СПОСОБ ОЦЕНКИ ДОНОЗОЛОГИЧЕСКИХ СОСТОЯНИЙ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ АКТИВНОСТИ ФОРМ ТИРОЗИНГИДРОКСИЛАЗЫ БЕЛЫХ КЛЕТОК КРОВИ Российский патент 2000 года по МПК G01N33/68 

Изобретение относится к области медицины, в частности к способам диагностики донозологических состояний, характеризующихся недостаточной или удовлетворительной адаптацией организма к условиям внешней среды.

Донозологическая диагностика важна для оценки состояний здоровья лиц, чья профессиональная деятельность связана с длительным психоэмоциональным и физическим напряжением и прежде всего операторов летного труда (ОЛТ). Постоянное или продолжительное и чрезмерное напряжение регуляторных систем в результате воздействия на организм ОЛТ факторов летного труда может привести к истощению резервных возможностей и развитию состояний перенапряжения, а затем и к срыву адаптации. В состояниях напряжения, перенапряжения и в начальной фазе истощения регуляторных механизмов преобладают неспецифические изменения в организме, вследствие чего донозологические состояния отличаются от нозологических (патологических) состояний [1].

Известен способ ранней диагностики состояний на грани нормы и патологии, основанный на оценке состояния сердечно-сосудистой системы, как интегрального показателя здоровья и адаптации к окружающей среде [2].

Известен способ определения состояния адаптационного процесса, заключающийся в определении поглотительной способности фагоцитов периферической крови [3].

Известен способ определения утомления и переутомления у операторов летного труда по динамике содержания в периферической крови сегментоядерных нейтрофилов и лимфоцитов [4].

Известен способ определения реакции организма на воздействие стрессорных факторов по определению в сыворотке крови активности кислой фосфатазы, катепсина D, щелочной фосфатазы. При повышении активности ферментов на 20% и выше от исходного уровня определяют патологическую реакцию организма, а при повышении активности меньше чем на 20% - нормальную физиологическую реакцию организма (прототип) [5].

Известен способ диагностики адаптационных реакций организма по одновременному определению активности дегидрогеназ сукцината, лактата, малата, альфа-глицерофосфата и кислой фосфатазы в крови. Адаптационную реакцию организма диагносцируют по величине их активности (прототип) [6].

Однако при известных способах (прототипы) необходимо определять активность от трех до пяти различных ферментов, что требует дорогостоящих дефицитных реактивов и множество манипуляций для выполнения анализов. Кроме того, каждый из этих способов в отдельности не позволяет дифференцировать фазы функционального состояния: состояние функционального оптимума, устойчивой адаптации, состояние на грани срыва адаптации и деадаптации.

Предлагаемый способ предназначен для эффективного (быстрого и точного) распознавания фаз адаптационного процесса, в том числе состояния напряжения, перенапряжения адаптационных механизмов, являющегося предвестником истощения резервных возможностей организма.

Цель изобретения - повышение точности и чувствительности способов оценки функционального состояния. Цель достигается тем, что в гомогенатах белых клеток крови определяют активность тирозин-гидроксилазы (ТГ, КФ 1.14.16.2) [7] . Венозную кровь забирают в гепаринизированную пробирку, отстаивают в течение 30-60 минут и надосадочный слой - плазму с белыми клетками крови - отбирают в отдельную пробирку и замораживают. Для определения активности ТГ плазму размораживают и гомогенизируют для разрушения белых клеток крови. Центрифугируют в течение 10 минут при 800g, в центрифугате определяют активность ТГ при различных концентрациях субстрата-тирозина.

Выделены четыре формы ТГ, различающиеся кинетически и обозначенные по степени снижения их аффинитета к субстрату-тирозину как: ТГ1, ТГ2, ТГ3, ТГ4. Установлена связь отдельных форм ТГ с выраженностью состояния стресса [8, 9, 10].

Для оценки донозологических состояний предлагается определять в крови активность форм ТГ1, ТГ4 и рассчитывать К_ТГ, равный отношению ТГ4/ТГ1.

Оценку проводят по следующим критериям:
- состояние функционального оптимума - К_ТГ < 0,3;
- состояние удовлетворительной адаптации - 0,3 < К_ТГ ≤ 1,0;
- 1,0 < К_ТГ ≤ 1,5 характеризует состояние напряжения адаптационных механизмов и является предвестником истощения резервных возможностей организма;
- состояние перенапряжения адаптационных механизмов на грани срыва адаптации оценивают при 1,5 < К_ТГ ≤ 2,5.

Результаты исследований
Пример 1.

Определяли активность форм ТГ1 и ТГ4 в гомогенатах белых клеток крови и К_ТГ у крыс до и после однократного электроболевого раздражения лап, вызывающего стресс-реакцию в пределах физиологической нормы. Для этого животных помещали в клетки, через пол которых пропускали электрический ток в течение 10 минут (неизбегаемое раздражение). Кровь для исследования забирали из хвостовой вены прижизненно (см. табл. 1).

Как видно из табл. 1, в результате кратковременного электроболевого раздражения лап у всех животных возросла активность формы ТГ1 (р < 0,001) и у четырех крыс появилась активность формы ТГ4 с K_ТГ < 0,3. При тестировании животных в "Открытом поле" наблюдается повышение ориентировочно-исследовательской активности: повышение числа передвижений по полю, заглядываний в отверстия, а также числа вертикальных стоек. Эти показатели свидетельствуют об активации защитно-компенсаторных механизмов в физиологических пределах.

Пример 2.

Определяли активность ТГ1 и ТГ4 в крови у крыс, подвергавшихся многократному психоэмоциональному стрессу. Беспородных крыс массой 200-250 г помещали в индивидуальные клетки и фиксировали у основания хвоста. Животные находились в обычной ортостатической позе, но с ограничением подвижности. Угол поворота головы ограничивался 30^o. В совокупности все эти факторы вызывали у животных состояние стресса. Стрессирование животных проводили по 2 часа в течение трех дней. Перед началом воздействия (интактные животные) и в конце эксперимента (стрессированные животные) производили забор крови из хвостовой вены для определения активности ТГ, а также исследовали поведение животных в "Открытом поле норкового типа" по стандартным показателям: числу пересеченных квадратов (ЧПК); числу вертикальных стоек (ЧВС); числу обследованных отверстий (ЧОО); числу эпизодов гуминга (ЧЭГ); количеству болюсов (КБ) (см. табл. 2 и 3).

Из табл. 2 видно, что многократный психоэмоциональный стресс в отличие от действия однократного (см. табл. 1) приводил к снижению активности высокоаффинной формы ТГ1 и появлению у всех животных низкоаффинной формы ТГ4. К_ТГ у стрессированных животных составил 1,27 ± 0,13.

Поведение в "Открытом поле" у стрессированных животных отличалось от поведения этих животных до воздействия (табл. 3). Повышение ЧПК, ЧВС, ЧЭГ свидетельствовали о высоком уровне тревожности. Увеличение КБ указывало на психоэмоциональную напряженность, а уменьшение ЧОО - на снижение ориентировочно-исследовательской реакции у стрессированных животных. Таким образом, у подопытных животных наблюдалось выраженное состояние стресса.

Приведенные в табл. 2 и 3 результаты позволяют рассматривать появление в клетках крови у стрессированных животных формы ТГ4 при К_ТГ более 1,0 как коррелят выраженного стресс-состояния, состояния напряжения адаптационных механизмов.

Пример 3.

Определяли активность множественных форм ТГ в гомогенатах белых клеток крови у практически здоровых мужчин-добровольцев в состоянии "покоя". Изучали связь различных форм ТГ с биохимическими показателями, характеризующими гармональный статус, уровень ферментемии, процессы липопероксидации. Кровь для анализа забирали из локтевой вены утром натощак.

Статистическую обработку данных проводили с использованием программы "Statgrafics" версия 3,0.

Как видно из представленной таблицы, у практически здоровых мужчин в состоянии покоя (37 человек) в белых клетках крови в 100% случаев определялась активность форм ТГ1 и ТГ2. У 26 человек (70,3%) определялась форма ТГ3 и лишь у пяти человек (13,5%) - форма ТГ4. В процентном отношении активность форм ТГ1, ТГ2, ТГ3 и ТГ4 составляла соответственно 100, 74,2, 67,3 и 28,7%.

Одновременно в плазме крови определяли содержание кортизола (Корт.), инсулина (Инс.), тироксина (Т₄), циклических нуклеатидов (аденозинмонофосфат-цАМФ и гуанодинмонофосфат-цГМФ) методом радиоиммунного анализа (РИА, Швеция); в сыворотке определяли активность креатинфосфокиназы (КФК) спектрофотометрическим методом на анализаторе FP 901 с помощью наборов фирмы " Labsistems", Финляндия; в плазме крови - малоновый диальдегид (МДА), диеновые коньюгаты (ДК), общие липиды (ОЛ) с помощью наборов Биа Ла Тест" La Chemа", (Чехия); в цельной крови концентрацию аденозинтрифосфата (АТФ) микроспектрофотометрическим ферментативным методом.

Проведенный корреляционный анализ показал наличие достоверных коррелятивных связей определяемых форм ТГ в гомогенатах белых клеток крови с исследуемыми показателями. Установлено наличие достоверных коррелятивных связей ТГ1 со следующими показателями: обратные - с цАМФ, МДА, ДК в плазме крови и положительные с активностью КФК сыворотки крови и уровнем кортизола в плазме крови. У формы ТГ4 установлена достоверная положительная коррелятивная связь с концентрацией инсулина в плазме и АТФ в цельной крови, а также обратные связи с концентрацией тироксина и ДК в плазме крови.

Пример 4.

Определяли динамику активности форм ТГ1, ТГ4 в гомогенатах белых клеток крови у мужчин-добровольцев после однократной предельной физической нагрузки [11] . Испытуемые в возрасте 30-35 лет выполняли стандартную статэргометрическую нагрузочную пробу. В положении сидя нажатием ногами на статическую педаль испытуемые создавали усилие мощностью 160 кГс и удерживали педаль "до отказа" (табл. 5).

Как видно из табл. 5, у всех участников эксперимента до и после однократной предельной физической нагрузки в гомогенатах белых клеток крови активность формы ТГ4 не появлялась, но у всех испытуемых после нагрузки в 1,5-2,0 раза повышалась активность формы ТГ1. Отмеченные изменения в активности форм ТГ1 при отсутствии ТГ4 отражали состояние функционального оптимума.

Пример 5.

Определяли динамику активности ТГ клеток крови, уровня инсулина, кортизола, циклических нуклеотидов (цАМФ, цГМФ) в плазме крови, показателей гемодинамики: артериального давления (ADS, ADD), частоты сердечных сокращений (ЧСС) у практически здоровых мужчин-добровольцев, в возрасте 19-21 лет, до и после тренировочных вращений на центрифуге. Испытуемые подвергались двухкратному воздействию перегрузок в направлении голова - таз величиной 7-9 ед., продолжительностью 30 секунд с градиентом нарастания 1,0 ед./с до индивидуального предела переносимости. При воздействиях испытуемые использовали противоперегрузочный костюм (табл. 6).

В покое до вращения у всех обследуемых не выявлялась форма ТГ4. Высокая активность формы ТГ1 у всех испытуемых отражала предстартовое состояние. Показатели гемодинамики и биохимические показатели крови соответствовали состоянию функционального оптимума. Через час после вращения динамика таких показателей, как уровень артериального давления, концентрация инсулина, кортизола и циклических нуклеотидов в плазме крови указывала на развитие у испытуемых состояния стресса. Появление у испытуемых после вращения формы ТГ4 при высокой активности ТГ1 и К_ТГ 0,26-1,32 отражали различную степень адаптации к перегрузкам. Так у испытуемого Т. высокая активность форм ТГ1 и ТГ4 и К_ТГ=1,32 являются показателями перенапряжения адаптационных механизмов, что находит подтверждение и в динамике других показателей.

Пример 6.

В течение одного года проводили наблюдение за состоянием здоровья летчиков (ОЛТ) в процессе их летной деятельности. Обследование проводили перед началом рабочего дня (в обычном летном режиме) через 2-3 месяца и повторное - через 9-11 месяцев летной деятельности после выхода из отпуска. Средний возраст ОЛТ составил 28±4 лет. Оценивали состояние сердечно-сосудистой системы по частоте сердечных сокращений (ЧСС), систолическому (ADS) и диастолическому (ADD) артериальному давлению. В белых клетках крови определяли: активность ТГ1 и ТГ4; в плазме крови - активность креатинфосфокиназы (КФК), концентрацию инсулина (Инс), кортизола (Корт) и тироксина (T₄).

- Летчик 1-го класса П., 39 лет, обследован дважды через 3 и 9 месяцев после возвращения из отпуска. Налет на день обследования составил соответственно 19 и 57 часов. В анамнезе посттравматическая деформация 8-9 грудных позвонков. Жалоб в дни обследования не предъявлял, за медицинской помощью не обращался. При первом обследовании активность ТГ1 была 43,0, ТГ4 - 0, К_ТГ = 0. Артериальное давление составляло 110/80, активность КФК в плазме крови - 5,02 нмоль/л, концентрация Т₄ - 101,48 нмоль/л, кортизола - 1358,22 нМ и инсулина - 13,32 МЕД/л. Исследованные показатели соответствовали состоянию функционального оптимума. При повторном обследовании, через 9 месяцев после отпуска, активность ТГ1 составляла 37,4, ТГ4 - 46,8 и К_ТГ был равен 1,25, что оценивалось как напряжение адаптационных механизмов. Величина АД составляла 120/80. Снижение активности КФК на 64% по сравнению с первоначальными величинами, концентрации Т₄ на 22,8%, кортизола - на 39,5% и повышение уровня инсулина в крови на 14% указывали на развитие утомляемости.

- Летчик 1-го класса Б., 27 лет, обследован через 3 и 11 месяцев после отпуска. Налет на дни обследования составил 13,3 и 36,6 часов соответственно. Жалоб не предъявлял, за медицинской помощью не обращался. Диагноз - здоров. Через 4 месяца летной деятельности активность формы ТГ1 в белых клетках крови составляла 67,0 нмоль/мин, ТГ4 - 0, К_ТГ - 0. Уровень артериального давления 110/70 мм рт.ст., активность КФК - 1,36 нмоль/л, концентрация Т₄ -74,98 нмоль/л, кортизола - 1508,43 нМ и инсулина 6,10 МЕД/л в крови соответствовали состоянию функционального оптимума. При повторном обследовании через 11 месяцев после отпуска активность ТГ1 составляла 124,7, ТГ4 - 112,9, К_ТГ - 0,90, что указывало на напряжение адаптационных механизмов. Об этом же свидетельствовала и динамика других показателей: повышение АД - 140/70, повышение уровня инсулина в крови на 47,8%, снижение активности КФК на 29%, концентрации Т₄ на 27% и кортизола на 81,3%.

Обследования показали, что в период 2-3 месяцев после отпуска у обследованных ОЛТ в клетках крови форма ТГ4 не определялась. Через 9-11 месяцев напряженного летного труда у ОЛТ появилась форма ТГ4. Коэффициент К_ТГ составлял от 0,9 до 1,25. В плазме крови повышался уровень инсулина, снижался уровень активности КФК, концентрация кортизола, уровень тироксина (Т₄) и повышалось артериальное давление.

Отмеченные изменения исследуемых показателей на границе пределов физиологической нормы для данного контингента и К_ТГ до 1 указывают на состояние удовлетворительной адаптации, а К_ТГ 1,25 у П. - на напряжение адаптационных механизмов и развитие утомляемости.

Исследования показали, что с увеличением интервала времени от момента выхода из отпуска у ОЛТ имеют место увеличение функционального напряжения сердечно-сосудистой системы, напряжение адаптационных механизмов, что может быть выявлено по возрастанию К_ТГ больше 1.

Пример 7.

Обследовали группу спортсменов в межтренировочный период перед и после стандартной велоэргометрической нагрузки (СВН).

- Спортсмен Р., 21 год, мастер спорта. До и после СВН К_ТГ составлял 0,42 и 2,76 соответственно. Одновременно были изучены функциональные пробы сердечно-сосудистой системы (ССС): пульс и АД. До тренировки эти показатели составляли: пульс - 72 уд/мин, АД - 115/75 мм рт.ст. После нагрузки: пульс - 104 уд/мин, АД - 120/80 мм рт.ст. Возвращение пульса к исходным величинам происходило через 5 минут. Таким образом, функциональные пробы ССС указывали на недостаточность тренированности спортсмена, а К_ТГ, равное 2,76, - на перенапряжение адаптационных механизмов.

- Спортсмен М., 22 года, мастер спорта. До и после СВН К_ТГ составлял 0 и 0,73 соответственно. Показатели функциональных проб ССС до нагрузки составляли: пульс - 64 уд/мин, АД - 120/80 мм рт.ст. После нагрузки пульс - 89 уд/мин, АД - 120/80 мм рт.ст. Частота пульса возвращалась к исходным величинам через 3 минуты. Функциональные пробы подтвердили хорошую тренированность спортсмена, а К_ТГ 0,73 - устойчивую адаптацию к физическим нагрузкам.

Способ может быть использован в медицине, а именно для нозологической диагностики. В белых клетках крови определяют активность форм тирозингидроксилазы (ТГ1 и ТГ4), рассчитывают соотношение К_ТГ, равное соотношению ТГ4/ТГ1, и при К_ТГ от 0 до 0,3 определяют состояние функционального оптимума, при К_ТГ, большем 0,3 и меньшем или равном 1,0, - состояние удовлетворительной адаптации, при К_ТГ, большем 1,0 и меньшем или равном 1,5, - состояние напряжения адаптационных механизмов, при К_ТГ, большем 1,5 и меньшем или равном 2,5, - состояние перенапряжения адаптационных механизмов на грани срыва адаптации. Способ повышает точность и чувствительность оценки состояния адаптационных механизмов. 6 табл.

Способ определения состояния адаптационных механизмов путем исследования венозной крови, отличающийся тем, что в белых клетках крови определяют активность форм тирозингидроксилаз (ТГ1 и ТГ4), рассчитывают соотношение К_ТГ, равное соотношению ТГ4/ТГ1, и при К_ТГ от 0 до 0,3 определяют состояние функционального оптимума, при К_ТГ большем 0,3 и меньшем или равном 1,0 - состояние удовлетворительной адаптации, при К_ТГ большем 1,0 и меньшем или равном 1,5 - состояние напряжения адаптационных механизмов и при К_ТГ большем 1,5 и меньшем или равном 2,5 - состояние перенапряжения адаптационных механизмов на грани срыва адаптации.