СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ХРОНИЧЕСКОГО АУТОИММУННОГО МЕЗАНГИОПРОЛИФЕРАТИВНОГО ГЛОМЕРУЛОНЕФРИТА У КРЫС Российский патент 2024 года по МПК G09B23/28 

Изобретение относится к биологии и медицине, а именно к экспериментальной нефрологии и патофизиологии. Оно может быть использовано для моделирования аутоиммунного мезангиопролиферативного гломерулонефрита в эксперименте, при доклинических исследованиях различных методов лечения и профилактики данного заболевания, при изучении патоморфологических и клинических проявлений моделируемой патологии в перспективе. При воспроизведении данной модели гарантированы стабильное, клинически подтверждаемое течение заболевания за весь период наблюдения, хронизация заболевания при долгосрочном исследовании и оценки отсроченных последствий поражения почек.

Проблема хронических аутоиммунных поражений почек становится наиболее актуальной в связи с ростом общего числа системных аутоиммунных заболеваний (красная волчанка, псориаз, васкулит), иммуноподавляющих факторов (сахарный диабет, хронические бактериальные и вирусные инфекции, онкология), старением человеческой популяции [Jackson SJ, Steer AC, Campbell H. Systematic review: Estimation of global burden of nonsuppurative sequelae of upper respiratory tract infection: heumatic fever and poststreptoccocal glomeralonephritis. Trop Med Int Health. 2011;16:2-11. doi: 10.1111/j.1365-3156.2010.02670.x; Kanjanabuch T, Kittikowit W, Eiam-Ong S. An update on acute postinfectious glomeralonephritis worldwide. Nat Rev Nephrol. 2009;5:259-269. doi: 10.1038/nrneph.2009.44; Couser WG, Johnson RJ. The etiology of glomerulonephritis: roles of infection and autoimmunity. Kidney International. 2014;86:905-914. doi: 10.1038/ki.2014.49]. Проведенный анализ современных научных данных позволил сделать вывод, что не существует единого представления об этиологии и патогенезе гломерулонефрита: различные формы гломерулонефритов могут быть вызваны различными способами. Разработка новых моделей заболевания имеет высокое прикладное и теоретическое значение. Они необходимы для расширения представлений о патогенезе гломерулонефрита, разработки новых методов лечения и профилактики.

На сегодняшний день существует множество экспериментальных животных моделей для получения гломерулонефрита различной этиологии.

Наиболее близкими аналогами предлагаемой модели являются активный и пассивный нефрит Хейманна. Активный нефрит Хейманна получают иммунизацией беспородных белых крыс четырехмесячного возраста изолированными гомологичными компонентами щеточной каймы проксимальных канальцев почек на полном адъюванте Фрейнда. Пассивный нефрит Хейманна воспроизводят введением антисыворотки крови животных после иммунизации гетерологичными компонентами щеточной каймы проксимальных канальцев. Прототипом для заявленной модели послужил один из вариантов получения активного нефрита Хейманна, при котором самцам и самкам беспородной белой крысы четырехмесячного возраста вводили антигенную суспензию коркового слоя почек их материнской особи на полном адъюванте Фрейнда из расчета 100 мкл суспензии на 100 г/массы тела. Иммунизацию проводили по следующей схеме: трехкратно внутрибрюшинно на 1, 3, 5 сутки и повторно однократно в той же дозе - на 21 сутки эксперимента. Полный адъювант Фрейнда добавляли из расчета 1,0 мл адъюванта на 20 мг суспензии [патент РФ на изобретение №2373583, Коломеец Н.Ю., Косарева П.В., заявка №2008138110/14 от 24.09.2008, МПК G09B 23/28]. Контроль развития заболевания проводили качественной реакцией на белок в моче и гистологически после выведения животных из эксперимента.

Для данного способа не указаны возможность длительного наблюдения и хронизации заболевания, полное биохимическое описание течения заболевания, режим хранения приготовленной суспензии антигенов в ходе эксперимента. Значительным недостатком данной модели является использование высоких доз мертиолята (1 мг соединения на 10 мл суспензии) в качестве консерванта.

Существующие модели получения почечных патологий соединениями ртути, кадмия и урана приводят к развитию токсической гломерулопатии, а не аутоиммунного гломерулонефрита [патенты РФ на изобретение №2561295, Сивак К.В., Саватеева-Любимова Т.Н., заявка №2014126141/14 от 26.06.2014, МПК G09B 23/28; №2253153, Кокаев Р.И., Брин В.Б., заявка №2004101384/14 от 16.01.2004, МПК G09B 23/28]. Помимо этого, работа с мертиолятом требует наличия у лаборатории специального разрешения и увеличивает стоимость экспериментальной модели.

Стоит отметить, что в развитии нефрита Хейманна значительную роль играет интенсивность Т-клеточного иммунного ответа. Для крыс старше трех месяцев характерно начало инволюции тимуса, что приводит к недостаточной активации Т-клеточного иммунного ответа при моделировании патологии у четырехмесячных крыс.

Схожей моделью получения гломерулонефрита является введение катионного сывороточного альбумина, что приводит к субэпителиальному отложению иммунных комплексов в анионных участках клубочковых капилляров. Однако данная модель не может быть использована для изучения патофизиологии гломерулонефрита, так как при ней антитела против щеточной каймы не могут быть индуцированы без экзогенного антигена. Применение адоптированных лимфоцитов, полученных от беспородных белых крыс после моделирования у них острого инфекционного гломерулонефрита, также приводит к развитию состояний похожих на активный нефрит Хейманна [Юлдашев Н.М., Нишантаев М.К. Функциональное состояние почек при моделировании нефрита с помощью адоптированных лимфоцитов. Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. 2016; №6, с. 318-321]. Данную модель можно использовать на более старых крысах, так как клеточный иммунный ответ вызывается экзогенными лимфоцитами, однако она требует наличия вирулентных штаммов Escherichia coli или Streptococcus pyogenes и навыков работы с ними. При этом процесс моделирования состоит из нескольких этапов, сложен в воспроизведении и сопряжен с высокой летальностью животных на этапе получения инфекционного гломерулонефрита. Использование в ходе эксперимента беспородных белых крыс уменьшает воспроизводимость заболевания в сравнении с крысами породы Wistar.

Техническая проблема: уточнение схемы получения активного нефрита Хейманна с гарантированной патоморфологической картиной аутоиммунного

мезангиопролиферативного гломерулонефрита для долгосрочного наблюдения, приближение модели к клиническому течению хронического заболевания, снижение стоимости итоговой экспериментальной модели.

Технический результат: стабильное 100% воспроизведение аутоиммунного мезангиопролиферативного гломерулонефрита на длительный период наблюдений, уточнение методики получения активного нефрита Хейманна, при воспроизведении данной модели гарантированы стабильное, клинически подтверждаемое течение заболевания за весь период наблюдения, хронизация заболевания при долгосрочном исследовании и оценки отсроченных последствий поражения почек, снижение трудозатрат и себестоимости экспериментальной модели, получение модели гломерулонефрита для разработки новых терапевтических методов его лечения.

Заявленный технический результат обеспечивается за счет разработанного нами способа моделирования хронического аутоиммунного мезангиопролиферативного гломерулонефрита у крыс путем внутрибрюшинного введения крысе антигенной эмульсии коркового слоя почки, отличающийся тем, что введение осуществляют 2-х месячным самкам крыс породы Wistar, при этом вводят 3 мл антигенной эмульсии, состоящей из 1 мл 50% суспензии антигенов коркового слоя почки материнской особи и 2 мл полного адъюванта Фрейнда согласно схеме: однократно внутрибрюшинно на на 1,4,7 и на 21 день эксперимента.

Выбор определенных крыс, а именно, инбредных крыс породы Wistar обусловлен тем, что они лучше беспородных подходят для воспроизводства аутоиммунных заболеваний (в том числе гломерулонефрита), так как являются генетически родственными друг другу, что обеспечивает наиболее аутогенное воспроизведение заболевания, исключая вероятность токсического повреждения почек [Абрашова Т.В., Гущин Я.А. Справочник. Физиологические, биохимические, биометрические показатели нормы экспериментальных животных. СПБ.: Издательство «ЛЕМА», 2013.-116 с].

Что касается изменения схемы введения эмульсии, то оно обусловлено различным временем активации и миграции иммунекомпетентных клеток к очагу воспаления. Так, активация перитонеальных макрофагов происходит в течение первых 12 часов после начала воспалительного процесса. Макрофаги секретируют широкий спектр биологически активных веществ и влияют на другие клетки очага воспаления. Продолжительность лейкоцитарной фазы при асептическом воспалении составляет 24 часа. В это время происходит их накопление в очаге воспаления. Однако экспериментально установлено, что поздняя миграция лейкоцитов может происходить в течение 8-96 часов (1-4 сутки) после стимуляции. Максимальное накопление периферических моноцитов под воздействием лейкоцитарных хемокинов в очаге воспаления наблюдается на 2-5 сутки после альтерации, где они превращаются в макрофаги. Таким образом, введение антигенной эмульсии на 4 и 7 дни удлиняет макрофагическую и лейкоцитарную фазы воспаления, увеличивая количество клеток, презентирующих на поверхности антигены клеток щеточной каймы проксимальных каналов почек и запускающих Т-клеточную аутоиммунную реакцию [Brusini R., Varna М. Advanced nanomedicines for the treatment of inflammatory diseases. Adv Drug Deliv Rev. 2020; 157: 161-178. doi: 10.1016/j.addr.2020.07.010.].

Способ подтверждается следующими графическими материалами, отражающими патоморфологическую характеристику микроскопических срезов почек крыс:

Рис. 1. Нормальная почка интактной крысы. Окраска гематоксилином и эозином, увеличение х400. Микроскопически почки без изменений. Сосудистые клубочки почечных телец без расширения мезангия, пролиферации мезангиальных и эндотелиальных клеток. Клетки почечного эпителия проксимальных и дистальных канальцев без видимой дистрофии и деструкции.

Рис. 2. Нормальная почка интактной крысы. Окраска по Ван Гизону, увеличение х400. Толщина капсулы Шумлянского-Боумена в пределах физиологической нормы.

Рис.3. Почка крысы после получения экспериментального гломерулонефрита через 2 месяца после последней иммунизации. Окраска гематоксилином и эозином, увеличение х400. В сосудистых клубочках почечных телец заметное расширение мезангия, пролиферация мезангиальных и эндотелиальных клеток. Клетки почечного эпителия проксимальных канальцев в состоянии зернистой дистрофии с признаками апикальной деструкции. Значительное увеличение количества белковой массы внутри канальцев как следствие перенесенной микрогематурии, характерной для мезангиопролиферативного гломерулонефрита.

Рис. 4. Почка крысы после получения экспериментального гломерулонефрита через 2 месяца после последней иммунизации. Окраска гематоксилином и эозином, увеличение х200. Значительная очаговая интерстициальная инфильтрация лимфоцитов вокруг почечных клубочков подтверждает аутоиммунный характер воспалительного процесса. Картина тотального полнокровия как проявление воспалительной гиперемии. Утолщение стенки капсулы Шоумлянского-Боумена.

Рис. 5. Почка крысы после получения экспериментального гломерулонефрита через 2 месяца после последней иммунизации. Окраска по Ван Гизону, увеличение х400. Полностью сколлабированный почечный клубочек, утолщение стенки капсулы Шоумлянского-Боумена за счет склеротических изменений коллагеновых волокон, тотальное прекращение кровообращения внутри клубочка. Соседний клубочек находится в продуктивной фазе воспалительного процесса, на что указывает пролиферация клеток мезангия и сокращение площади мочевого пространства.

Рис. 6. Почка крысы после получения экспериментального гломерулонефрита через 2 месяца после последней иммунизации. Окраска гематоксилином и эозином, увеличение х400. Лимфоцитарная инфильтрация канальцев мозгового вещества почек в очаге воспаления.

Рис. 7. Почка крысы после получения экспериментального гломерулонефрита через 2 месяца после последней иммунизации. Окраска гематоксилином и эозином, увеличение х400. Очаговая белковая дистрофия почечного нефротелия дистальных канальцев мозгового вещества в следствие хронического воспаления. Образование коллагеновых цилиндров внутри канальцев как следствие перенесенной протеинурии.

Рис. 8. Почка крысы после получения экспериментального гломерулонефрита через 2 месяца после последней иммунизации. Окраска гематоксилином и эозином, увеличение х200. Массивные склеротические изменения канальцев мозгового вещества почек как следствие перенесенной острой фазы заболевания с переходом в хроническую фазу.

Рис.9. Почка крысы после введения полного адъюванта Фрейнда без суспензии почечных антигенов. Окраска гематоксилином и эозином, увеличение х200. Состояние почки соответствует возрасту крысы. Почечные клубочки и канальцы без выраженных проявлений деструктивных процессов.

Рис. 10. Почка крысы после введения полного адъюванта Фрейнда без суспензии почечных антигенов. Окраска гематоксилином и эозином, увеличение х200.

Способ осуществляют следующим образом.

На первом этапе необходимо получить самку крысы породы Wistar массой 260±10 г с потомством двухмесячного возраста. Для дальнейших манипуляций с целью наиболее гомологичной аутоиммунной реакции отбирают из потомства только самок массой 180±10 г. За 2 недели до начала эксперимента взвешивают самку с потомством 2 раза в неделю. Здоровые животные должны иметь постоянную прибавку в весе примерно 20 г в неделю. Перед началом эксперимента проводят анализ биохимических параметров крови и мочи у животных. Для крови определяют количество общего белка, альбумина, креатинина и мочевины. В моче определяли общий белок, креатинин и мочевину (НПЦ «Эко-Сервис», Россия). Полуколичественным способом в моче оценивают следующие параметры: аскорбиновую кислоту, глюкозу, гемоглобин, рН, лейкоциты, относительную плотность (тест-полоски Combi-Screen 11 SYS, «Аналитикой Биотекнолоджиз АГ», Германия). По измеряемым количественным параметрам вычисляли: отношение общий белок/креатинин, мочевина/креатинин, альбумин-глобулиновый коэффициент, количество глобулинов, скорость клубочковой фильтрации (СКФ), диурез в мл/100 г веса в час. Для мочи параметры рассчитывали после сбора полного объема суточной порции в метаболических камерах. Далее животных разделяли на 2 равные группы:

1 группа - экспериментальные животные, которым вводят адъювант вместе с антигеном

2 группа - контрольные животные, которым вводят адъювант без антигена.

На втором этапе изготавливают антигенную эмульсию для иммунизации животных. Перед началом эксперимента подготавливают следующие инструменты, материалы и реактивы: питательную среду ДМЕМ охлажденную до +5°С (60 мл), катетер внутривенный (25 G), шприц на 100 мл стерильный, хирургический инструмент стерильный, емкость для слива жидкости, нитки, весы аналитические (CAS, d=0,005 г), штатив, пробирки стерильные на 50 мл, шприцы на 1 и 5 мл, хладпакеты, спирт 70%, стерильный физиологический раствор охлажденный до +5°С (50 мл), смесь антибиотиков (пенициллин G 50000 Ед/фл + стрептомицин 50 мг/фл + гентамицин 50 мг/фл), стерильные гомогенизатор и чашки Петри, ламинарный бокс 2 класса защиты, стерильные центрифужные пробирки, центрифуга с охлаждением (SL16, Thermo Fisher Scientific, США), ультразвуковой дезинтегратор Sartorius Stedim Labsonic М (Sartorius, Германия).

Перед приготовлением суспензии материнскую особь взвешивают утром натощак и выводят летальной дозой диэтилового эфира. Далее проводят перфузирование обеих почек in situ полным объемом охлажденной ДМЕМ до получения равномерного светло-коричневого цвета коркового слоя и светло-розового - мозгового слоя. Для этого в брюшной полости перетягивают ниткой аорту выше и ниже отхождения почечных артерий, вставляют катетер и перерезают нижнюю полую вену в инфраренальной области. По мере накопления жидкость сливают из брюшной полости в подготовленную емкость.

Выделенные почки переносят в стерильную чашку Петри на хладпакете, взвешивают и оценивают линейные размеры, рассчитывают почечный индекс (в норме составляет 0,79±0,05%), описывают внешнее состояние органов. Внешне здоровые почки представляют собой бобовидные образования со слабо выраженной дольчатостью, притупленными краниальными и каудальными краями, выпуклыми латеральными и вогнутыми медиальными краями.

В ламинаре удаляют почечную капсулу, охлажденные почки разрезают саггитально, удаляют мозговой слой, полученную массу переносят в гомогенизатор и добавляют 20 мл стерильного охлажденного физраствора. Далее почки суспендируют до получения равномерного гомогената, полученную суспензию переносят в пробирку на 50 мл, остаток суспензии смывают со стенок гомогенизатора оставшимся объемом физраствора. Суспензию дополнительно измельчают в ультразвуковом дезинтеграторе Sartorius Stedim Labsonic М (амплитуда 100% - мощность 100 Вт, 0,6 секунд цикл работы УЗ, время работы 30 минут, частота - 30 кГц) при постоянном охлаждении до +5...+8°С.

Суспензию центрифугируют с охлаждением однократно в течение 10 минут, n=10000об/мин(rcf=15000). Супернатант сливают, к полученному осадку добавляют 20 мл охлажденного физраствора и 1 мл подготовленного раствора антибиотика и тщательно перемешивают.Для иммунизации животных отбирают из смеси по 1 мл и распределяют по стерильным центрифужным пробиркам индивидуально для каждой крысы. Для приготовления эмульсии антигенов необходимо суспензию гомогенизированных почек смешать до полного эмульгирования с полным адъювантом Фрейнда в соотношении 1:2 (к 1 мл почечной суспензии добавить 2 мл адъюванта). Полученная эмульсия должна быть непрозрачной, от белого до светло-коричневого цвета, не разделяться на фазы в течение 5 минут. С использованием антител подтверждено, что при данном соотношении реагентов происходит равномерное распределение антигенных комплексов из почечной суспензии на границах раздела дисперсионной среды и дисперсной фазы, что способствует пролонгированности действия [Moting L, McClements DJ. Design principles of oil-in-water emulsions with functionalized interfaces: Mixed, multilayer, and covalent complex structures. Compr Rev Food Sci Food Saf. 2020; 19(6):3159-3190. doi: 10.1111/1541 -4337.12622]. Приготовление эмульсии осуществляют непосредственно перед иммунизацией животного. Оставшуюся суспензию антигенов хранят в течение эксперимента при температуре -80°С, размораживая ее перед приготовлением эмульсии.

На третьем этапе проводят иммунизацию каждого животного по следующей схеме: трехкратно внутрибрюшинно 1 раз в сутки с интервалом между иммунизацией в 2 дня; 4 раз иммунизацию проводили на 21 день внутрибрюшинно однократно в той же дозе. Всего болезнь воспроизводят в течение 21 суток.

Степень развития заболевания оценивают согласно биохимическим показателям крови и мочи. Забор крови и мочи, анализ биохимических показателей проводят на 7, 14, 21 дни моделирования. Во время моделирования массу тела измеряют 2 раза в неделю. Длительность наблюдений за течением заболевания составляла 2 месяца после последней инъекции. По истечении срока эксперимента животных выводили летальной дозой диэтилового эфира. Обе почки изымали для проведения макро- и микроморфологического исследования. Для всех групп животных оценивали форму, линейные размеры и массу. Далее проводили окрашивание гематоксилином и эозином, по Ван Гизону. Результаты экспериментов подвергали статистической обработке с применением программ Sigma Plot и Microsoft Exel. Сравнение групп проводили при помощи критерия Манна-Уитни. Данные представлены в виде среднее значение ± стандартное отклонение (M±SD), результаты считали достоверными при уровне значимости р<0.001.

Пример.

Перед началом эксперимента крыс разделили на три равные группы:

I группа: интактные животные, с которыми не проводили никаких манипуляций (n=10).

II группа: контрольные животные, которым вводили физиологический раствор на полном адъюванте Фрейнда (n=10).

III группа: подопытные животные, которым вводили 1 мл 50% антигенной суспензии почек материнской особи на полном адъюванте Фрейнда (n=10), при этом вводили 3 мл антигенной эмульсии, состоящей из 1 мл 50% суспензии антигенов коркового слоя почки материнской особи и 2 мл полного адъюванта Фрейнда. Введение осуществляли согласно схеме: однократно внутрибрюшинно на на 1, 4, 7 и на 21 день эксперимента.

Порядок иммунизации и подготовки и хранения иммунной суспензии проводили согласно описанной схеме. Все манипуляции с животными проводили согласно требованиям РД-АПК 3.10.07.02-09 «Методические рекомендации по содержанию лабораторных животных в вивариях научно-исследовательских институтов и учебных заведений». Результаты представлены в таблицах и рисунках.

Почечные канальцы и собирательные трубочки мозгового вещества почек не содержат белковых отложений, состояние соответствует возрастной норме.

Характерные склеротические и дистрофические изменения почечных структур, пролиферация мезангия с сокращение площади мочевого пространства клубочков почек, инфильтрация лейкоцитарной массы в канальцы и клубочки, образование коллагеновых отложений и гиалиновых цилиндров, тотальное полнокровие подтверждают клинические проявления заболевания хронический аутоиммунный мезангиопролиферативный гломерулонефрит.

Изобретение относится к биологии и медицине, а именно к экспериментальной нефрологии и патофизиологии, и может быть использовано для моделирования аутоиммунного мезангиопролиферативного гломерулонефрита в эксперименте. Для этого двухмесячной самке крысы породы Wistar вводят 3 мл эмульсии, состоящей из 1 мл 50% суспензии антигенов коркового слоя почки материнской особи и 2 мл полного адъюванта Фрейнда согласно следующей схеме: однократно внутрибрюшинно на 1, 4, 7 и 21 дни эксперимента. Изобретение обеспечивает 100% воспроизведение аутоиммунного мезангиопролиферативного гломерулонефрита на длительный период наблюдений, стабильное, клинически подтверждаемое течение заболевания. 10 ил., 1 табл., 1 пр.

Способ моделирования хронического аутоиммунного мезангиопролиферативного гломерулонефрита у крыс путем внутрибрюшинного введения крысе антигенной эмульсии коркового слоя почки, отличающийся тем, что введение осуществляют 2-х месячным самкам крыс породы Wistar, при этом вводят 3 мл антигенной эмульсии, состоящей из 1 мл 50% суспензии антигенов коркового слоя почки материнской особи и 2 мл полного адъюванта Фрейнда согласно схеме: однократно внутрибрюшинно на 1, 4, 7 и на 21 день эксперимента.