ШТАММ STREPTOMYCES AVERMITILIS НИЦБ 132-ПРОДУЦЕНТ АВЕРМЕКТИНОВ Российский патент 2000 года по МПК C12P19/62 C12P1/06 C12P17/18 C12P1/06 C12R1/465 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к производству антигельминтозного, антипаразитарного препарата абамектина, действующим биологически активным компонентом которого является авермектин Bla.

По химическому строению авермектин Bla представляет собой сложную полициклическую систему, в основе которой лежит 16-членный кислородсодержащий макроцикл (кетолактон с 3 двойными связями в углеродной цепи). К этому ядру примыкают еще 6 колец, из которых одно 5-членное и пять 6-членных (три из них конденсированы с основным циклом). Некоторые атомы водорода в циклах замещены гидроксилами, эфирными и углеводородными радикалами. Разные авермектины отличаются друг от друга наличием в одном положении различных заместителей. Брутто - формула авермектина Bla - C₄₈H₇₂O₁₄, его молекулярная масса 873,1. Кристаллический авермектин нерастворим в воде, хорошо растворяется в ацетоне, метаноле и других органических растворителях. Максимум поглощения у авермектина Bla в ультрафиолетовом свете - при длине волны 244 нм.

Среди современных инсектицидных и антигельминтных соединений авермектины, отнесенные к классу макролидных антибиотиков, наиболее эффективны. Они обладают специфической антипаразитарной активностью в отношении круглых червей, зудных клещей, а также других распространенных нематод и кровососущих насекомых, поражающих домашний скот, птицу и сельскохозяйственные растения.

Типичный продуцент авермектинов - Streptomyces avermitilis синтезирует восемь близкородственных соединений. Наиболее высокой активностью среди которых обладает авермектин Bla [1].

Известны штаммы-продуценты авермектинов, используемые для промышленного производства авермектина Bl или суммы всех авермектинов [2, 3]. Однако суммарное содержание авермектинов, продуцируемое этими штаммами, в настоящее время недостаточно для конкурентоспособного, рентабельного промышленного производства авермектинов, их полусинтетических производных и препаратов на их основе.

Известен штамм S.avermitilis 103 - продуцент авермектинов, полученный из исходного штамма S. avermitilis ATCC 31271 трехступенчатой селекцией [4]. Штамм S.avermitilis 103 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ-S1440. Этот штамм по его способности синтезировать суммарное количество авермектинов более продуктивен. Содержание авермектинов в культуральной жидкости после завершения ферментации достигает 2200-2500 мг/л, доля авермектинов В составляет 50-56% от этого количества. В стандартных условиях ферментации штамм обладает активностью 1200-1800 мкг/мл, что для современного промышленного производства авермектинов явно недостаточно.

Цель изобретения - штамм Streptomyces avermitilis с более высоким уровнем продукции авермектинов, в частности, авермектинов группы Bl (a+b).

Штамм S. avermitilis НИЦБ 132 получен из исходного штамма S.avermitilis 103.

Исходный штамм S. avermitilis 103 высевают на агаризованную среду YME, содержащую стрептомицин в концентрации 0,5 мкг/мл и отбирают спонтанные устойчивые мутанты (Str^r), у которых модифицирована регуляция биосинтеза авермектинов. Выделенные Str^r мутанты с повышенной продукцией авермектинов, в частности, Вl (a+b) компонента, проверяют на способность стабильно в течение четырех поколений сохранять способность к повышенной продукции авермектина Bl. В результате отобран штамм Streptomyces avermitilis НИЦБ 132, обладающий высоким уровнем продукции авермектинов и устойчивый к стрептомицину в концентрации более 0,5 мкг/мл. Исходный штамм S.avermitilis 103 чувствителен к 0,3 мкг/мл антибиотика.

Штамм S. avermitilis НИЦБ 132 характеризуется общей продуктивностью по авермектиновому комплексу 3500-4500 мкг/мл при периодической ферментации на питательных средах в течение 240 часов, при этом содержание Bl компонента составляет 40-50% от общего содержания авермектинов.

Штамм S. avermitilis НИЦБ 132 хранится в коллекции культур научно-исследовательского центра "БИОАН" и в коллекции культур лаборатории биотехнологии продуцентов антибиотиков ГУП "ГосНИИСинтезбелок".

По основным морфологическим и биохимическим признакам S.avermitilis НИЦБ 132 существенно не отличается от типичных продуцентов этого вида и исходного штамма S.avermitilis НИЦБ 103 и имеет следующие характеристики.

Культурально-морфологические признаки.

На среде Хопвуда на 14 сутки образует колонии неправильной формы диаметром до 6 мм. Контур края лопастной. Колонии выпуклые. Поверхность колонии сухая, шероховатая, опущенная, складчатость бородавчатая. Колонии серого цвета с участками белого цвета. Структура колоний неоднородная, консистенция кожистая. Пигмент не образуется.

На среде Гаузе с глюкозой на 14 сутки образует колонии диаметром до 8 мм, неправильной формы с волнистым краем. Рельеф колоний конусообразный. Часто колонии имеют радиальную складчатость. Поверхность колоний сухая, шероховатая, опущенная, но есть участки без опущений. Цвет колоний светло-серый и темно-серый. Структура колоний неоднородная, консистенция плотная. В среду выделяется светло-коричневый пигмент.

На среде YME на 5 сутки образует колонии двух морфологических типов: I - колонии белого цвета с кремовым оттенком, хорошо опущенные, II - колонии выпуклые, почти круглой формы с ровным краем и небольшой складчатостью. Цвет колоний серый, в центре более светлый участок. Диметр колоний 2,0 - 2,5 мм. Поверхность колоний сухая, шероховатая, неопущенная. Оба типа колоний с обратной стороны коричневого цвета. Выделяют в среду коричневый пигмент. Колонии слегка заглублены в агар. На 14 сутки образует колонии неправильной формы с волнистым краем диаметром до 10 мм. Рельеф колоний конусообразный. Поверхность колоний сухая, шероховатая, хорошо опущенная. Складчатость гирозная. Цвет колоний серый с белыми вкраплениями. Структура неоднородная, консистенция плотная.

На среде CP-6 на 5 сутки образует колонии почти круглой формы серовато-коричневого цвета. Диаметром 2 мм. Рельеф колоний куполообразный. Складчатость плохо выражена. В среду выделяет темно-коричневый пигмент. Поверхность колоний сухая, шероховатая, опущение отсутствует. На 11 сутки колонии почти круглой формы со слегка волнистым краем, выпуклые с радиальной складчатостью, серо-коричневого цвета и с немного более темным центром. Поверхность сухая, шероховатая, без опущения. Выделяет темно-коричневый пигмент.

На среде YMS на 5 сутки образует светло-серые и почти белые колонии примерно в равном соотношении. Форма колоний кратерообразная, диаметр 3,0 - 3,5 мм. Поверхность хорошо опущенная, складчатая. Колонии слегка заглублены в агар, выделяют темно-коричневый пигмент. На 11 сутки колонии почти круглой формы с волнистым краем, диаметром 5,5 - 6,0 мм, с выпуклым рельефом. Цвет колоний серый, поверхность сухая, шероховатая с гирозной складчатостью. В среду выделяют коричневый пигмент.

Хорошая споруляция наблюдается на средах СР-6, минимальной Хопвуда и YMS. Спорофоры образуют спирали в виде разветвлений воздушного мицелия. Компактные вначале спирали раскрываются по мере старения культуры. Количество спор в цепочках не более 15, споры обычно сферической и овальной формы.

Биохимические признаки
В минимальной среде Хопвуда с 1% источника углерода растет, используя в качестве источника углерода глюкозу, фруктозу, маннозу, маннит, инозит, рамнозу, сахарозу, лактозу, мальтозу, арабинозу и ксилозу.

Гидролизует желатину и казеин, свертывает молоко.

Хорошо растет и образует воздушный мицелий в интервале температур от 27 до 37^oC, не растет при 50^oC.

Генетические маркеры.

Устойчивость к антибиотикам:
Хлорамфениколу - 30 мкг/мл; тетрациклину - 20 мкг/мл; ампицилину - 100 мкг/мл; стрептомицину - 0,5 мкг/мл.

Пример 1. Получение штамма Streptomyces avermitilis НИЦБ 132.

Исходный штамм Streptomyces avermitilis НИЦБ 103 высевают на плотную агаризованную среду, содержащую (г/л): глюкоза 0,4; мальтэкстракт сухой - 16; дрожжевой экстракт - 4; агар-агар - 18; вода водопроводная до 1 л; стрептомицин в конечной концентрации 0,5 мкг/мл. После 7 - 10 дней инкубации при 28^oC отбирают выросшие на чашках Петри спонтанные мутанты, устойчивые к антибиотику. Частота образования Str^r мутантов составляет 1-3•10^-7. Отобранные Str^r мутанты повторно проверяют на устойчивость к антибиотику в концентрации 0,5 мкг/мл; 1 мкг/мл и 5 мкг/мл. Мутанты, сохранившие устойчивость по крайней мере к 0,5 мкг/мл стрептомицина, проверяют на способность к биосинтезу авермектинов в жидкой ферментационной среде по примеру 2.

Суммарный уровень активности Str^r мутантов определяют методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) (1). Процентное соотношение Bla-Blb определяют методом высокоразрешающей жидкостной хроматографии (ВЖХ) (1). Str^r мутанты характеризуются общим уровнем активности от 2300 до 4500 мкг/мл. Содержание Bl компонента составляет от 1100 до 2000 мкг/мл. Процентное содержание Bla от суммы Bl(a+b) составляет не менее 80%. Из 11 отобранных по данному примеру Str^r мутантов наиболее высокой активностью обладал штамм Streptomyces avermitilis НИЦБ 132, способный продуцировать до 4500 мкг/мл суммы авермектинов, в том числе до 2000 мкг/мл авермектина Bl.

Таким образом, штамм Streptomyces avermitilis НИЦБ 132 обладает биосинтетической способностью, значительно превосходящей таковую исходного штамма.

Пример 2. Ферментация штамма Streptomyces avermitilis НИЦБ 132.

0,1 мл споровой суспензии (исходная концентрация 1•10⁹) штамма Streptomyces avermitilis НИЦБ 132 засевают 5 колб емкостью 750 мл, заполненных по 50 мл посевной среды следующего состава (г/л): глюкоза - 2; соевая мука - 15; дрожжевой автолизат (сухой) - 5; очищенная вода - до 1 л. Значение pH среды до стерилизации составляет 7,2, после стерилизации 6,8. Вегетативный посевной материал выращивают на круговой качалке (количество оборотов 240 - 260/мин) в течение 48 часов при температуре 27±1^oC, 0,5 мл инокулята засевают 50 колб емкостью 750 мл, содержащих по 50 мл ферментационной среды следующего состава (г/л): глюкоза - 70, соевая мука - 12, дрожжевой автолизат - 3; кукурузный экстракт - 3; CaCO³ - 3; вода - остальное. Значение pH среды до стерилизации составляет 7,2, после стерилизации 6,8. Ферментацию осуществляют при температуре 27±1^oC на круговой качалке (240-260 об/мин) в течение 240 часов. После завершения ферментации суммарное содержание авермектинов в культуральной жидкости 50 исследуемых колб составляет от 3500 до 4500 мкг/мл, из которых авермектин Bl(a+b) составляет от 1500 до 2000 мкг/мл, а содержание Bla компонента от суммы Bla+Blb - не менее 80%.

Таким образом, штамм Streptomyces avermitilis НИЦБ 132 обладает высокой способностью к биосинтезу имеющего коммерческое значение компонента авермектинов - авермектина Bl(a+b) в пределах 1500-200 мкг/мл, высоким содержанием авермектина Bla - не менее 80%, способностью хорошо утилизировать ферментационные среды различного состава. Все вышеизложенное позволяет считать, что промышленное использование штамма Streptomyces avermitilis НИЦБ 132 позволит повысить рентабельность производства, снизить себестоимость продукции, повысить ее конкурентоспособность на мировом рынке и рынке России.

Список литературы.

1. Ikeda H. , Omura S. Avermectin Biosyntesis. Chemical Rev. 1997, 97, 2591 - 2609.

2. Патент РФ N 2054848. МПК C 21 P 1/06. Приоритет 20.02.95. Бюл. N 20.02.1996 г.

3. Ikeda H. , Kotaki H., Tanaka H., Omura S. Involvment of glucose catabolism in avermectin production by Streptomyces avermitilis. Antimicrobial agents and Chemotherapy, 1988, vol. 321, N 2, p. 282 - 284.

4. Патент РФ N 2098483. Приоритет 21.08.1995 г. МПК C 12 P 1/06. Бюл. N 34, 10.12.1997.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм Streptomyces avermitilis НИЦБ 132 получен из исходного штамма Streptomyces avermitilis 103 путем селекции на агаризованной среде, содержащей антибиотик стрептомицин, с последующим выделением мутантов, устойчивых к 0,5 мкг/мл стрептомицина, отбором мутантов с наиболее высокой продукцией авермектинов (не менее 3500 мкг/мл), авермектина В1(а + b) (не менее 1500 мкг/мл) и проверкой штамма на способность сохранять данные свойства при культивировании. Штамм может быть использован для промышленного производства авермектинов, в том числе авермектина Bl(a + b).

Штамм Streptomyces avermitilis НИЦБ 132-продуцент авермектинов.