СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ХРОНИЧЕСКОГО МЕМБРАНОЗНОГО ГЛОМЕРУЛОНЕФРИТА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ Российский патент 2009 года по МПК G09B23/28 

Изобретение относится к медицине, а именно к нефрологии, патологической физиологии и экспериментальной медицине и может быть использовано для изучения морфогенеза хронического гломерулонефрита и доклинического исследования эффективности новых лекарственных препаратов при данной патологии.

На сегодняшний день известно несколько моделей иммунокомплексного гломерулонефрита у экспериментальных животных, воспроизводимого путем введения экспериментальному животному суспензии коркового слоя почки, полученной от другого животного.

Наиболее близким аналогом является способ иммунизации белых беспородных крыс и крыс линии ВД-9 по ALBINI иммунотоксином (гомогенат почек здоровых крыс, полный адьювант Фрейнда и масло оливковое в пропорции 1:1:25 по массе), который вводили из расчета 1 мл на 100 г/массы тела однократно внутрибрюшинно (К.В.Сивак. Фармакологическое изучение ряда растительных нефропротекторов // Автореферат, С-Пб., 2007, 16 стр.).

Недостатками известного способа является длительность, сложность проводимого эксперимента и дороговизна исследования. Кроме этого, в способе моделирования по К.В.Сиваку предложено помимо введения гомогената почки, введение в большом количестве раздражающего агента - оливкового масла, что, возможно, обуславливает развитие не антительного гломерулонефрита, а токсической гломерулопатии. При моделировании хронического гломерулонефрита по К.В.Сиваку согласно авторским данным воспроизводимость (90%) была лишь получена у крыс линии ВД-9 по ALBINI. К тому же в этом способе не приводится морфологическое подтверждение диагноза гломерулонефрит.

Технический результат: упрощение способа моделирования хронического мембранозного гломерулонефрита, повышение воспроизводимости, удешевление методики.

Указанные задачи достигаются путем иммунизации белых беспородных крыс I поколения суспензией почечного антигена, полученного от материнской особи, с целью проведения иммунизации аутологичным антигеном по схеме: 3-кратно внутрибрюшинно 1 раз в сутки с интервалом между иммунизацией в 1 день; повторно иммунизацию проводят однократно внутрибрюшинно через 3 недели.

Способ осуществляют следующим образом.

Эксперимент выполнен на 14 животных - самцах и самках беспородных белых крыс четырехмесячного возраста, содержащихся в стандартных условиях вивария. Все эксперименты проведены в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. N 755) и «Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» от 18 марта 1986 г.

Животные были разделены на 2 экспериментальных группы по 7 животных в каждой: I группа - контрольная (интактные животные); II группа - моделирование иммунокомплексного гломерулонефрита.

I группа - контрольная (интактные животные), n=7;

II группа - животные иммунизированные антигенной суспензией коркового слоя почки, n=7.

Для получения антигенной суспезии берут самку белой беспородной крысы массой 230 г, имеющую потомство 4-месячного возраста. Животные содержатся в стандартных условиях вивария: стандартное содержание в пластиковых клетках с мелкой древесной стружкой, не более 10 особей в клетке, стандартный рацион вивария. Сразу после декапитации животного, проведенной под эфирным наркозом с соблюдением правил эвтаназии, почки перфузируют in situ стерильной охлажденной средой 199 до получения равномерного серо-коричневого цвета. После этого их отсекают от почечной ножки и переносят на стерильный лоток. Все последующие манипуляции выполняются при температуре +4°С. Отделив от капсулы, почку разрезают сагиттально, выделяют корковый слой (масса коркового слоя - 369 мг). Корковый слой суспендируют в стерильной ступке, дополнительно измельчают в ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН - 2Т в режиме 44 мГц в течение 10 минут, затем переносят суспензию в центрифужный стаканчик, добавляя охлажденный физиологический раствор до 10 мл и мертиолят 1 мг в качестве антисептика. Полученную суспензию центрифугируют на холоде 3-кратно по 3 минуты 2000 оборотов в минуту, каждый раз удаляя супернатант и доводя суспензию до 10 мл охлажденным физиологическим раствором. После этого суспензию центрифугируют при 5000 оборотов в минуту в течение 10 минут. Осадок переносят на стерильную фольгу и взвешивают на торсионных весах. Масса суспензионного осадка составила 370 мг.

Для приготовления антигена берут 200 мг осадка из расчета 1,0 мл полного адъюванта Фрейнда на 20 мг осадка. Полученную взвешенную антигенную суспензию коркового слоя почки крысы хранят при температуре 0°С +4°С.

Иммунизацию животных проводят из расчета 100 мкл суспензии на 100 г/массы тела животного по следующей схеме: 3-кратно внутрибрюшинно 1 раз в сутки с интервалом между иммунизацией в 1 день; повторно иммунизацию проводят через 3 недели внутрибрюшинно однократно в той же дозе.

Перед началом эксперимента у животных контрольной (интактной) и опытной группы проводят анализ разовой порции мочи на белок, используя качественную реакцию с 20% сульфосалициловой кислотой. Через 1 час после иммунизации и затем через 1 день проводят контрольное исследование мочи на белок.

По окончании опыта животных выводят из эксперимента путем перерезки спинного мозга под эфирным наркозом с соблюдением правил эвтаназии. Внутренние органы забирают для проведения гистологического исследования.

Результаты экспериментов подвергнуты статистической обработке с применением компьютерных программ Microsoft Excel и Biostat.

У животных контрольной группы не было выявлено лабораторных и гистологических признаков развития гломерулонефрита. В течение всего эксперимента в моче животных этой группы белок не выявлялся.

При проведении гистологического исследования в почках четко выявлялась капсула почки, корковое вещество с почечными тельцами и извитыми канальцами, мозговое вещество почки. Хорошо визуализировались сосочек и почечная лоханка, выстланная переходным эпителием. Сосудистые клубочки не были изменены, капсула не утолщена. Между почечными тельцами находились проксимальные и дистальные почечные канальцы с типичной структурой. Прямые канальцы в мозговом веществе и собирательные трубочки - без особенностей.

При проведении иммунизации у животных наблюдали выраженную протеинурию и снижение диуреза.

При проведении гистологического исследования аутопсийного материала, полученного от иммунизированных животных, в ткани почек выявлялось полнокровие сосудов коркового и мозгового слоев. В препаратах более чем в 60% клубочков отмечалась мезангиальная пролиферация и увеличение клубочков в размерах со значительным уменьшением мочевым пространством, отеком и утолщением капсулы клубочка, в ряде случаев с формированием клеточных полулуний. Также отмечалась деструкция и деформация капиллярных стенок с образованием тромбов в просветах капилляров. В части клубочков при окрашивании серебром по Футу выявляли шипики на гломерулярной базальной мембране. В интерстиции и канальцах почек наблюдался отек тканей, очаги воспаления и склероза. В проксимальных и дистальных канальцах выражена атрофия эпителия с уплощением стенок, дистрофические изменения эпителия и наличие белковых цилиндров в просветах канальцев.

Таким образом, в гистологических препаратах почек иммунизированных животных наблюдалась морфологическая картина мембранозного и мезангиально-капиллярного гломерулонефрита.

Воспроизводимость эксперимента составила 100%, у всех иммунизированных животных отмечалась гистологическая картина нефрита Хеймана.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1. Самке беспородной белой крысы (№2) массой 195,0 г внутрибрюшинно вводили антигенную суспензию коркового слоя почки материнской особи в полном адъюванте Фрейнда из расчета 100 мкл суспензии на 100 г/массы тела по следующей схеме: 3-кратно 1 раз в сутки с интервалом между иммунизацией в 1 день; повторно иммунизацию проводили через 3 недели внутрибрюшинно однократно в той же дозе.

Перед началом эксперимента, через 1 час после иммунизации и на следующий день у животного опытной группы проводили анализ разовой порции мочи на белок, используя качественную реакцию с 20%-ной сульфосалициловой кислотой.

По окончании опыта животное вывели из эксперимента путем перерезки спинного мозга под эфирным наркозом с соблюдением правил эвтаназии. Внутренние органы забрали для проведения гистологического исследования.

При исследовании в проходящем свете образцов почечной ткани, окрашенных гематоксилином и эозином, выявлено большое количество клубочков с диффузным утолщением и деформацией стенок капилляров и умеренно выраженной мезангиальной пролиферацией. При окраске нитратом серебра по Футу были видны шипики на базальной мембране. Также отмечено полнокровие сосудов коркового и мозгового слоев. В проксимальных и дистальных канальцах нефронов имелись участки белковой дистрофии и атрофии эпителия (частичная и полная), в просветах канальцев выявлялись белковые цилиндры. В интерстиции почек выявлялись очаги воспаления и склероза.

Пример 2. Самке беспородной белой крысы (№6) массой 230,0 г внутрибрюшинно вводили антигенную суспензию коркового слоя почки материнской особи в полном адъюванте Фрейнда из расчета 100 мкл суспензии на 100 г/массы тела по следующей схеме: 3-кратно 1 раз в сутки с интервалом между иммунизацией в 1 день; повторно иммунизацию проводили через 3 недели внутрибрюшинно однократно в той же дозе.

Перед началом эксперимента, через 1 час после иммунизации и на следующий день у животного опытной группы проводили анализ разовой порции мочи на белок, используя качественную реакцию с 20% сульфосалициловой кислотой.

По окончании опыта животное вывели из эксперимента путем перерезки спинного мозга под эфирным наркозом с соблюдением правил эвтаназии. Внутренние органы забрали для проведения гистологического исследования.

При исследовании в проходящем свете образцов почечной ткани, окрашенных гематоксилином и эозином, выявлено большое количество (более 70%) клубочков с диффузным утолщением и деформацией стенок капилляров и умеренно выраженной мезангиальной пролиферацией, резко уменьшенным мочевым пространством, утолщением капсулы клубочка. В ряде клубочков отмечалось формирование клеточных полулуний. При окраске нитратом серебра по Футу выявлены шипики на базальной мембране. Отмечено полнокровие сосудов коркового и мозгового слоев. В проксимальных и дистальных канальцах нефронов имелись участки белковой дистрофии и атрофии эпителия, в просветах канальцев - белковые цилиндры. В интерстициальной ткани почек выявлялись очаги воспаления и склероза.

Пример 3. Самцу белой беспородной крысы (№4) массой 250,0 г внутрибрюшинно вводили антигенную суспензию коркового слоя почки материнской особи в полном адъюванте Фрейнда из расчета 100 мкл суспензии на 100 г/массы тела по следующей схеме: 3-кратно 1 раз в сутки с интервалом между иммунизацией в 1 день; повторно иммунизацию проводили через 3 недели внутрибрюшинно однократно в той же дозе.

Перед началом эксперимента, через 1 час после иммунизации и на следующий день у животного опытной группы проводили анализ разовой порции мочи на белок, используя качественную реакцию с 20% сульфосалициловой кислотой.

По окончании опыта животное вывели из эксперимента путем перерезки спинного мозга под эфирным наркозом с соблюдением правил эвтаназии. Внутренние органы забрали для проведения гистологического исследования.

При проведении гистологического исследования аутопсийного материала, полученного от иммунизированных животных, в ткани почек более чем в 60% клубочков отмечалась мезангиальная пролиферация и увеличение клубочков в размерах со значительным уменьшением мочевым пространством, отеком и утолщением капсулы клубочка, в ряде случаев с формированием клеточных полулуний. Также отмечалась деструкция и деформация капиллярных стенок с образованием тромбов в просветах капилляров. В ряде клубочков при окраске серебром по Футу также отмечены шипики на базальной мембране. В интерстиции и канальцах почек наблюдался отек тканей, очаги воспаления и склероза. В проксимальных и дистальных канальцах находили выраженную атрофию эпителия с уплощением стенок, дистрофические изменения эпителия и наличие белковых цилиндров в просветах канальцев.

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к экспериментальной нефрологии, и может быть использовано для моделирования хронического мембранозного гломерулонефрита. Для этого беспородным белым крысам внутрибрюшинно вводят антигенную суспензию коркового слоя почки материнской особи в полном адъюванте Фрейнда из расчета 100 мкл суспензии на 100 г/массы тела по следующей схеме: 3-кратная иммунизация с интервалом в 1 день с повторной однократной иммунизацией спустя 21 день в той же дозе. Способ обеспечивает упрощение моделирования, повышение воспроизводимости, удешевление методики.

Способ моделирования хронического мембранозного гломерулонефрита в эксперименте путем внутрибрюшинного введения беспородной белой крысе антигенной суспензии коркового слоя почки, отличающийся тем, что беспородной белой крысе вводят антигенную суспензию коркового слоя почки материнской особи в полном адъюванте Фрейнда из расчета 100 мкл суспензии на 100 г/массы тела по следующей схеме: 3-кратная иммунизация с интервалом в 1 день и повторная однократная иммунизация спустя 21 день.