ШТАММ АКТИНОМИЦЕТА STREPTOMYCES AVERMITILIS - ПРОДУЦЕНТ АВЕРМЕКТИНОВ Российский патент 1997 года по МПК C12P1/06 A01N63/00 C12P1/06 C12R1/465 C12P17/08 

Изобретение относится к области промышленного микробиосинтеза, а именно к производству авермектинов, обладающих широким спектром антипаразитарного действия. Препараты на основе авермектинов используются в растениеводстве и ветеринарии.

Известен штамм продуцент авермектинового комплекса Str. avermitilis АТСС 31272 [1] Этот штамм используется для получения антипаразитарных веществ и характеризуется активностью до 500 мкг/мл.

Известен также продуцент авермектинов Str. avermitilis ВКМ АС 1301, который хранится в отечественной коллекции микроорганизмов и обладает активностью до 130 мкг/мл [2]
На основе штамма ВКМ АС 1301 получен штамм 198, который задепонирован в Коллекции ВНИИСХМ под номером 50 и имеет активность до 300 мкг/мл. Недостатком известных штаммов продуцентов авермектинов является относительно низкая активность.

Целью предлагаемого изобретения является расширение спектра отечественных штаммов продуцентов авермектинов и получение более активных культур по биосинтезу авермектинового комплекса.

Для достижения цели используется новый штамм Streptomyces avermitilis (ВНИИСХМ 56) продуцент авермектинов. Штамм получен путем двухэтапной селекции из штамма Str. avermitilis 198, обработанного нитрозометилмочевиной и ультрафиолетовым излучением. Предлагаемый штамм задепонирован во ВНИИСХМ под номером 56.

Культурально-морфологические признаки. Мицелий несептированный, образует субстратный и воздушный мицелий серого цвета, в среду выделяет пигмент от коричневого до темно-коричневого цвета. Средняя толщина гиф 0,6 0,8 мкм, спороносцы спиральные ответвляющиеся по бокам гиф воздушного мицелия. Споры сферические, овальные размером от 0,95 мкм и выше.

На агаризованных средах культура образует бархатистые колонии от белого до темно-серого цвета. Колонии радиально складчатые с ровными краями, по центру наблюдается кратер, в среду выделяется растворимый пигмент темно-коричневого цвета. Субстратный мицелий хорошо прикреплен. Воздушный мицелий вначале белый, затем серый, бархатистый. Растет при температуре 20 - 40^oC, оптимум температуры 28 32^oC, при 50^oC не растет.

Интервал pH-роста 5,0 9,0.

Рост на синтетических средах. На среде Чапека с глюкозой или сахарозой образует мелкие колонии от белого до серого цвета, поверхность складчатая. Пигмент светло-серый или светло-коричневый не обильный. Крахмально-аммиачный агар: колонии мелкие, малоскладчатые, слабопигментированные, белые.

Рост на органических средах: картофельный агар рост обильный мицелий серый, обратная сторона агара темно-коричневая или коричнево-фиолетовая. Растворимый пигмент коричневый.

На картофельных ломтиках рост обильный, воздушный мицелий серый, пигментация серо-коричневого цвета. На сусло-агаре рост средний, колонии мелкие, серые, пигмент коричневый. Мясопептонный агар: колонии белые и сероватые с кольцом, складчатые, слабопигментированные.

Физиолого-биохимические признаки: аэроб, желатину разжижает, молоко пептонизирует, крахмал гидролизует. Нитраты восстанавливает, целлюлозу не разлагает, тирозиназа положительная. Среда Треснера-Данга чернеет.

Отношение к углеводам: ассимилирует глюкозу, арабинозу, фруктозу, лактозу, мальтозу, маннозу, рафинозу, рамнозу, ксилозу, сахарозу, крахмал, декстрины, инозит. Не ассимилирует целлюлозу.

Отношение к источникам азота: использует как минеральный (cоли азотной кислоты, аммонийные соли), так и органический азот (мочевина, пептон, яичный альбумин, аминокислоты).

При культивировании в глубинных условиях биосинтез авермектинов начинается с 24 ч роста и продолжается до 10 сут. в зависимости от условий культивирования.

Сущность изобретения поясняется следующими примерами.

Пример 1.

Лиофилизированную культуру Str. avermitilis (ВНИИСХМ-56) из ампулы переносят в качалочную колбу 750 мл с 50 мл стерильной среды состава, глюкоза 4, БВК 0,6, кукурузный экстракт 0,3, мел 0,3, соевая мука 1,2, вода остальное. Начальное значение рН 7,0.

Культивирование осуществляют на качалке с числом оборотов 180/мин при температуре 28^oC. Через 24 ч культивирования выросший мицелий используют в качестве инокулята для засева качалочных колб с вышеуказанной средой. Для этого в 750 мл колбы с 50 мл среды вносят 2 мл инокулята и культивируют при 180 об/мин, 28^oC. Каждые сутки роста снимают по 3 колбы для определения авермектинов в культуральной жидкости. Определение проводят методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Для этого отбирают 5 мл культуральной жидкости и помещают в центрифужную пробирку. Биомассу отделяют центрифугированием при 8000 об/мин в течение 15 мин. Надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют дистиллированную воду (5 мл), перемешивают и снова центрифугируют. Надосадочную жидкость сливают и к осадку добавляют 5 мл этанола для экстракции авермектинов. Экстракцию проводят при перемешивании в течение 20 мин. Биомассу от экстракта отделяют центрифугированием. Надосадочный спиртовый раствор авермектинов используют для хроматографии. При этом 0,003 мл спиртового раствора наносят на колонку и проводят анализ в следующем режиме: температура 20^oC, скорость потока элюента 0,1 мл/мин, детектор при 246 нм.

Для построения калибровочного графика используют фирменный препарат ИВОМЕК с концентрацией 0,01 г/мл. Калибровочные растворы имеют концентрацию 0,001, 0,0008, 0,0006, 0,0004, 0,0002 и 0,0001 г/мл. Расчет суммарного содержания авермектинов в культуральной жидкости проводят по формуле

где С концентрация авермектинов в культуральной жидкости, г/мл,
К калибровочный коэффициент,
ΣSi Si сумма площадей пиков авермектинов, см²,
Y объем образца, нанесенного на колонку, см³.

Концентрация авермектинов в культуральной жидкости на первые сутки роста составляет 70 мкг/мл. Дальнейшая динамика накопления авермектинов по суткам составляет 90, 120, 200, 260, 290, 300 мкг/мл.

Пример 2.

Все операции осуществляют, как в примере 1, за исключением того, что культивирование продуцента проводят при аэрации 220 об/мин. При этом интенсивность развития культуры выше, и конечный выход авермектинов на 7 сут. роста составляет 600 мкг/мл.

Пример 3.

Все операции осуществляют, как в примере 1, но продуцент культивируют при аэрации 280 об/мин, при этом выход авермектинов составляет 500 мкг/мл.

Пример 4.

Все операции осуществляют, как в примере 2, но в качестве ферментационной среды используют следующую композицию, крахмал 5,0, БВК 0,6, кукурузный экстракт 0,3, мел 0,3, соевая мука 1,2, вода до 100% Выход авермектинов на 7 сут. роста составляет 580 мкг/мл.

Пример 5.

Все операции проводят, как в примере 2, но продуцент культивируют при температуре 35^oC. При этом продуктивность штамма составляет 300 мкг/мл.

Пример 6.

Все операции осуществляют, как в примере 2, но культивирование продуцента проводят при температуре 25^oC. Продуктивность штамма при этом составляет 540 мкг/мл.

Пример 7.

Для определения биологической активности авермектинов, продуцируемых предлагаемым штаммом, используют рисовую нематоду Aрhelenchoides bessei. Определение проводят параллельно с фирменным ИВОМЕКОМ. Берут 1%-ный спиртовой раствор авермектинов и ИВОМЕК. Из каждого препарата готовят разведения от 100 до 10000 раз. Из каждого разведения по 100 мкл вносят в ячейки микропланшеток. Затем в ячейки помещают по 15 20 особей нематод и микропланшетки инкубируют в термостате при 30^oC. Через 2 ч анализируют состояние нематод. Установлено, что при разведении в 1000 раз оба препарата вызывают паралич (отсутствие движения) тест-объектов.

Таким образом, представленные примеры демонстрируют, что штамм Streptomyces avermitilis (ВНИИСХМ-56) отличается высокой активностью в плане биосинтеза авермектинов, а продуцируемый авермектиновый комплекс обладает нематоцидным действием. Следовательно, штамм может быть использован для получения антипаразитарных препаратов.

Штамм хранится в коллекции Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии под номером 56.

Источники информации
1. Bung R.W. Miller B.M. et. all. Avermectins new family at potenf antyhelmintic agents, producing organism and fermentation. Antimicrob. Agents Chemother. 1979, 15, p. 361 367.

2. Черменский Д. Н. Аданин В.М. и др. Авермектины: Биотехнологические особенности штамма-продуцента Str. avermitilis ВКМАс 1301. Прикладная биохимия и микробиология, N 6, 1991.

Использование: изобретение относится к микробиологической промышленности, производству авермектинов и касается нового штамма актиномицета для производства авермектинов. Сущность изобретения: штамм актиномицета Streptomyces avermitilis получен путем двухэтапной селекции из штамма Streptomyces avermitilis-198, обработанного нитрозометилмочевиной и ультрафиолетовым излучением. Штамм депонирован в коллекции ВНИИСХМ под номером 56. При культивировании штамма в глубинных условиях выход авермектинов на 7 сут. составляет 300 - 600 мкг/мл.

Штамм актиномицета Streptomyces avermitilis ВНИИСХМ-56 продуцент авермектинов.