СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ПИЕЛОНЕФРИТА Российский патент 2000 года по МПК G09B23/28 

Изобретение относится к области медицины и найдет применение при экспериментировании патологических процессов у человека.

Пиелонефрит по своей частоте и склонностью к хроническому течению занимает ведущее место среди остальной патологии мочевыделительной системы, как у взрослых, так и у детей. Вместе с тем многие стороны патогенеза этого заболевания до конца не ясны и требуют дальнейшего изучения. Тот факт, что в этиологии пиелонефрита основное место занимает грамотрицательная флора, требует поиска универсальных механизмов патогенности, характерных для всей этой группы микроорганизмов. Известно, что для всей группы грамотрицательной флоры одним из таких общих патогенных факторов является эндотоксин (ЭТ), связанный с липополисахаридами (ЛПС) клеточных мембран (А.В. Аполлонин, М.Ю. Яковлев, А. А. Рудик, В.Г. Лиходед. Эндотоксин связывающие системы крови // Журн. Микробиол. - 1990. - N11. - С. 100 - 106.). Изучение роли ЭТ грамотрицательных бактерий в патогенезе пиелонефрита, поиск возможных способов моделирования заболевания с использованием ЭТ позволят раскрыть неясные механизмы возникновения и хронизации микробно-воспалительного процесса в мочевой системе и способствуют поиску эффективных методов терапии этого заболевания.

Проведенными исследованиями выявлены различные способы моделирования пиелонефрита. Так, авторским свидетельством N 1422239 МПК G 09 B 23/28 N 33 Есилевского Ю. М. с соавт. защищен "Способ моделирования пиелонефрита". Для осуществления способа однократно внутривенно вводили 20 - 25% раствор этанола, а затем также внутривенно кишечную палочку. Недостатком этого способа является то, что для моделирования применяется сильнодействующее токсическое вещество, что не соответствует клиническим условиям развития заболевания.

Авторским свидетельством N 15485827 МПК G 09 B 23/28 Есилевского Ю.М. с соавт. защищен "Способ моделирования интерстициального нефрита", который осуществлялся путем перевязки почечной вены на 15-60 мин. Недостатком этого способа является то, что создается грубое нарушение оттока крови, на фоне которого развивается абактериальный интерстициальный процесс. На этой модели трудно изучить роль бактериальных этиологических факторов.

В монографии (Н.А. Лопаткин, А.Г. Пугачев, В.Е. Родоман. Пиелонефрит у детей /АМН СССР. - М. "Медицина", 1979. - 256 с.) приводятся результаты моделирования острого гематогенного пиелонефрита на кроликах с использованием четырех видов микроорганизмов: золотистого плазмокоагулирующего стафилококка 209, белого плазмокоагулирующего стафилококка, кишечной палочки М-17 и вульгарного протея. Экспериментальные животные были разбиты на 4 группы с учетом использованной микрофлоры. Из этих четырех групп экспериментальную модель острого гематогенного пиелонефрита удалось получить только в двух сериях введения внутривенно золотистого или белого плазмокоагулирующего стафилококка. В сериях опытов с введением внутривенно условно-патогенных микробов - кишечной палочки М-17 и вульгарного протея модель пиелонефрита получить не удалось. Авторы подтвердили невозможность моделирования гематогенного пиелонефрита путем введения грамотрицательной флоры без локального преморбидного фона. Недостатком этого способа моделирования гематогенного пиелонефрита с использованием плазмокоагулирующих стафилококков является то, что он не раскрывает патогенетические механизмы развития пиелонефрита. На этой модели невозможно изучить роль ведущих факторов патогенности грамотрицательной флоры - эндотоксинов, механизмы формирования преморбидного фона с участием ЭТ.

Этот способ как наиболее близкий по технической сущности и клиническим проявлениям взят в качестве прототипа.

Целью настоящего изобретения является приближение модели к клиническому течению заболевания, получение стабильного воспроизведения модели, снижение затрат на создание экспериментальной модели.

Эта цель достигается путем введения в почечную ткань экспериментального животного (белая крыса) ЛПС Клебсиеллы - 211 и через 24 ч внутривенного введения разрешающей дозы ЛПС и взвеси штамма кишечной палочки - О 75, взятого от больного пиелонефритом.

Описание способа
Экспериментальное животное подвергается обезболиванию путем внутримышечного введения 1% раствора калипсола 0,2 мл и 0,5% раствора реланиума 0,1 мл. Затем животное фиксируется на операционном столе на животе с перекрещенными задними лапами. После стрижки и обработки кожи в левой пояснично-подреберной области косым разрезом в направлении от реберной дуги к подвздошной области вскрывается брюшная полость. Тупым корнцангом фиксируется левая почка и в ткань почки вводится 0,1 мл ЛПС Клебсиеллы в физиологическом растворе в концентрации 17,5 мкг, в 1 мл. Разрез послойно зашивается шелковой нитью. Через 24 ч внутривенно вводится разрешающая доза ЛПС - 1,0 мл в той же концентрации и взвесь суточной культуры кишечной палочки, полученной от больного пиелонефритом, в дозе 2•10⁶ микробных тел.

В разные сроки наблюдения - через 24 ч, 48 ч, 3, 5, 7, 11, 22, 28, 32, 35 суток животных забивали декапитацией под эфирным наркозом. Для анализа брали цельную кровь. В стерильных условиях вскрыли брюшную полость. После осмотра внутренних органов удаляли почки, взвешивали их. Проводили посевы на твердые питательные среды Эндо для кишечной палочки путем отпечатков срезов почечной ткани. Кусочки почечной ткани, печени, легких фиксировали в 10% растворе формалина для морфологического исследования. Оставшуюся ткань отмывали от крови холодным физиологическим раствором, измельчали ножницами и гомогенизировали в керамическом гомогенизаторе с последующим центрифугированием.

В сыворотке крови и гомогенатах почек определяли уровень антитоксических антител против ЛПС в реакции пассивной гемагглютинации, активность ферментов антиоксидантной защиты - каталазы и супероксидисмутазы (СОД). Стабильность цитомембран клеток изучена на эритроцитах опытных крыс с определением их осмотической резистентности по общепринятым методикам. Феномен адгезии изучен с использованием эритроцитов экспериментальных животных и микробной взвеси Клебсиеллы с высокой степенью адгезивности.

Подтверждается предложенный способ следующими примерами.

Пример 1. Белой крысе, массой 200 г, проводили обезболивание путем внутримышечного введения калипсола 1% - 0,2 мл и реланиума 0,5% - 0,1 мл. Затем крысу фиксировали на операционном столе, на животе с перекрещенными задними лапами. Волосяной покров кожи над левой пояснично-подреберной областью состригли ножницами, обработали 5% спиртовым раствором йода. Косым разрезом в направлении от реберной дуги к паховой области вскрывали брюшную полость, левую почку фиксировали тупым корнцангом. В почечную ткань в глубину 2 мм (на величину скоса иглы) вводили 0,1 мл ЛПС Клебсиеллы - 211 в концентрации 17,5 мкг в 1 мл. Разрез послойно зашили шелковой нитью. Крысу поместили в отдельный бокс.

Через 24 ч крыса активная, рана сухая, стул не изменен. После осмотра крысу фиксировали на операционном столе. В хвостовую вену ввели разрешающую дозу ЛПС 1,0 мл в той же концентрации и 0,2 мл взвеси (2•10⁶ микробных тел) суточной культуры кишечной палочки, полученной от больного ребенка хроническим пиелонефритом.

Дальнейшее наблюдение: В первые часы после введения разрешающей дозы ЛПС крыса вялая, шерсть взъерошена. Через 24 ч сохраняется некоторая вялость, стул жидкий, часто пьет воду.

Животное забили декапитацией под эфирным наркозом. Взяли кровь на сыворотку и в пробирку с гепарином 0,1 мл. Вскрытие проводили в стерильных условиях в боксе после тотального обескровливания животного. Внутренние органы без особенности. Левая почка отечная, на латеральной поверхности след укола, отличающийся от окружающих тканей белым оттенком. После удаления почки взвесили. Масса опытной левой почки - 500 мг, масса правой контрольной почки - 300 мг. Процент превышения массы оперированной почки - 66,6.

Сделали посев на среду Эндо путем отпечатков срезов почечной ткани. Кусочки почечной ткани, печени, легких, сердца отобрали в 10% формалин для морфологического исследования. Из оставшейся части почечной ткани после повторного взвешивания приготовлены гомогенаты для биохимического исследования.

Для гистологического исследования фиксированные в формалине кусочки почки проводились через спирты возрастающей крепости и заливались в парафин. Приготовленные срезы окрашивались гематоксилином-эозином на коллагеновые волокна по Ван Гизону, реактивом Шиффа на гликозамингликаны и выборочно на фибрин по Вейгерту.

Данные морфологического исследования: В левой опытной почке вне зоны прохождения иглы на фоне неизмененных компонентов коркового вещества выявлены мозаично расположенные участки, представленные проксимальными отделами канальцев нефронов с эпителием в состоянии резко выраженного мутного набухания, что сопровождается резким уменьшением просвета канальцев. Эпителий в области дистальных отделов нефрона очагово в состоянии сегментарного некроза, частично спущен. В юкстамедуллярной зоне отдельные канальцы содержат эозинофильные массы или небольшие скопления эритроцитов. Мозговое вещество отечно. Интерстициальная ткань, прилежащая к некоторым переполненным полиморфно-ядерными лейкоцитами капиллярам, содержит большое количество нейтрофилов. Эндотелий некоторых сосудов набухший, вакуолизирован, местами слущен. Сосуды коркового вещества резко расширены с признаками агрегации эритроцитов, вены полнокровны, артериолы спазмированы. В юкстамедуллярной зоне определяются кровоизлияния (фиг. 1).

Таким образом, указанные изменения почечной ткани с признаками некротически-геморрагического воспаления (некрозы нефротелия, кровоизлияния, очаги инфильтрации полиморфно-ядерными лейкоцитами) при предложенном способе введения ЛПС и культуры кишечной палочки свидетельствуют о токсическом и аллергическом поражении почки по типу локального феномена Шварцмана.

В правой почке клубочки не изменены. Эпителий проксимальных канальцев мозаично находится в состоянии мутного набухания. Мозговое вещество отечно. Нефротелия не изменены, некоторые клетки не одинаково воспринимают ядерные красители. Сосуды коркового и мозгового вещества расширены, приносящие артериолы спазмированы.

Указанные изменения в правой почке свидетельствуют о нарушении микроциркуляции и наличии гипоксических и токсических изменений нефротелия, более выраженные в проксимальных отделах нефронов.

При гистологическом исследовании стенки сердца структуры эпикарда, миокарда и эндокарда не изменены. Кардиомиоциты без признаков дистрофических изменений.

В легких просвет бронхов всех калибров свободен, эпителиальная выстилка соответствует калибру бронха. Просвет альвеол свободен. Межальвеолярные перегородки не утолщены. Признаков токсического поражения легких нет.

При исследовании печени дольки и балки ее имеют обычное строение. Гепатоциты в основном без патологии. Лишь отдельные эпителиальные клетки печени в состоянии некробиоза. Внутридольковые капилляры и компоненты "триады" не изменены. Однако очагово в двух местах отмечается расширение внутридольковых синусоидов печени с увеличением содержания полиморфно-ядерных лейкоцитов в них.

Выявленные изменения со стороны печени свидетельствуют о токсическом поражении в результате эндотоксинемии.

Результаты бактериологического исследования: В отпечатках срезов почечной ткани на средах Эндо получен сплошной рост кишечной палочки, штамм 075 с левой почки и более 10 колоний этих же микробов с правой почки. Изучение патогенных свойств полученных штаммов подтвердило их идентичность введенным внутривенно микроорганизмам.

Титр антитоксических антител в сыворотке крови к ЛПС Клебсиеллы 210 1: 20,0 (в контрольной группе 1:5 - 1:10).

Состояние ферментов антиоксидантной защиты в гомогенатах почек:
Левая опытная почка - удельная активность катализы на 1 мг белка 0,44; удельная активность СОД на 1 мг белка - 4,28 ед.

Правая почка - активность каталазы - 0,38; удельная активность СОД - 3,5. В контрольной группе активность каталазы и СОД соответственно 0,31 и 2,90 ед на 1 г белка.

Показатель адгезии и осмотическая стабильность мембран эритроцитов:
Осмотическая резистентность эритроцитов - степень гемолиза 0,59 (в норме 0,44).

Средний показатель адгезии Клебсиеллы на эритроцитах 3,5 (в контрольной группе - 0,49; адгезивная способность использованных штамм Клебсиеллы более 4).

Индекс адгезии - процент эритроцитов, участвующих в адгезии - 50% (в контрольной группе - 35%).

Таким образом, полученные данные свидетельствовали о том, что у экспериментального животного с использованием эндотоксинов грамотрицательных бактерий была воспроизведена модель токсического и пара аллергического поражения почки по типу локального феномена Шварцмана с нарушением в системе свободнорадикального окисления и антиоксидантной защиты, стабильности цитомембран, на фоне которых гематогенное введение микрофлоры способствовало развитию бактериурии.

Пример 2. Белой крысе массой 180 г по описанному в примере 1 способу с использованием тех же дозировок и методических подходов воспроизведен опыт. Срок наблюдения 72 ч.

Животное забили декапитацией под эфирным наркозом. Органы брюшной полости без особенности. Оперированная левая почка отечная, на разрезе полнокровная. Капсула тусклая, спаяна с подлежащими тканями. Масса левой почки 610 мг, масса правой почки 550 мг. Процент превышения массы опытной почки составил 10,9.

Данные морфологического исследования: В корковом веществе левой почки часть клубочков не изменена, меньшая часть сдавлена набухшими клетками проксимальных канальцев. В проксимальных и дистальных отделах нефрона отдельные клетки находятся в состоянии сегментарного некроза. Характерным для этого срока наблюдения является резкое очаговое расширение просвета канальцев нефрона на всем его протяжении и наличие в них не только слущенных клеток, но и скопление нейтрофилов в виде комочков гноя. Перемещение нейтрофилов прослеживается от коркового вещества до сосочков почки и ее собирательных трубочек. Мозговое вещество отечно. Нейтрофилы находятся не только в просвете некоторых канальцев, но и инфильтрируют интерстициальную ткань (фиг. 2). Сосуды расширены, полнокровны, многие содержат плазму.

Таким образом, наличие скоплений нейтрофилов в просвете канальцев нефрона и выраженная лейкоцитарная инфильтрация интерстиция свидетельствует о создании модели острого гематогенного пиелонефрита на фоне токсических и гипоксических изменений (дистрофия, некроз, нарушение микроциркуляции, полнокровие, кровоизлияния).

В контралатеральной почке кроме участков мутного набухания проксимальных отделов нефрона со сдавливанием клубочков, участков некроза нефротелия и отека интерстиция при расширенных полнокровных сосудах отмечается увеличение количества лимфоцитов в интерстициальной ткани, преимущественно в мозговом веществе
Нарастание в правой почке лимфоцитарной инфильтрации интерстиция свидетельствует об общей эндотоксинемии и продолжающемся развитии нефропатии по типу интерстициального нефрита.

Бактериологическое исследование отпечатков почечной ткани на среды Эндо: посев стерилен.

Титр антитоксических антител в РПГА - 1:40.

Удельная активность СОД в гомогенатах левой опытной почки 5,90 ед., правой почки - 4,2 ед. на 1 г белка. Степень изменения в опытной почке по сравнению с контрольной группой - 1,97. Удельная активность каталазы левая почка - 0,48,правая почка - 0,4. Степень изменения - 1,55.

Осмотическая резистентность эритроцитов (степень гемолиза) - 0,61. Средний показатель адгезии - 4,0. Индекс адгезии - 90%.

Таким образом, выявленные морфологические и лабораторные изменения через трое суток после введения внутривенно кишечной палочки свидетельствовали о том, что у экспериментального животного был воспроизведен острый гематогенный пиелонефрит, приближенный к клиническим проявлениям у человека.

Пример 3. Крыса массой 200 г после воспроизведения опыта по вышеописанной методике наблюдалась в течение 5 суток. Забили экспериментальное животное декапитацией под эфирным наркозом. Внутренние органы без особенности. Левая почка визуально не увеличена, поверхность гладкая, капсула отделяется с трудом. На месте введения первичной дозы ЛПС виден белый след укола. Правая почка не изменена. Масса левой почки 650 мг, масса правой почки 500 мг. Преобладания массы левой почки 30%.

Данные морфологического исследования: В корковом веществе левой почки отмечается выраженное мутное набухание эпителия части проксимальных отделов нефронов со сдавливанием находящихся в этой зоне клубочков. Вне зоны мутного набухания клубочки не изменены. Эпителий проксимальных канальцев чаще с утратой щеточной каемки, атрофичен, местами некротизирован. Эпителий дистальных канальцев очагово в состоянии сегментарного некроза. Отдельные группы канальцев расширены, содержат эозинофильные массы, другие канальцы заполнены слущенными клетками и нейтрофилами. Мозговое вещество резко отечно, обильно инфильтрировано нейтрофилами, в канальцах содержится гной (фиг. 3).

Таким образом, характер воспаления с усилением инфильтрации ткани почки полиморфно-ядерными лейкоцитами и формированием гнойных очагов свидетельствуют о развитии острого гематогенного гнойного пиелонефрита.

В корковом веществе контралатеральной почки очагово отмечается мутное набухание, сдавливание клубочков. Некрозы нефротелия, некоторое увеличение лимфоцитов в строме области некротизированного эпителия канальцев. Мозговое вещество отечно. В единичных канальцах отложения солей кальция. Эти изменения свидетельствуют о развитии нефропатии по типу тубуло интерстициального нефрита с оксалатно-кальциевой кристаллурией.

Бактериологическое исследование: отпечатки левой почки на среду Эндо дал сплошной рост кишечной палочки, из правой почки рост микрофлоры отсутствует.

Титр антитоксических антител в сыворотке крови 1:320.

Состояние антиоксидантной защиты, стабильность цитомембран и степень адгезии микрофлоры на цитомембранах:
удельная активность СОД в гомогенатах левой почки - 7,40 ед., правой - почки - 4,8 ед. на 1 г белка;
удельная активность каталазы в гомогенате левой почки - 0,56 ед., правой - 0,45 ед. на 1 г белка;
степень осмотического гемолиза эритроцитов 0,60; средний показатель адгезии Клебсиеллы на эритроцитах 2. Индекс адгезии - 70.

Таким образом, выявленные морфологические и лабораторные данные свидетельствуют о том, что в экспериментальных условиях у крыс воспроизведен острый гематогенный пиелонефрит. Предлагаемый способ моделирования пиелонефрита с использованием ЛПС грамотрицательных бактерий и микрофлоры, полученной от больного этой патологией, обеспечивает воспроизведение модели, приближенной к клиническому течению заболевания у человека, дает возможность получения стойкой воспроизводимости модели для изучения патогенеза пиелонефрита и снизить затраты на его моделирование.

Изобретение относится к области медицины, найдет применение при экспериментировании патологических процессов у человека и касается моделирования пиелонефрита. Для этого лабораторному животному (белой крысе) вводят в почечную ткань липополисахарид Клебсиеллы в дозе 1,75 мкг (0,1 мл). Через 24 ч внутривенно вводят разрешающую дозу ЛПС 17,5 мкг (1,0 мл) и взвесь штамма кишечной палочки, взятого от больного пиелонефритом. Преимуществом способа является приближение модели к клиническому течению заболевания, получение стабильного воспроизведения модели, снижение затрат на создание экспериментальной модели. 3 ил.

Способ моделирования пиелонефрита, предусматривающий введение экспериментальному животному микробных клеток, отличающийся тем, что первоначально экспериментальному животному под наркозом вскрывают брюшную полость, в почечную ткань вводят липополисахарид Клебсиеллы-211 в дозе 0,1 мл (1,75 мкг), после чего ушивают рану и через 24 ч внутривенно вводят разрешающую дозу липополисахаридов в дозе 1,0 мл (17,5 мкг) и суточную взвесь кишечной палочки, взятую от больного пиелонефритом, в дозе 0,2 мл 2•10⁶ микробных тел.