Способ определения реакции организма на воздействие стрессорных факторов Советский патент 1987 года по МПК G01N33/48 

го

15

20

25

11293657

Изобретение относится к медицине и может быть использовано дан оценки степени воздействия на организм факторов внешней среды, например, для отбора.лиц,пригодных к работе в экстремальных условиях, для определение предельно допустимой тренировочной нагрузки у спортсменов.

Цель изобретения - повышение точности способа.

Цель достигается тем, что в сыво- ротке крови наряду с активностью кислой фосфатазы определяют активность катепсина Д и щелочной фосфатазы.

Способ осуществляется следующим образом.

Из 2-3 мл венозной крови стандартным методом готовится сыворотка, в которой проводят определение активности кислой фосфатазы, катепсина Д и щелочной фосфатазы. Активность указанных ферментов можно определять с помощью мик-рометодов, Б этом случае кровь можно взять из пальца с помощью скарификатора.

Предлагаемый способ испытан в эксперименте на 50 крысах.В качестве стрес- сорного фактора применяли физическую нагрузку разной интенсивности и длительности. По степени нарастания мы- шечного напряжения применяемые нагрузки распределялись следующим образом: 1 - умеренная однократная нагрузка - плавание в течение 3,5 ч без груза)2 - интенсивная однократная нагрузка до утомления - плавание 3,5 ч с грузом, составляющим 4% от массы тела; 3 - хроническая нагрузка умеренной интенсивности - плавание без груза по 1 ч ежедневно в течение 10 дней; 4 - мьшечная работы в истощающем режиме - плавание 3,5 ч с грузом после 10-дневной нагрузки по ч также с грузом. Контролем служили ин- тактные животные.

В сыворотке крови биохимическими методами определяли активность маркерных ферментов лизосом (кислой фосфатазы, катепсина Д) и щеЬочной фос- гл фатазы.. Параллельно активность указанных ферментов определяли в тканях печени, сердечной и скелетных мьпиц.

При всех вариантах стресса в исследуемых тканях животных наблюдается активация лизосомального аппарата леток, выражающаяся в лабилизации изосомных мембран, повыщении активости лизосомных ферментов, усилении

35

40

45

55

ау ус ци но с га но не со

ло но ке мы та

ке ду по ны пр щел ву ных

акт на теп

пре и п жи)з кар ден рез ток спр нии что ден шеч рил етс пос кле дов шеч ги, 20видуси и о в п так ном пар нар

го

15

0

5

л

5

0

5

5

аутофагоцитоза, снижения осмотической устойчивости лизосом. Степень активации лизосом коррелирует с интенсивностью, длительностью воздействия и с тяжестью состояния напряжения организма. Эти изменения до определенного момента остаются обратимыми и не сопровождаются повреждением лизосом.

В сыворотке крови активность кислой фосфатазы, катепсина Д и щелочной фосфатазы при физической нагрузке умеренной интенсивности (режим мышечной работы 1, 2 и 3) как и у ин- тактных животных минимальна.

При истощающей физической нагрузке (режим 4 мышечной работы) в исследуемых тканях появляются признаки повреждения лизосом и выхода лизосомных ферментов в цитоплазму. Б тканях при этом увеличивается активность и щелочной фосфатазы,.что свидетельствует о повышении проницаемости наружных клеточных мембран.

В сыворотке крови увеличивается активность кислой фосфатазы (на 70%),. на 30-50% возрастает активность катепсина Д и щелочной фосфатазы.

При микроскопическом исследовании препаратов из сердца, скелетных мьстц и печени этой группы животных обнару- жи)заются следующие изменения. В миокарде возникают мелкоочаговые повреждения . кардиомиоцитов . Часть из них резко эозинофильна при окраске гема-- токсилин-зозином, другая - плохо воспринимает красители.-Лри исследовании в поляризованном свете выявлено, что эти изменения связаны с повреждением сократительного аппарата мы- шечных клеток; контрактурой миофиб- рилл или их лизосом. Чаще обнаруживается контрактурньй тип повреждения с последующим коагуляционным некрозом клеток. При микроскопическом исследовании скелетных мышц по длине мы-. шечного волокна нередко находят очаги, имеющие небольшую протяженность- 2030 саркомеров, гомогенные, БОСКО- видные, почти не структурированные, усиленно связывающие как кислые,так и основные красители. Обнаруживаемая в поляризованном свете анизотропия таких участков говорит о контрактур- ном повреждении сократительного аппарата мышечных волокон. В печени обнаруживаются гиперемия и отек стро3 , 1

мы, дистрофические изменения гепато- цитов и некроз отдельных клеток.

Таким образом, повьшение активности лизосомных ферментов и щелочной фосфатазы в сыворотке крови отражает начало цитолиза и появление микронекротических очагов в тканях. На этой стадии изменения еще носят об- ратимьй характер, и состояние ультраструктур в сердце, скелетных мьпп- цах и печени полностью восстанавливается в случае прекращения нагрузки

Продолжение нагрузки в истощающем режиме ведет к изъязвлению кожи туловища и хвоста, животные слабеют и погибают. При вскрытии во внутренних органах обнаруживаются множественные кровоизлияния, крупные некротические очаги в печени, поджелудочной железе, почках, миокарде.

Таким образом, наиболее ранними, доклиническими признаками развивающейся стрессорной патологии являются нарущение целостности лизосомных мембран и увеличение активности лизосомных ферментов и щелочной фосфатазы в сыворотке крови. Независимо от того, из какого органа, «ткани, клеток происходят лизосомные ферменты, попадающие в кровь, повышение их активности в сыворотке крови может служить критерием оценки реакции орга - низма при действии стрессорных факторов.

Пример 1. Спортсмен О, 1-й разряд по биатлону, обладает средним уровнем тренированности. Обследован в конце восстановительного периода (состояние относительного функционального покоя) и в период интенсивных тренировочных нагрузок при подготовке к соревнованиям.

Берут по 1,5 МП крови из пальца с помощью скарификатора, стандартным методом готовят сыворотку и определяют в ней активность кислой фосфатазы, катепсина Д и щелочной фосфатазы.Для Определения активности кислой фосфатазы 0,1 мл сыворотки инкубируют при 37°С в течение часа с 0,5 мл 1,35%-ного раствора |Э -глицерофосфата в 0,2М ацетатном буфере, рН 5,0. Реакцию останавливают добавлением 1,2 мл 10%-ной трихлоруксусной к-ис- лоты. После.центрифугирования при 3000 об/мин в течение 10 мин из над- осадочной жидкости берут пробу для определения концентрации неорганичес936574

кого фосфора. Активность кислой фосфатазы выражают в микромолях Р.,, отЧ

щепленного за мин, на 1 л сыворотки. Активность катепсина Д определяют,

5 инкубируя в течение часа при 37°С 0,1 МП сыворотки .с 0,5 мл 2%-ного раствора гемоглобина. Реакцию оста навливают добавлением 3 мл 3%-ного раствора трихлоруксусной кислоты. По еле центрифугирования в надосадочной жидкости определяют концентрацию кис- лоторастворимых аминокислот и пептидов с помощью спектрофотометрирова- ; ния при длине волны 280 нм. Актив 5 ность катепсина Д выражают в микромолях тирозина, отщепленного за 1 мин на 1 л сыворотки. Активность щелочной фосфатазы. определяют, инкубируя в течение часа при 37 С О,1 мп сыво20 ротки с 1,0 мл 0,165%-ного раствора 4-нитрофенолфосфата натрия в 0,1 М глициновом буфере, рН 10,5. Реакцию останавливают добавлением 10 мпО,2н раствора NaOH, спектрофотометрируют при длине волны 420 нм. Активность щелочной фосфатазы выражают в микро- 4-нитрофенола, отщепленного за 1 мин, на 1 л сыворотки.

Б состоянии относительного покоя

7Л

активность кислой фосфатазы, катепсина Д и щелочной фосфатазы составляла соответственно 21,7; 10,,4. В предсоревновательном периоде активность указанных ферментов достоверно 35 не изменялась и составляла соответственно 20,9; 1,7; 101,3. Электрокардиографическое исследование выявило неполное восстановление сердечной деятельности, что говорит о недостаточ- ном уровне тренированности. Физическая работоспособность удовлетворительная. Таким образом, данные биохимического обследования свидетельствуют о неполном использовании потен- циалъных возможностей организма. Рекомендуется оптимизация тренировочного процесса с равномерны увеличением нагрузок, адекватных функциональным возможностям организма.

50 I

П р и м е р 2. Спортсмен В., кандидат в мастера по биатлону. Характеризуется, высокой степенью тренированности. Прошел психокардиобиохнмиге ческое тестирование в конце восстановительного периода (состояние относительного функционального покоя) и при интесивных физических нагрузках в предсоревновательный период.

5

Берут 1,5 мл крови из пальца с помощью скарификатора, стандартным методом готовят сыворотку, в которой проводят определение активности кислой фосфатазы, катепсина Д и щелочной фосфатазы с помощью микрометодов .

В состоянии относительного функционального покоя активность кислой фосфатазы, катепсина Д и щелочной фосфатазы соответственно составляла 23,3; 7,2; 104,0 (активность ферментов выражена в микромолях субстрата, расщепленного за 1 мин, на 1 л сыворотки крови). В предсоревновательном периоде активность кислой фосфатазы, катепсина Д и щелочной фосфатазы у спортсмена возрастали на 24, 41 и 27% соответственно, что служит основанием для заключения о неадекватности нагрузки функциональным возможностям смортсмена. В этот период с помощью ЭКГ обнаружены признаки снижения сократительной способности миокарда с явлениями гипоксии левого желудочка, Физическая работоспособность не снижена. Таким образом, .результаты биохимического контроля указывают на то, что несмотря на сохранениб физической работоспособности спортсмена, его организм функционально перенапряжен и находится в критическом состоянии, переходном от физиологической реакции на нагрузку к патологическим нарушениям. Рекомендуется снизить объем физических нагрузок оптимизировать тренировочный режим. Возможна фармакологическая коррекция путем введения кардиотонических и се дативных средств.

П р и м е р 3. Предлагаемь м способом протестированы 20 чел., здоровые мужчины в возрасте от 19 до 40 лет, участники экспедиции, состоявшейся в условиях зимнего Заполярья. Перед выходом в 200-километровый, двадцатидневный лыжньш поход все участники прошли комплексное медицинское обследование, по данным которого все 20 Человек признаны практически здоровыми. Помимо обычного врачебного обследования бьши проведены также две нагрузки степ-тестом. Последние заключались в подъеме на ступеньку высотой 23 см в течение 5 мин с частотой 30 подъемов 1 мин. Первая нагрузка производилась при температуре окружающего воздуха 26 С, вторая936576

при . В состоянии физиологического покоя и сразу после нагрузки из пальца брали с помощью скарификатора 1,5 мл крови, стандартным методом го- 5 товили сыворотку, в которой определяли активность кислой фосфатазы и катепсина Д, используя микрометоды. Таким образом, у всех обследуемых были получены по четыре значения активности каждого из указанных ферментов. В табл.1 показана активность кислой фосфатазы и катепсина Д в сыаороя ке крови у участников экспедиции (Mt га).

0

15

0

Как видно из табл.1, у группы в целом достоверных изменений активности кислой фосфатазы и катепсина Д при нагрузочных тестах не было. Однако у одного из членов экспедиции (и., 19 лет) эти данные были другими.

В табл.2 приведена активность кислой фосфатазы и катепсина Д у одного из участников экспедиции.

0

0

5

0

5

Этот участник очень болезненно переносил трудности похода, уже с 3-го дня начал предъявлять жалобы на плохое общее самочувствие, мьппечнуго слабость, головные боли, боли в подложечной области и в правом подреберье. На 10-й день бьш снят с маршрута и с ди агнозом язвенная болезнь желудка от- ; правлен вертолетом в госпиталь. Ta-t i c КИМ образом, результаты исследозанкя лизосомных ферментов в сыворотке крови в данном случае показали резкое ее повьштение в ответ на нагрузку степ- тестом как при температуре комфорта, так и при холодовом воздействии. Эти данные должны были послужить основанием для остранения И. от участия в походе, что позволило бы предупредить его заболевание.

Повьш1ение активности кислой фосфатазы, .катепсина Д и щелочной фасфа- тазы на 20% и более по сравнению с исходным уровнем означает, что организм находится в критическом переходном состоянии между физиологическими и патологическими реакциями, и служит основанием дпя принятия мер профилактики, предупреждающих развитие стрессорной патологии.

Предлагаемый способ обеспечивает высокую достоверность, точность к чувствительность и позволяет своевременно решать вопросы защитных, профилактических или лечебных мероприятий. Способ может быть применено для регуляции тренировочного режима спортсменов, летчиков, космонавтов, для разработки оптимального режима труда и отдыха операторов диспетчерских слуткб, для профотбора лиц, прИ для профессиональной деятельности в экстремальных условиях. Кроме того, способ может быть использован в экспериментальной медицине и биологии при исследовании механизмов стресса для определения фазы перехода положительного адаптивного эффекта стрессорных воздействий в повреждающий .

Кислая фосфатаза75,318,4 76,0±9,2

КатепсинД 25,5±3,7 24,213,2

Кислая

Составитель А.Рыбина Редактор В.Ковтун Техред А.Кравчук Корректор Г.Решетник

Заказ 381/50 Тираж 777 | Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

производственно-полиграфическое предприятие,г.Ужгород,ул.Проектная,4

2936578

Формула изобретения Способ определения реакции организма на воздействие стрессорных факторов путем определения активности . 5 кислой фосфатазы в крови до и после их воздействия, отличающий- с я тем, что, с целью повьшения точности способа, в сыворотке крови наряду с активностью кислой фосфатазы определяют активность катепсина Д и щелочной фосфатазы и при повышении активности ферментов на 20% и вьппе от исходного уровня определяют патот логическую реакцию организма, а при повышении активности, меньше чем на 20% - нормальную реакцию организма..

Таблица 1

fO

15

76,7±9,085,3±11,0

23,41:1,823,0±2,0

Таблица2

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для оценки степени воздействия на организм факторов внешней среды, например для отбора лиц, пригодных к работе в экстремальных условиях, для определения предельно допустимой тренировочной нагрузки у спортсменов. - Цель изобретения - повьппение точности способа. Обследование проводят в период относительного функционального покоя и в период интенсивных тренировочных нагрузок. В сыворотке крови определяют активность кислой фосфата- зы, катепсина Д и щелочной фосфатазы. Затем сравнивают эти результаты с исходными данными. При повышении активности ферментов на 20% и выше от исходного уровня определяю- патологическую реакцию организма, а при по- вышении активности меньше, чем на 20% - Нормальную реакцию организма. 2 табл. (Л СО о ел sj