,01% NaCl рост умеренный, клетки крупные, слегка округлые.

На сбаллансированной питательной среде или с использованием стимуляторов роста органического происхождения генеративная активность исследуемых дрожжей имеет тенденцию к увеличению (накопление биомассы увеличивается на 35 - 50%).

Температурный интервал роста 10 - 40^oC, с оптимумом 34^oC, интервал pH 3,5 - 5,0 с оптимумом 4,2. Время выращивания 24 часа. Штамм депонирован в коллекции чистых культур кафедры микробиологии и биохимии Воронежской государственной технологической академии.

Пример применения в дрожжевой промышленности.

Пример 1.

Выращивание дрожжей с целью накопления биомассы осуществляли следующим образом:
I стадия. Дрожжи на твердой среде (сусло-агар) в пробирках заливали стерильным пивным суслом с массовой долей сухих веществ 8 - 10% по сахаромеру. Культивировали в течение 24 ч в термостате при температуре (34 ± 1)^oC.

II стадия. Стерильное пивное сусло с массовой долей сухих веществ 8 - 10% по сахаромеру разливали в стерильные колбы вместимостью 250 см³ по 50 см³ и переносили в них всю суточную культуру опытных дрожжей, выращенных на сусло-агаре. Культивировали в течение 24 ч в термостате при температуре (34 ± 1)^oC. Полученные дрожжи использовали для засева в колбы-качалки вместимостью 0,75 дм³.

III стадия. Основой питательной среды служит водный экстракт клубней топинамбура, физико-химические показатели которого представлены в табл. 1. В качестве источника азота использовался сульфат аммония, pH среды 4,2. Питательную среду засевали 25 см³ суспензии дрожжей из предыдущей стадии. Культивирование проводили на лабораторной качалке при температуре (34 ± 1)^oC в течение 24 часов.

Пример 2.

I стадия. Дрожжи на твердой среде (сусло-агар) в пробирках заливали стерильным пивным суслом с массовой долей сухих веществ 8 - 10% по сахаромеру. Культивировали в течение 24 ч в термостате при температуре (34 ± 1)^oC.

II стадия. Стерильное пивное сусло с массовой долей сухих веществ 8 - 10% по сахаромеру разливали в стерильные колбы вместимостью 250 см³ по 50 см³ и переносили в них всю суточную культуру опытных дрожжей, выращенных на сусло-агаре. Культивировали в течение 24 ч в термостате при температуре (34 ± 1)^oC. Полученные дрожжи использовали для засева в колбы-качалки вместимостью 0,75 дм³.

III стадия. В качестве контроля готовили мелассовое сусло с массовой долей сухих веществ - 10% по сахаромеру, разбавлением мелласы водой. Затем сусло кипятили в течение 5 минут, охлаждали до комнатной температуры (20 ± 1)^oC, декантировали и подкисляли раствором серной кислоты концентрацией 1 моль/дм³ до pH 4,8. Готовое мелассовое сусло разливали по 100 см³, добавляли в каждую колбу растворы питательных солей: хлористого калия, диаммоний фосфата, сульфата аммония с массовой долей сухих веществ 20% и засевали по 25 см³ суспензии дрожжей ВГШ-2 из предыдущей стадии. Культирование проводили на лабораторной качалке 24 ч при температуре (34 ± 1)^oC.

Для приготовления мелассового сусла использовали мелассу с АООТ "Дрожжи" города Воронежа. Физико-химические свойства мелассы представлены в табл. 2.

Для контроля засевали питательную среду из мелассы дрожжами Saccharomyces cerevisiae XII расы.

Дрожжи по окончании выращивания отделяли от бражки центрифугированием, затем промывали водой и отпрессовывали до влажности ~ 75%. Выход биомассы представлен в табл. 3.

Пример применения в спиртовой промышленности.

Полученную после накопительных стадий биомассу дрожжей расы ВГШ-2 использовали для сбраживания осветленного зернового сусла.

Осахаренное зерновое сусло разделяли на твердую и жидкую фазы. Твердая фракция направляется на утилизацию, а осветленное сусло - на сбраживание.

Концентрация сухих веществ сусла составляла 16%, сбраживаемых углеводов - 14,5 мг/100 см³, начальная pH 5,2. Биомассу засевали в количестве 160 млн. клеток дрожжей/см³, что соответствует 20 г/дм³ в пересчете на прессованные дрожжи с влажностью 75%. Сусло сбраживали при температуре 34^oC.

В дистилляте зрелой бражки определяли концентрацию этилового спирта, примесей (ацетальдегида, этилацетата, пропилового, изобутилового, изоамилового спиртов) на газовом хроматографе ЛХМ-80 методом внутреннего стандарта, содержание сбраживаемых углеводов - методом ВНИИПрБ, накопление дрожжевых клеток - прямым подсчетом на камере Горяева под микроскопом.

Сравнительная характеристика показателей зрелой бражки представлена в табл. 4.

Методы определения активностей.

Метод определения инулазной активности основан на определении редуцирующих веществ, освобождающихся в процессе гидролиза субстрата под действием фермента инулазы. За единицу инулазной активности приняли такое количество фермента, которое катализирует образование 1 мкг редуцирующих веществ за 1 мин вытяжку фермента готовили следующим образом: 10 г дрожжей растирали в ступке и экстрагировали 100 см³ воды при температуре (30 ± 1)^oC в течение 1 часа, после чего отфильтровывали. Для определения активности инулазы реакционную смесь, состоящую из 2 см³ раствора инулина с массовой долей 5% в 0,1 моль/дм³ ацетатном буфере pH 4,7 и 1 см³ раствора фермента инкубировали в течение 20 минут при 50^oC.

Одновременно готовили контрольный опыт: к 2 см³ раствора инулина (с массовой долей 5%) добавляли 3 см³ реактива Фелинга II (50 г NaOH и 200 г тартрата калия-натрия в 1 дм³ дистиллированной воды) и 1 см³ раствора фермента.

В опытной колбе по истечении 20 мин реакцию останавливали, добавляли реактив Фелинга II в количестве 3 см³. После чего в опытную и контрольную колбы приливали по 3 см³ раствора Фелинга I (раствор медного купороса с массовой долей 4%). Затем пробирки с содержимым взбалтывали и погружали в кипящую водяную баню на 6 мин, потом в сосуд с холодной водой и определяли редуцирующие вещества полумикрометодом, отличающегося от известного метода Бертрана тем, что работа ведется с меньшими объемами растворов и для титрования используется раствор KMnO₄ концентрацией 0,01 моль/дм³.

Инулазную активность рассчитывали по формуле:

где A - активность фермента, ед/г или ед/см³;
A₀ - количество редуцирующих веществ, образовавшихся в результате гидролиза инулина, мкг;
A_n - количество редуцирующих веществ в контрольной пробе, мкг;
n - количество культуральной жидкости (фермента), см³;
τ - время гидролиза, мин;
180 - молекулярная масса фруктозы.

Активность инвертазы определяли общепринятым методом [4].

Источники информации
1. Коллекция микроорганизмов института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН г. Пущино.

2. Красников Е.И., Щелокова И.В. Дрожжи, Киев, Наукова думка, 1991.

3. Рухлядева А. П., Полыгалина Г.В. Методы определения активности гидролитических ферментов. - М.: 1981. - с. 288.

Изобретение относится к области бродильной промышленности, конкретно к использованию нового штамма дрожжей при получении спирта и других продуктов этой отрасли. Получен новый штамм дрожжей путем воздействия на клетки штамма Saccharomyces cerevisiae раса ХII ультрафиолетовых лучей в комплексе с химическими мутагенами. Штамм депонирован в коллекции чистых культур кафедры микробиологии и биохимии Воронежской государственной технологической академии под N ВГШ-2. Штамм Saccharomyces cerevisiae ВГШ-2 обладает в 2,5-3 раза большей фруктофуранозидазной активностью, синтезирует инулазу. 4 табл.

Дрожжи Saccharomyces cerevisiae штамм ВГШ-2 для спиртовой, дрожжевой и безалкогольной отраслей с применением инулинсодержащего сырья.