БИОСЕНСОР Российский патент 1999 года по МПК G01N33/00 G01N33/68 G01N33/84 C12Q1/26 

Настоящее изобретение относится к биосенсорам, а точнее к биосенсорам для обнаружения ионов металла, а именно ионов тяжелых металлов.

В одной из известных форм биосенсора, описанной в европатенте N 263948 и включенной в настоящее описание в качестве ссылки, преобразователем служит реактивный биохимический компонент, представляющий собой белок из группы фитохелатинов. В контакте с водными растворами ионов тяжелых металлов соединения фитохелатина приводят к изменению на выходе преобразователя и, следовательно, осуществляют быстрый анализ ионов тяжелых металлов. Однако такое обнаружение не позволяет определить конкретный тип металла и, более того, когда белок соединится с тяжелым металлом, то очень трудно отделить тяжелый металл от образовавшегося соединения, например, если с помощью белка необходимо проводить дальнейшие измерения.

Целью настоящего изобретения является создание улучшенного биосенсора, позволяющего исключить эти проблемы.

В соответствии с первым отличительным признаком настоящего изобретения биосенсор состоит из биохимиката, способного в присутствии ионов металла вызывать химическую реакцию, и преобразователя, способного обнаруживать преобразуемый выходной агент, создаваемый прямо или косвенно реакцией, вызванной биохимикатом в присутствии ионов металла, и отличается тем, что биохимикат содержит фермент, который для обнаруживаемого металла является редуктазой.

В соответствии со вторым отличительным признаком настоящего изобретения предлагается способ обнаружения ионов металла, заключающийся в том, что соответствующий первому отличительному признаку биодатчик подвергается воздействию ионов металла, что заставляет фермент редуктазу вызывать восстановление ионов металла и тем самым прямо или косвенно создавать преобразуемый выходной агент, который и обнаруживается преобразователем биосенсора.

Ионами металла, обнаруживаемыми в соответствии с настоящим изобретением, могут быть ионы ртути, хрома, мышьяка, технеция, меди, серебра, золота, селена, ванадия, молибдена или урана. Ферменты редуктазы для биохимического восстановления каждого из этих типов металла хорошо известны из литературы. Обнаруживаемые частицы металла могут присутствовать в исследуемой пробе, являющейся, например, водным раствором, в виде простых ионов металла или в виде соединений или комплексов, например органометаллических.

Если обнаруживаемый тип металла присутствует в виде соединения или комплекса, может потребоваться использовать другой химический или биохимический агент, например фермент, чтобы превратить соединение или комплекс в состояние простого металлического иона с тем, чтобы его можно было обнаружить с помощью фермента редуктазы. Например, для превращения органометаллических соединений ртути в простые ионы ртути, которые могут обнаруживаться редуктазой ртути, можно использовать лиазу ртути.

В отличие от известного способа, описанного в вышеупомянутом европатенте, настоящее изобретение позволяет осуществить обнаружение ионов металла, которые весьма характерны для данного типа металла. Так, например, редуктаза ртути весьма характерна для присутствия ионов ртути. Более того, металл, полученный в процессе восстановления с использованием фермента редуктазы, может отделяться, концентрироваться и, если необходимо, восстанавливаться из содержащей его среды.

Биосенсор, соответствующий первому отличительному признаку настоящего изобретения, может нуждаться в использовании совместно с редуктазой металла кофермента, который является источником электронов для процесса восстановления иона металла. Кофермент может вырабатывать обнаруживаемый преобразователем сигнал как самостоятельно, так и с помощью одного или нескольких других коферментов коферментной химической цепи.

Редуктаза может использоваться совместно с ферментом никотинамида НАДФ (NADPH) в качестве кофермента, который окисляется в НАДФ+(НАДФ+) за счет восстановления обнаруживаемых частиц металла, например за счет восстановления Hg(II) в Hg(O) редуктазой ртути. Образование НАДФ+ может быть обнаружено окислением следующего восстановителя, таким образом, окисление либо непосредственно, либо за счет вызова одной или более последующих реакций окисления-восстановления, создает один из вышеуказанных выходных агентов.

Примеры вызванных ферментом окислительно-восстановительных цепей, включая использование редуктазы и НАДФ, приведены ниже.

Преобразователь может содержать детектор, который обнаруживает преобразуемый выходной агент, полученный в ходе реакции, включающей в себя химическое изменение кофермента, соответствующее редуктазе или ее коферменту и внесенное прямо или косвенно восстановлением, созданным редуктазой. Указанный выходной агент может содержать, например, протоны, которые могут обнаруживаться известным фотодетектором, например, люминометром. Альтернативно, выходной агент может содержать электроны, которые могут обнаруживаться известной амперметрической схемой, содержащей чувствительный к электронам электрод. Еще выходной агент может содержать протоны, ионы, теплоту или массу, которые могут постоянно измеряться по мере их создания в реальном времени.

Если редуктаза является редуктазой ртути, то ее можно использовать совместно с ферментом никотинамида НАДФ в качестве кофермента, который окисляется в НАДФ+ за счет восстановления Hg(II) в Hg(O) редуктазой ртути. Соединение НАДФ+ может быть обнаружено окислением следующего восстановителя, таким образом, окисление либо непосредственно, либо за счет вызова одной или более последующих реакций окисления-восстановления, создает один из вышеуказанных выходных агентов.

Примеры вызванных ферментом окислительно-восстановительных цепей, включая использование редуктазы и НАДФ, приведены ниже.

Источники лиазы и редуктазы ртути для обнаружения ртути описанным выше образом известны. Кроме этого, лиазу и редуктазу ртути можно получить методом молекулярного клонирования, в котором фрагменты ДНК, кодирующие гены лиазы и редуктазы вводятся в клонирующие векторные молекулы в неживом виде. Рекомбинантные клоны лиазы и редуктазы ртути изолируются и физически и функционально описываются рядом субклонирующих процедур. Наконец, клонирование влечет за собой включение соответствующих хозяину сигналов транскрипции и трансляции.

Соответствующий первому отличительному признаку настоящего изобретения биосенсор со всей своей определенностью для данных ионов металла имеет множество возможных применений, связанных с обнаружением любых металлов, имеющих подходящий фермент редуктазы, например таких, как перечисленные выше. Ртуть, например, является одним из наиболее токсичных металлов, содержащихся в окружающей среде в достаточных количествах, который во множестве различных ситуаций желательно точно определять. Ртуть вредна даже в очень низких концентрациях и в отличие от множества других тяжелых металлов не имеет ни одной полезной биологической функции. Металлическая ртуть несколько менее реактивна для биологических систем, чем ее ионная или органическая формы. В более высоких концентрациях ртуть биоцидна, в то время как в более низких концентрациях ионы ртути мутагенны и тератогенны.

Увеличение концентрации ионов Hg²⁺ относительно фоновой в несколько тысяч раз свойственно для использования ртутных фунгицидов в бумажном производстве и сельском хозяйстве, ртутных катализаторов в промышленности и дезинфицирующих средств в больницах. В одной только хлорощелочной промышленности из каждой тонны получаемого хлора в окружающую среду может попадать в виде ионов свыше 15 г ртути. Наиболее традиционной неорганической солью ртути является HgS, содержащая в руде, красной киновари, до 7 весовых процентов ртути. Около 10¹⁰ тонн горных пород (содержащих в среднем около 80 мг ртути на килограмм) выветривается ежегодно, высвобождая в окружающую среду порядка 800 тонн Hg(II), а запасы ртути в океане оцениваются в 200 млн. тонн. Концентрация растворенной в воде Hg(II) обычно составляет от 0,03 до 2,0 мкг/л (то есть до 10^-8 М). Ртуть естественно содержится в окружающей среде главным образом в виде метила ртути, появляющегося в результате биометилирования ионов ртути с помощью метила В в сточных водах и осадках.

Арильные соединения ртути являются промышленными загрязнителями, связанными, например, с бумажной промышленностью. Эти органические соединения ртути токсичны частично за счет их лигирования с тиольными группами в белках и частично за счет их липофильности, которая позволяет им легко проходить через биологические мембраны и приводит к их скапливанию в пищевой цепи. Метиловая ртуть в 50-100 раз токсичнее неорганической Hg²⁺, что в 1950-х годах в результате употребления содержащих соединения метиловой ртути морепродуктов привело в японских городах Минимата и Ниигата к массовым отравлениям. Позднее, в Ираке подобные отравления были вызваны употреблением муки из зерна, обработанного акрилртутными фунгицидами.

В соответствии с одной из конкретных форм настоящего изобретения создан способ обнаружения интересующих металлических примесей, отличающийся тем, что согласно его первому отличительному признаку, биосенсор подвергается воздействию ионов обнаруживаемой примеси, заставляя тем самым фермент редуктазу вызывать восстановление металлических примесей и за счет этого посредством окисления кофермента обеспечивать испускание фотонов; и тем, что обнаружение испускаемых фотонов осуществляется фотодетектором.

Указанный кофермент может сам испускать указанные фотоны, либо они могут испускаться одним или несколькими другими коферментами, присутствующими в биохимической цепи кофермента.

Указанные фотоны могут испускаться ферментом люциферазой. Это может использоваться в биохимической цепной реакции совместно с НАДФ, например, описанным ниже образом.

Редуктазы в указанной конкретной форме настоящего изобретения можно удобно использовать вместе с ферментом никотинамида НАДФ в качестве кофермента, который окисляется в НАДФ+ за счет восстановления ионов металла редуктазой. Соединение НАДФ+ может быть обнаружено окислением следующего восстановителя, причем за счет окисления прямо или за счет вызова следующих окислительно-восстановительных реакций могут создаваться указанные испускаемые фотоны.

Например, создание НАДФ+ может обнаруживаться за счет окисления спирта, например, первичного или вторичного спирта, например, спирта алифатической кислоты, такого как гексанол или октанол, в соответствующий альдегид, например, в присутствии алкоголь-дегидразы, например, TADH, которая получается из Thermoanaerobium brockii. Полученный таким образом альдегид может быть обнаружен реакцией с восстановленным флавином FMNH² в присутствии кислорода вместе с ферментом люциферазой в качестве катализатора реакции. Люцифераза коммерчески доступна, но может быть также получена из Vibrio harveyi. Она весьма чувствительна к присутствию альдегида и может определять концентрации даже пикомолярных количеств, вызывающих испускание света в ходе реакции, катализатором которой они являются. Интенсивность испускаемого света является мерой количества НАДФ+, превращенного в НАДФ+Н, который, в свою очередь, является мерой концентрации ионов металла. Примеры таких реакций приведены ниже.

В соответствующем первому отличительному признаку настоящего изобретения биосенсоре желательно, чтобы биохимический агент (или агенты) был неподвижен и стабилизирован в непосредственной близости от преобразователя, так чтобы ферменты оставались активными в течение длительных периодов времени (например, в течение нескольких месяцев или лет) и не исчезали с сенсора. Как и в известном уровне техники, неподвижность агента может достигаться его адсорбированием на органический или неорганический носитель, физическим включением в гель, помещением за полупроницаемой мембраной, созданием поперечных межмолекулярных связей с помощью бифункциональных или многофункциональных реагентов или ковалентного связывания с преобразователем либо непосредственно, либо с помощью связующего вещества.

Если преобразователь имеет электрод, последний может быть в виде диска, проволоки или отпечатанной на пластмассовой или алюминиевой подложке металлизации из вольфрама или стеклоуглерода. Биохимикат в удобных случаях может осаждаться на электрод, например, с помощью трафаретной печати.

Ниже следует описание вариантов осуществления настоящего изобретения на примерах со ссылками на прилагаемые фигуры чертежей, из которых:
Фиг. 1 представляет собой вид с торца в разрезе соответствующей настоящему изобретению конструкции биосенсора;
Фиг. 2 представляет собой вид сбоку соответствующей настоящему изобретению конструкции другого биосенсора;
Фиг. 3 показывает вид сбоку соответствующей настоящему изобретению конструкции альтернативного биосенсора;
Фиг. 4-7 дают схематичное представление биохимических реакций, которые могут использоваться в соответствующих настоящему изобретению биосенсорах.

Как показано на фиг. 1, биосенсор содержит слой 1 из неподвижного и стабилизированного фермента, включающий в себя редуктазу металла, осажденную (с нижней стороны) на электрод 2, служащий для него подложкой, и закрывающую слой 1 полупроницаемую мембрану 3.

При работе слой 1 контактирует через мембрану 3 с пробой водного раствора, возможно содержащего обнаруживаемые металлические ионы. С помощью ряда биохимических реакций, проводимых одним из описанных выше способов, металлические ионы слоем 1 восстанавливаются в металл, в результате чего создаются электроны, а число созданных электронов является мерой концентрации ионов металла.

Электрод 2 соединен (не показано) со стабилизатором напряжения, который, в свою очередь, вырабатывает выходной сигнал для индикатора (не показан), причем величина сигнала является мерой обнаруженной концентрации ионов металла.

Как показано на фиг. 2, конструкция другого биосенсора содержит слой 11 из неподвижного и стабилизированного фермента, включающий в себя редуктазу, которая в содержащейся в сосуде 17 пробе 15 водного исследуемого раствора закрыта полупроницаемой мембраной 13. Волоконно-оптический кабель 19 проходит через защитное кольцо 21 так, что одним из его концов контактирует со слоем 11, а другой конец соединен с фотодетектором 23 измерителя яркости 25. Выход фотодетектора 23 обрабатывается блоком электроники 27 измерителя яркости 25, а выходные сигналы визуально индицируются на дисплее 29.

При работе показанной на фиг. 2 конструкции ионы металла, которые нужно обнаружить в пробе 15 восстанавливаются одним из описанных выше способов ферментами слоя 11, фотоны создаются соответствующим рядом химических реакций, а число фотонов является мерой концентрации присутствующих ионов металла. Фотоны попадают на фотодетектор 23 по кабелю 19, а выход фотодетектора используется для управления индикатором 29 с целью получения индикации уровня концентрации обнаруживаемых ионов металла.

Конструкция, показанная на фиг. 3, похожа на конструкцию фиг. 2 за исключением того, что слой неподвижного фермента образует часть измерителя яркости, показанную на фиг. 2 позицией 30, так что между ними не нужно волоконно-оптического кабеля. Таким образом, на фиг. 3 ионы металла в пробе 31 превращаются стабилизированным и неподвижным слоем 33, с которым они осуществляют контакт через полупроницаемую мембрану 35, а результирующие фотоны, созданные в слое 33, обнаруживаются непосредственно фотодетектором 37, находящимся вблизи слоя 33, который с помощью блока электроники 39 вырабатывает выходной сигнал для индикации на индикаторе 41.

Приведем для приведенных выше вариантов осуществления примеры неподвижных слоев фермента. В каждом из следующих примеров предполагается, что ионы металла уже существуют. Для разрушения комплекса или соединения металлической примеси до ионов металла, чтобы начать процесс, могут потребоваться другие ферменты. Например, если необходимо обнаружить ртуть, то для превращения органических соединений ртути в обычные ионы ртути может использоваться лиаза ртути совместно с редуктазой ртути.

Пример 1. Система с диафоразо/метилвиологенной (MV) связью
Данный пример проиллюстрирован на фиг. 4. Здесь для обнаружения в пробе ионов металла совместно НАДФ используется редуктаза.

Редуктаза производит восстановление ионов металла, а фермент НАДФ заодно окисляется в НАДФ+. Этот продукт окисления перевосстанавливается в НАДФ диафоразой из Clostridium kluyvery и одноэлектронным восстановителем (MV⁺) из метилвиологена (MV²⁺). Электроны, высвобожденные при метилвиологенном окислении, используются для индикации концентрации присутствующих ионов металла, например, описанным со ссылками на фиг.1 способом.

Пример 2. Система с пероксидной связью
Этот пример проиллюстрирован на фиг. 5. В данном случае редуктаза металла снова восстанавливает обнаруживаемые ионы металла, а НАДФ окисляется в НАДФ+. Окисленный кофермент НАДФ+ ферментно перевосстанавливается с дегидрогеназой L-глутамата (например, из бычьей печени), трансаминазой глутамат-пирувата (например, из свиного сердца) и оксидазой пирувата (например, из Pediococcus ssp).

Продуктом, как показано на фиг. 5, является H₂O₂, а его концентрация может измеряться прямым способом, например, на платиновом электроде при 0,7V или посредством безмедиаторного пероксидазного электрода, использующего грибковую пероксидазу, полученную из Arthromyces ramosus для окисления H₂O₂ в буферном фосфатном растворе с pH 7,0. Электрод и слой фермента могут быть сконструированы, как показано на фиг.1.

Пример 3. Включающая октанол система со связью за счет биолюминесцентной люциферазы
Этот пример проиллюстрирован на фиг. 6. В данном случае редуктаза восстанавливает обнаруживаемые ионы металла, а НАДФ снова окисляется в НАДФ+. Этот окисленный продукт перевосстанавливается за счет окисления октанола в октанол, вносимый коферментом дегидрогеназы алкоголя, например, полученной из коммерчески доступного Thermoanaerobium brockii.

Дегидрогеназа алкоголя обозначена на фиг. 6 формулой TADH. Октанол вступает в реакцию с восстановленным флавином, FMHN₂, в присутствии кислорода, катализатором которой служит люцифераза, LUC и продукты октановой кислоты, в результате, как показано на фиг. 6, образуются оксидоредуктаза FMN и вода, и вызывается испускание света, который может быть обнаружен, как описано со ссылками на фиг. 2 и 3.

Как уже говорилось выше, биолюминесцентные биосенсоры обладают высокой точностью за счет ферментной реакции и чувствительности, достаточной для регистрации квантов света. Предпочтительно, чтобы люцифераза представляла собой фермент, отвечающий за реакцию испускания света люминесцирующих бактерий, и могла использоваться, как показано на фиг. 6, в качестве катализатора для реакции молекулярного кислорода с восстановленным флавином и алифатическим альдегидом с целью образования долгоживущих промежуточных соединений, разрушение которых создает энергию, необходимую для испускания света с достаточно высоким квантовым выходом (порядка 10%), а именно:
FMNH₂ + RCHO + O₂ ---> FMN + RCOOH + H₂O + hv,
где RCHO обозначает алифатический альдегид, a hv - свет.

Восстановленный флавин создается на своем месте специальными оксидоредуктазами NAD(P)H : FMN
NAD(P)H + FMN + H⁺ ---> NAD(P)⁺ FMNH
и за счет этого связывается с целевой системой через зависящую от НАДФ+ дегидрогеназу алкоголя.

Пример 4. Система для восстановления нитрита со связью за счет биолюминесцентной люциферазы
Этот пример проиллюстрирован на фиг. 7. Процесс проводится похожим на фиг. 6 способом, так как показан на ней за исключением того, что в данном случае перевосстановление НАДФ+ осуществляется окислением деканола в деканал дегидрогеназой кофермента, например, полученной из коммерчески доступного Thermoanaerobium brockii.

Изобретение относится к медицинской технике, а именно к средству для определения ионов тяжелых металлов. Биосенсор, состоящий из биохимиката, способного в присутствии ионов металла вызывать химическую реакцию, и преобразователя, способного обнаруживать преобразуемый выходной агент, создаваемый прямо или косвенно реакцией, вызванной биохимикатом в присутствии ионов металла. Биохимикат содержит фермент, который для обнаруживаемого металла является редуктазой. Указанные ионы металла могут выбираться из группы, включающей в себя ионы ртути, хрома, мышьяка, технеция, меди, серебра, золота, селена, ванадия, молибдена и урана. Редуктаза может использоваться с коферментами в биохимической цепи реакции, например кофермента никотинамида НАДФ и испускающего свет кофермента люциферазы. Техническим результатом изобретения является расширение арсенала средств для определения ионов тяжелых металлов в окружающей среде. 2 с. и 11 з.п.ф-лы, 8 ил.

1. Биосенсор, состоящий из биохимиката, способного в присутствии ионов металла вызывать химическую реакцию, и преобразователя, способного обнаруживать преобразуемый выходной агент, создаваемый прямо или косвенно реакцией, вызванной биохимикатом в присутствии ионов металла, отличающийся тем, что биохимикат содержит фермент, который для обнаружения металла является редуктазой. 2. Биосенсор по п.1, отличающийся тем, что указанные ионы металла выбираются из группы, включающей в себя ионы ртути, хрома, мышьяка, технеция, меди, серебра, золота, селена, ванадия, молибдена и урана. 3. Биосенсор по п.1 или 2, отличающийся тем, что обнаруживаемые примеси металла содержатся в виде комплекса или соединения, а биохимикат включает в себя кофермент для превращения соединения или комплекса металла в состояние простого иона металла для его обнаружения с помощью фермента редуктазы. 4. Биосенсор по п.3, отличающийся тем, что для превращения органических соединений ртути в простые ионы ртути ферментом служит редуктаза ртути, а коферментом - лиаза ртути. 5. Биосенсор по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что биохимикат совместно с редуктазой металла содержит кофермент, который является источником электронов для процесса восстановления ионов металла, причем кофермент может прямо или косвенно вырабатывать посредством одного или нескольких коферментов в коферментной химической цепи преобразуемый выходной агент, который может обнаруживаться преобразователем. 6. Биосенсор по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что указанный выходной агент содержит протоны, ионы, теплоту или массу, которые могут непрерывно измеряться в реальном времени по мере их выработки преобразователем. 7. Биосенсор по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что редуктаза используется совместно с коферментом НАДФ. 8. Биосенсор по п.7, отличающийся тем, что выходной агент содержит фотоны, создаваемые ферментом люциферазой, который используется совместно с редуктазным коферментом НАДФ. 9. Биосенсор по п.8, отличающийся тем, что смесь ферментов содержит алкогольдегидрогеназу, которая окисляет спирт до альдегида путем восстановления окисленного НАДФ. 10. Биосенсор по п.9, отличающийся тем, что люцифераза используется в качестве катализатора для окисления альдегида, полученного реакцией окисления дегидрогеназы. 11. Биосенсор по п.10, отличающийся тем, что окисление альдегида осуществляется за счет реакции альдегида с восстановленным флавином в присутствии кислорода совместно с люциферазой. 12. Способ обнаружения ионов металла, отличающийся тем, что биосенсор по п.1 подвергают воздействию ионов металла, в результате чего фермент редуктаза вызывает восстановление ионов металла и тем самым прямо или косвенно создает преобразуемый выходной агент, который обнаруживают преобразователем биосенсора. 13. Способ по п.12, отличающийся тем, что выходной агент содержит фотоны, создаваемые ферментом люциферазой в биохимической цепи реакции, в которой используют фермент редуктазу и кофермент НАДФ.