БИОДАТЧИК ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ИОНОВ НИТРАТА ИЛИ НИТРИТА И СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИОНОВ НИТРАТА И/ИЛИ НИТРИТА Российский патент 2000 года по МПК C12M1/40 

Настоящее изобретение имеет отношение к созданию биодатчиков, а более конкретно биодатчиков для обнаружения ионов нитрата или нитрита.

В связи с озабоченностью возрастающей степенью загрязнения почвы и поверхностных вод нитратами и нитритами значительный интерес представляет анализ в поле и непрерывный мониторинг концентраций нитратов и нитритов. Обычно эти вещества обнаруживают методами мокрого химического анализа в растворе, что является дорогостоящим и занимает много времени.

Ранее для обнаружения нитрата был предложен амперометрический биодатчик, который основан на процессе получения электронов ферментом редуктазы от донора-посредника. Однако предложенные для использования в таком биодатчике доноры-посредники, такие как окислительно-восстановительные красители, вырабатывают относительно низкий отрицательный потенциал окисления-восстановления (от -400 мВ до -700 мВ), что вызывает появление значительных токов помех в реальных пробах, возникающих при восстановлении кислорода и других восстановимых веществ, присутствующих в пробе.

Задачей настоящего изобретения является создание усовершенствованного биодатчика, в котором решена указанная проблема.

В соответствии с первым аспектом настоящего изобретения биодатчик содержит биохимическое вещество (продукт), способное к осуществлению биохимической реакции в присутствии ионов нитрата или нитрита, и преобразователь, предназначенный для детектирования преобразуемого выходного вещества (агента), выработанного прямо или косвенно при помощи реакции биохимического вещества в присутствии ионов нитрата или нитрита, причем биохимическое вещество содержит редуктазу для ионов нитрата или нитрита и кофермент, который окисляется за счет восстановления ионов нитрата или нитрита, при этом биодатчик отличается тем, что биохимическое вещество включает в себя фотолюминесцентный ингредиент, который вырабатывает прямо или косвенно в качестве указанного выходного вещества фотоны за счет окисления указанного кофермента, и тем, что указанный преобразователь содержит фотоприемник.

В соответствии со вторым аспектом настоящего изобретения в нем предлагается биодатчик для обнаружения ионов нитрата или нитрита, причем биодатчик содержит композицию иммобилизированного (закрепленного) фермента, включающую в себя определенное количество фермента редуктазы нитрата или нитрита, определенное количество кофактора (дополнительного вещества), который может принимать восстановленное состояние и окисленное состояние и который преобразуется из его восстановленного состояния в его окисленное состояние за счет восстановления указанного фермента редуктазы, определенное количество дополнительного кофермента, способного возбуждать реакцию окисления в присутствии указанного кофактора в его указанном окисленном состоянии, за счет чего указанный кофактор преобразуется в его восстановленное состояние для поддержания поставки (поступления) кофактора в его восстановленном состоянии, чтобы позволить производить дальнейшее восстановление ферментом редуктазы, и средства для обнаружения степени окисления, вызванной вторым коферментом, причем степень окисления, вызванная вторым кофактором, является единицей (мерой) измерения образования кофактора в его окисленном состоянии, которая, в свою очередь, является мерой измерения количества ионов нитрата или нитрита, восстановленных ферментом редуктазы, причем указанные средства обнаружения содержат фотоприемник для обнаружения фотонов, испускаемых прямо или косвенно в результате окисления, вызванного вторым коферментом.

Биодатчик может включать в себя композицию закрепленного фермента, которая содержит как кофермент нитрата, так и кофермент нитрита, так что нитрит, полученный восстановлением нитрата, далее восстанавливается редуктазой нитрита.

В соответствии с третьим аспектом настоящего изобретения в нем предусматривается создание способа обнаружения ионов нитрата или нитрита, причем способ предусматривает подачу ионов нитрата или нитрита в биодатчик в соответствии с первым или вторым аспектами настоящего изобретения, что вызывает восстановление ионов нитрата или нитрита ферментом редуктазы, за счет чего происходит выход фотонов при окислении кофермента, и обнаружение испускаемых фотонов фотоприемником.

Указанный кофактор может содержать фермент никотинамида NADPH, который окисляется в NADP⁺ в сочетании с восстановлением, обеспечиваемым редуктазой, и затем повторно восстанавливается в NADPH за счет окисления указанным вторым коферментом, за счет чего поддерживается поступление NADPH.

Указанный второй кофермент сам может производить указанные фотоны или они могут быть произведены посредством одного или нескольких коферментов, действующих в химической цепи кофермента.

Указанные фотоны могут быть произведены ферментом люциферазы. Это может быть использовано в реакции биохимической цепи совместно с NADPH, например, описанным выше образом.

Обычно редуктазы могут быть использованы совместно с ферментом никотинамина NADPH в качестве кофермента, который окисляется в NADP⁺ за счет восстановления ионов NO₃- или NO₂-редуктазами. Выработка NADP⁺ может быть обнаружена за счет окисления дополнительного восстановителя, причем при этом окислении получают непосредственно или за счет возбуждения дальнейших реакцией окисления-восстановления указанные выходные фотоны.

Например, выработка NADP⁺ может быть обнаружена путем окисления спирта, например первичного или вторичного спирта, например алифатического спирта, такого как гексанол или октанол, в его соответствующий альдегид, например, в присутствии дегидрогеназы спирта, например TADH, которую получают из Thermoanaerobium brockii. Полученный таким образом альдегид может быть обнаружен реакцией с восстановленным флавином FMNH₂ в присутствии кислорода совместно с ферментом люциферазы в качестве катализатора реакции. Люцифераза может быть получена из Vibrio harveyi и имеется в широкой продаже. Она является очень чувствительной к присутствию альдегида и может обнаруживать концентрации в таких низких количествах, как всего несколько молекул (pmol), при условии излучения света в реакции, которую она катализирует. Интенсивность излученного света является мерой степени преобразования NADP⁺ в NADPH, что, в свою очередь, является мерой измерения имеющейся концентрации нитрата или нитрита. Примеры таких цепочек реакций приводятся далее.

Желательные ферменты редуктазы имеются в продаже или могут быть выделены известным образом из грибов, микроводорослей или растений. Например, для восстановления нитрата этот фермент может содержать виды аспергиллы (EC 1.6.6.2). Для восстановления нитрита этот фермент может содержать, например, кишечную палочку (EC 1.9.6.1), которая просто может быть выделена из аэробных бактерий или водорослей и высших растений. Такие ферменты, как это уже известно, могут потребовать присутствия известного активатора, например FAD.

Такие ферменты редуктазы могут быть стабилизированы известным для специалистов образом, например, как это описано в EP 244, 771.

В биодатчике в соответствии с настоящим изобретением желательно иммобилизировать и стабилизировать биохимические вещества (вещество) в непосредственной близости к преобразователю так, чтобы ферменты оставались активными в течение длительного времени (например, месяцы или годы) и не терялись датчиком. Аналогично уже известным решениям иммобилизация может быть достигнута поглощением органического или неорганического носителя, физическим вводом в гель, расположением за полупрозрачной мембраной, сшиванием при помощи бифункциональных или многофункциональных реактивов или ковалентным связыванием с преобразователем непосредственно или с применением элемента связи.

Биодатчик в соответствии с настоящим изобретением является подходящим средством измерения концентраций ионов нитрата и/или нитрита в заданной пробе. Так как биодатчик не является амперометрическим, он не подвержен воздействию проблем, связанных с токами помех, от которых страдают известные ранее амперометрические биодатчики, поэтому он может обеспечивать более высокую точность измерения. Дополнительным преимуществом биолюминесцентных биодатчиков является их высокая селективность и высокая чувствительность относительно ионов, подлежащих обнаружению. Более того, биодатчик в соответствии с настоящим изобретением обладает тем преимуществом, что кофактор, например NADPH, окисляется в сочетании с восстановительным действием в цикле окисления-восстановления, за счет чего поддерживается постоянное поступление кофактора без необходимости в его добавлении (восполнении).

Варианты осуществления настоящего изобретения будут более ясны из последующего описания, приведенного со ссылкой на сопроводительные чертежи.

На фиг. 1 показан вид сбоку биодатчика, выполненного в соответствии с настоящим изобретением.

На фиг. 2 показан вид сбоку альтернативного варианта биодатчика, выполненного в соответствии с настоящим изобретением.

На фиг. 3 схематически показан обобщенный процесс, в котором задействованы биохимические реакции, которые могут быть использованы в биодатчиках, выполненных в соответствии с настоящим изобретением.

На фиг. 4 схематически показан обобщенный процесс, в котором задействованы биохимические реакции, которые могут быть использованы в биодатчиках, выполненных в соответствии с настоящим изобретением.

На фиг. 5 схематически показан пример биохимического процесса, который может быть использован в биодатчиках, выполненных в соответствии с настоящим изобретением.

На фиг. 6 схематически показан другой пример биохимического процесса, который может быть использован в биодатчиках, выполненных в соответствии с настоящим изобретением.

На фиг. 7 схематически показан пример биохимического процесса, который может быть использован в биодатчиках, выполненных в соответствии с настоящим изобретением.

На фиг. 8 схематически показан пример биохимического процесса, который может быть использован в биодатчиках, выполненных в соответствии с настоящим изобретением.

Как показано на фиг. 1, конструкция биодатчика включает в себя иммобилизированный и стабилизированный слой фермента 11, в который входит редуктаза, который покрыт полупрозрачной мембраной 13 и находится в пробе 15 подлежащего изучению водного раствора, который содержится в сосуде 17. Волоконно-оптический кабель 19 при помощи зажима 21 подключен к одному из концов слоя 11. Другой конец кабеля 19 подключен к фотоприемнику 23, встроенному в люксметр (люминометр) 25. Выходной сигнал с фотоприемника 23 обрабатывается в расположенном в люксметре 25 электронном блоке 27 и поступает на визуальный индикатор 29.

При работе показанного на фиг. 1 устройства ионы нитрата или нитрита, подлежащие обнаружению в образце 15, восстанавливаются одним из путей, описанных здесь, при помощи ферментов, содержащихся в слое 11, причем в результате протекания соответствующей серии химических реакций получают фотоны, при этом число фотонов является мерой концентрации восстановленных и, следовательно, присутствующих ионов нитрата или нитрита. Фотоны, поступающие по кабелю 19, детектируются фотоприемником 23, а выходной сигнал фотоприемника поступает на индикатор 29, откалиброванный в уровнях концентрации обнаруженных ионов нитрата или нитрита.

Показанное на фиг. 2 устройство аналогично устройству фиг. 1, с тем отличием, что иммобилизированный слой фермента образует часть люксметра, показанную на фиг. 2 позицией 30, поэтому не требуется применение волоконно-оптического кабеля. Таким образом, в устройстве фиг. 2 ионы нитрата/нитрита в образце 31 преобразуются иммобилизированным слоем фермента 33, с которым они могут вступать в контакт через полупрозрачную мембрану 35, а результирующие выработанные в слое 33 фотоны непосредственно воспринимаются фотоприемником 37, смежным слою 33, а затем сигнал фотоприемника при помощи электронного блока 39 преобразуется в выходной сигнал для устройства индикации 41.

На фиг. 3 изображена общая схема реакции, иллюстрирующая работу биодатчика в соответствии с настоящим изобретением. Подлежащие обнаружению ионы нитрата восстанавливаются коферментом редуктазы нитрата в нитрит, с сопутствующим окислением кофактора в его окисленное состояние, например NADPH в NADP⁺. Количество кофактора в окисленном состоянии детектируется повторным восстановлением кофактора в его восстановленное состояние, за счет чего поддерживается содержание кофактора в этом состоянии, что осуществляется за счет действия окисления кофермента, которое сопутствующим образом приводит к окислению подлежащего окислению соединения в его состояние окисленного соединения, причем полученное количество окисленного соединения детектируется прямо или косвенно датчиком биолюминесцентного окисления при помощи одного из путей (методов), описанных выше со ссылкой на фиг. 1 или 2. Например, подлежащее окислению соединение может представлять собой спирт, окисление кофермента может представлять собой дегидрирование спирта, а окисленное соединение может представлять собой альдегид.

На фиг. 4 изображена общая схема реакции, иллюстрирующая работу биодатчика при обнаружении нитрита. Ионы нитрита могут быть получены в результате восстановления ионов нитрата в соответствии с фиг. 3. Альтернативно, ионы нитрита могут уже существовать (иметься в наличии).

Реакции, отображенные на фиг. 4, протекают аналогично реакциям фиг. 3, с тем отличием, что нитрит на фиг. 4 восстановлен редуктазой нитрита в NH₃.

Теперь будут описаны примеры слоев закрепленного фермента, предназначенные для использования в указанных выше вариантах осуществления изобретения. В следующих примерах предполагается, что ионы нитрата или нитрита существуют в измеряемой пробе.

Пример 1. Спаренная система с биолюминесцентной люциферазой для восстановления нитрата
Пример иллюстрируется фиг. 5. В этом случае редуктаза преобразует NO₃- в NO₂-, a NADPH окисляется в NADP⁺. Этот окисленный продукт повторно восстанавливается за счет окисления октанола в октанал, что осуществляется дегидрированием (дегидрогеназой) спирта коферментом, который может быть получен из имеющегося в широкой продаже Thermoanaerobium brockii. Дегидрогеназа спирта показана на фиг. 5 как TADH. Октанол реагирует с восстановленным флавином FMHN₂ в присутствии кислорода и катализируется люциферазой, при этом также получают LUC и производные октеновой кислоты, оксидоредуктазу FMN и воду, как это показано на фиг. 5. При этом образуется свет, который может быть обнаружен ранее описанным со ссылками на фиг. 1 и 2 образом.

Как упоминалось ранее, биодатчики биолюминесценции обладают высокой селективностью, определяемой реакцией фермента, и высокой чувствительностью, достаточной для регистрации нескольких квантов света. Преимущественно, люцифераза представляет собой фермент, ответственный за реакцию излучения света излучающими свет бактериями, причем она может быть использована в соответствии с фиг. 5 для катализа реакции молекулярного окисления с восстановленным флавином и алифатическим альдегидом для образования долгоживущих промежуточных соединений, распадение которых дает энергию для излучения света с разумно высоким квантовым выходом (около 10%), в соответствии со следующей схемой:
FMNH₂ + RCHO + O₂ ---> FMN + RCHOO + H₂O + hν,
где RCHO представляет собой алифатический альдегид, а hν представляет собой свет.

Восстановленный флавин может быть получен in situ (в пробирке) реакциями окисления-восстановления определенного NAD(P)H:FMN
NAD(P)H + FMN + H⁺ ---> NAD(P)⁺ + FMNH₂,
за счет чего обеспечивается связь с искомой системой посредством NADP⁺, в зависимости от дегидрогеназы спирта.

Пример 2. Спаренная система с биолюминесцентной люциферазой для восстановления нитрита
Пример иллюстрируется фиг. 6. В этом случае процесс протекает аналогично обнаружению нитрата, показанному на фиг. 5, с тем отличием, что вместо редуктазы нитрата используется редуктаза нитрита, а при восстановлении нитрита получают аммиак.

Испускаемый свет, полученный при помощи показанного на фиг. 6 процесса, детектируется аналогично фиг. 1 или фиг. 2.

Пример 3. Альтернативная система для восстановления нитрата.

Этот пример показан на фиг. 7. Он является альтернативой примеру, показанному на фиг. 5. Процесс протекает аналогично показанному на фиг. 5, но с тем отличием, что окисление октанола в октанал при помощи TADH заменено аналогичным окислением деканола в деканал, который затем окисляется в декановую кислоту.

Пример 4.

Этот пример показан на фиг. 8. Он является альтернативой примеру, показанному на фиг. 6. Процесс протекает аналогично показанному на фиг. 7, но с тем отличием, что первоначальной операцией восстановления является переход нитрита в NH₃ при помощи редуктазы нитрита.

В примерах 3 и 4 деканол может представлять собой z-тетрадеканол, а деканал может представлять собой z-тетрадеканал. Коферментом дегидрогеназы спирта может быть дегидрогеназа спирта Thermoanaerobium ethanolicus.

В примерах 1-4 полученный FMN может быть повторно восстановлен в FMNH₂ при помощи NADH-специфичной FMN оксидоредуктазы, за счет чего поддерживается поступление FMNH₂.

Биодатчики могут быть использованы для анализа степени загрязнения почвы и поверхностных вод нитратами и нитритами. Конструкция биодатчика содержит иммобилизированный и стабилизированный слой фермента (11), покрытый полупрозрачной мембраной (13), и находится в пробе (15) для изучения водного раствора. Кабель (19) подключен к одному из концов слоя фермента (11), а другим - к фотоприемнику (23), встроенному в люксметр (25). Ионы нитрата или нитрита в пробе (15) восстанавливаются при помощи слоя ферментов (11). В результате химических реакций получаются фотоны. Число фотонов является мерой концентрации присутствующих ионов нитрита или нитрата. Фотоны детектируются фотоприемником (23). Выходной сигнал фотоприемника поступает на индикатор (29), откалиброванный в уровнях концентрации обнаруженных ионов нитрата или нитрита. Кроме того, в биодатчике другой конструкции иммобилизированный слой фермента образует часть люксметра, поэтому применение кабеля не требуется. Преимуществом биолюминесцентных биодатчиков является их высокая селективность и чувствительность относительно ионов, подлежащих обнаружению. 2 с. и 7 з.п. ф-лы, 8 ил.

1. Биодатчик ионов нитрата и/или нитрита, отличающийся тем, что он содержит редуктазу, первый кофермент, фотолюминесцентный ингредиент и преобразователь, включающий фотоприемник, причем указанный первый кофермент способен переходить в окисленную форму при восстановлении ионов нитрата и нитрита с выделением из фотолюминесцентного ингредиента фотонов, обнаруживаемых указанным фотоприемником. 2. Биодатчик по п. 1, отличающийся тем, что он дополнительно содержит композицию иммобилизованного фермента, включающую указанную редуктазу и первый кофермент, и второй кофермент, способный возбуждать реакцию окисления в присутствии окисленной формы первого кофермента, приводящую к восстановлению первого кофермента и фермента редуктазы, причем второй кофермент способен вызывать выработку фотолюминесцентным ингредиентом фотонов, характеризующих степень окисления, вызванного вторым коферментом. 3. Биодатчик по п.2, отличающийся тем, что он содержит композицию иммобилизованного фермента, включающую кофермент нитрата и кофермент нитрита, обеспечивающие восстановление редуктазой нитрита, восстановительного из нитрата. 4. Биодатчик по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что указанный первый кофермент в окисленной форме содержит фермент никотинамида NADPH, способный окисляться до NADP⁺ при восстановлении, обеспечиваемом редуктазой. 5. Биодатчик по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что он выполнен с возможностью вырабатывания фотонов посредством одного или более дополнительных коферментов, участвующих в коферментной цепи. 6. Биодатчик по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что он выполнен с возможностью вырабатывания фотонов посредством фермера люциферазы, участвующего в реакции биохимической цепи совместно с NADPH. 7. Биодатчик по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что он дополнительно содержит спирт и фермент дегидрогеназу, предназначенные для определения окисления NADP⁺ по окислению спирта в альдегид под действием фермента дегидрогеназы. 8. Биодатчик по п.7, отличающийся тем, что датчик выполнен с возможностью обнаружения альдегида по реакции с восстановлением флавином FMNH₂ в присутствии кислорода, который совместно с ферментом люциферазой катализирует реакцию. 9. Способ определения ионов нитрата и/или нитрата, отличающийся тем, что приведение анализируемой среды в контакт с биодатчиком, охарактеризованным в любом из пп. 1 - 8, причем фермент редуктаза вызывает восстановление ионов нитрата или нитрита, а в процессе окисления первого кофермента происходит генерирование фотонов, обнаруживаемых фотоприемником.