КОМПЛЕКС АНАЛОГА ИНСУЛИНА И ПРОТАМИНА, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ДИАБЕТА Российский патент 2000 года по МПК A61K38/28 C07K14/62 

Изобретение относится к мономерным аналогам человеческого инсулина. В частности, настоящее изобретение относится к различным парентеральным композициям, которые включают аналог мономерного инсулина, цинк, протамин и фенольное производное. Композиции обеспечивают пролонгирующее действие. Также описывается способ получения композиций инсулиновый аналог-протамин.

Со времени введения инсулина в 20-х годах XX в. непрерывно предпринимаются шаги для улучшения лечения сахарного диабета. Основные успехи достигнуты в чистоте инсулина и его доступности в связи с разработкой технологии с использованием рекомбинантной ДНК. Разработаны различные композиции с различными временами действия. В настоящее время, вообще говоря, существуют семь коммерчески доступных инсулиновых композиций: регулярный инсулин, инсулин семиленте, глобин инсулин, изофан инсулин, суспензия цинк инсулина, протамин-цинк-инсулин, инсулин ультраленте.

Несмотря на множество пригодных композиций, при лечении с помощью подкожных инъекций пациент все еще нуждается в удобном регулировании и нормализованном гликемическом контроле. Частые переходы от нормальных гликемических уровней на протяжения жизни пациентов ведут к гипер- или гипогликемии и отдаленным осложнениям, включая ретинопатию, нейропатию, нефропатию, и микро- и макроангиопатию.

Чтобы помочь избежать экстремальных гликемических уровней, диабетики часто практикуют терапию с помощью многократных инъекций посредством введения инсулина перед каждым приемом пищи. Однако эта терапия все же неоптимальна. Коммерчески доступный самый быстродействующий инсулин дает пик слишком поздно после инъекции, и его действие продолжается слишком долго до оптимальных уровней глюкозы. Поэтому значительные усилия направлены на создание инсулиновых композиций и композиций инсулинового аналога, которые изменяют кинетику процесса подкожной абсорбции.

Поскольку все коммерческие фармацевтические композиции инсулина содержат инсулин в самоассоциированном состоянии и преимущественно в гексамерной форме, полагают, что стадия, лимитирующая скорость абсорбции инсулина из депо при подкожной инъекции в кровоток, представляет собой диссоциацию самоагрегированного гексамера инсулина. Недавно разработаны мономерные инсулиновые аналоги, которые менее склонны к ассоциации с образованием форм с более высокой молекулярной массой, чем человеческий инсулин. Эта потеря самоассоциации обусловлена модификациями аминокислотной последовательности человеческого инсулина, которые уменьшают ассоциацию с помощью главным образом, разрушения образования димеров (cм., например, Brems et al., Protein Engineering 5: 6, 527-533 (1992) и Brange et al., Nature, 333:679-682 (1988)). В соответствии с этим мономерные инсулиновые аналоги обладают относительно более быстрым началом активности при сохранении биологической активности природного человеческого инсулина. Эти инсулиновые аналоги обеспечивают быструю абсорбцию, устанавливая время инъекции и пик действия инсулина в большей близости к возникающему после приема пищи изменению уровня глюкозы, связанному с ответом на прием пищи.

Физические свойства и характеристики мономерных аналогов не аналогичны инсулину. Например, Brems et al. раскрывает, что различные мономерные аналоги имеют небольшую или не имеют вообще склонность к ассоциации, вызываемую Zn. Любая ассоциация, которая наблюдается, представляет собой множество образований с более высокой молекулярной массой. Это сильно отличается от инсулина, который находится почти в исключительно упорядоченной гексамерной конформации в присутствии цинка. Brange et al., Diabetes 13:923-954 (1990) быстродействующие характеристики аналогов приписывают отсутствию ассоциации. Поскольку аналоги имеют меньшую тенденцию ассоциировать, то совсем удивительно, что мономерный инсулиновый аналог может быть приготовлен таким образом, чтобы обеспечить среднюю продолжительность действия.

Настоящее изобретение предлагает композицию, содержащую мономерный инсулиновый аналог, которая обладает при использовании средней продолжительностью действия. Кроме того, изобретение обеспечивает новый протаминовый кристалл, называемый инсулиновым NPD-аналогом. Настоящее изобретение также обеспечивает смесь инсулинового NPD-аналога и растворимого мономерного инсулинового аналога. Эта смесь обеспечивает быстрое начало действия и промежуточную продолжительность действия. В соответствии с этим смесь обладает преимуществами как перед инсулином, так и перед мономерным аналогом. Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает способ получения однородных кристаллов инсулинового аналога-NPD.

Это изобретение предлагает композицию, содержащую систему инсулиновый аналог-протамин, которая включает мономерный инсулиновый аналог, протамин, цинк и фенольное производное.

Кроме того, изобретение обеспечивает комплекс из кристаллического инсулинового аналога и протамина. Этот комплекс определяют как инсулиновый аналог-NRD. Lys^B28Pro^B29-человеческий инсулин-NRD включает Lys^B28Pro^B29-человеческий инсулин, 0,27-0,32 мг протамина/100 Единиц инсулинового аналога, 0,35-0,9% цинка по весу и фенольное производное.

Это изобретение, кроме того, обеспечивает способ получения комплекса Lys^B28Pro^B29-человеческий инсулин-NRD, который включает:
смешение водного раствора Lys^B28Pro^B29-человеческого инсулина в гексамерном ассоциированном состоянии и раствора протамина при температуре от около 8 до около 22^oC;
указанный водный раствор включает от 0,35 до 0,9% цинка по весу, Lys^B28Pro^B29-человеческий инсулин и фенольное производное при pH от около 7,1 до около 7,6;
указанный раствор протамина включает протамин при pH от 7,1 до 7,6, такой что финальная концентрация протамина составляет около 0,27 до около 0,32 мг протамина/100 E инсулинового аналога.

Изобретение также обеспечивает композиции, обладающие как быстрым, так и средним действием. Композиции представляют собой смеси мономерного инсулинового аналога и кристаллического инсулинового аналога-NRD, в которых весовое отношение двух компонентов составляет около 1-99:99-1.

Наконец, изобретение обеспечивает способ лечения пациента, страдающего сахарным диабетом, который включает введение указанному пациенту фармацевтической композиции, содержащей кристаллы комплекса инсулиновый аналог-протамин.

Фиг. 1 представляет собой графическое изображение профиля действия Lys^B28Pro^B29-hI-NPD и человеческого инсулина-NPH. График представляет собой зависимость мкEд/мл от времени вливания. Фиг. 1 демонстрирует преимущества настоящего изобретения.

Фиг. 2 представляет собой изображение кристаллов Asp^B28-человеческий инсулин-протамин настоящего изобретения. Изображение приводится при 1000х увеличении c дифференциальным фазовым контрастом.

Фиг. 3 представляет собой изображение кристаллов Lys^B28Pro^B29-hI-протамин настоящего изобретения. Изображение приводится при 1000х увеличении с дифференциальным фазовым контрастом.

Как отмечалось выше, изобретение обеспечивает различные композиции мономерного инсулинового аналога. Используемый здесь термин "мономерный инсулиновый аналог" или "инсулиновый аналог" означает быстродействующий инсулиновый аналог, который менее склонен к димеризации или самоассоциации. Мономерный инсулиновый аналог представляет собой человеческий инсулин, в котором Pro в положении B28 замещен на Asp, Lys, Leu, Val или Ala и Lys в положении B29 есть лизин или пролин; des (B28-B30); или des (B27). Мономерные инсулиновые аналоги описаны Chance et al., EPO рublication 383472 и Brange et al., EPO publication 214826, на которые здесь ссылаются.

Специалисту в данной области должно быть известно, что возможны другие модификации для мономерного инсулинового аналога. Эти модификации широко известны в данной области и включают замещение гистидинового остатка в положении B10 на аспарагиновую кислоту; замещение остатка фенилаланина в положении B1 на аспарагиновую кислоту; замещение остатка треонина в положении B30 на аланин; замещение остатка серина в положении B9 на аспарагиновую кислоту; утрату аминокислот только в положении B1 или в комбинации с потерей в положении B2; и потерю треонина в положении B30.

Используемые в этом описании аббревиатуры всех аминокислот являются аббревиатурами, принятыми United States Patent & Trademark Office как указано в 37 CFR, параграф 1.822(b) (2). Особенно предпочтительными мономерными инсулиновыми аналогами являются Lys^B28Pro^B29-человеческий инсулин (B28 есть Lys; B29 есть Pro) и Asp^B28-человеческий инсулин (B28 есть Asp).

Термин "мономерный инсулиновый аналог-NPD" или "инсулиновый аналог-NРD" означает суспензию кристаллического инсулинового аналога и протамина в композиции. NPD представляет собой композицию протамина согласно De Felippis. Композицию получают в соответствии с заявляемым способом, описанным здесь. Родственный термин "кристаллы инсулинового аналога-NPD", "кристаллический инсулиновый аналог-NPD" или кристаллы Lys^B28Pro²⁹-человеческий инсулин-протамин относится к кристаллам инсулиновый аналог-протамин в NPD композиции.

Используемый здесь термин "лечение" описывает оказание помощи и уход за пациентом с целью борьбы с болезнью, состоянием или расстройством и включает введение соединения настоящего изобретения с целью предотвратить начало наступления заболевания или осложнений, облегчения симптомов или осложнений, или ликвидации заболевания, состояния или нарушения.

Термин "изотонический агент" относится к агенту, который является физиологически толерантным и который придает подходящий тонус композиции, чтобы предотвратить сеточный поток воды через клеточную мембрану. Соединения, такие как глицерин, обычно используют для таких целей в известных концентрациях. Концентрация изотонического агента лежит в диапазоне, известном в области применения для композиций инсулина.

Термин "фенольное производное" обозначает м-крезол, фенол или предпочтительно смесь м-крезола и фенола.

Термин "в расчете на свободное основание" указывает на количество протамина в композиции. Расчет на свободное основание корректирует содержание воды и содержание солей протамина, коммерчески приемлемых и обычно используемых в парентеральных композициях. Предпочтительный протамин, сульфат протамина, составляет приблизительно 80% протамина.

Термин "IU" или "U" означает международную единицу.

Термин "изофановое отношение" означает равновесное количество протамина, необходимое для комплексования с аналогом инсулина, установленное Krayenbuhl и Rosenberg, Stent Memorial Hospital Report (Copenhagen), 1:60 (1946). Изофановое отношение определяют путем титрования по способу, хорошо известному в данной области техники и описанному Krayenbbuhl, et el.

Настоящее изобретение обеспечивает композицию инсулиновый аналог-протамин, которая включает мономерный инсулиновый аналог, протамин, цинк, и фенольное производное. Концентрация протамина составляет предпочтительно от 0,2 до 1,5 мг протамина на 100 Единиц инсулинового аналога в расчете на свободное основание. Наиболее предпочтительно, чтобы диапазон протамина составлял от 0,27 до 0,35 мг/100 Единиц. Концентрация цинка составляет от 0,35 до 0,9% по весу. Предпочтительно концентрация цинка составляет около 0,7%.

Фенольное производное представляет собой м-крезол, фенол или смесь м-крезола и фенола. Предпочтительными фенольными производными является м-крезол и фенол. Концентрация фенольного производного известна специалисту в данной области. Концентрации должны быть достаточными для того, чтобы сохранять эффективность консервации, т.е. затормозить микробный рост. Вообще концентрация фенольного производного, например, находится в диапазоне от 1,0 до 6,0 мг/мл; предпочтительно выше, чем около 2,5 мг/мл. Наиболее предпочтительна концентрация около 3 мг/мл. Присутствие фенольного производного является существенным, поскольку оно воздействует на комплексообразование аналога, протамина и цинка помимо функционирования в качестве консерванта. Однако полагают, что в кристаллической структуре на молекулу инсулинового аналога приходится только одна молекула фенола.

Предпочтительно изотонический агент добавляют к композиции. Предпочтительным изотоническим агентом является глицерин. Концентрация изотонического агента составляет, например, от 14 до 18 мг/мл, предпочтительно около 18 мг/мл.

pH композиции может быть установлена с помощью физиологически толерантного буфера, предпочтительно фосфатного буфера, такого как двуосновный фосфат натрия. К другим физиологически толерантным буферам относятся TRIS, ацетат натрия, или цитрат натрия. Выбор буфера и концентрация буфера известны в данной области. Обычно концентрация составляет, например, от около до около 5,0 мг/мл, предпочтительно 3,8 мг/мл.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает специфические условия, при которых инсулиновый аналог-протамин существует в виде стабильного кристалла. Композиции этих кристаллов определяют как инсулиновый аналог-NPD. Инсулиновый аналог-NPD представляет собой сформулированную суспензию кристаллов инсулиновый аналог-NPD, и он при использовании проявляет промежуточное действие. Профиль активности инсулинового аналога-NPD достаточно неожидан с точки зрения отсутствия самоаcсоциации мономерного аналога.

Способность композиции с мономерным аналогом проявлять промежуточное действие демонстрируется на фиг. 1. Фиг. 1 иллюстрирует профиль действия для Lys^B28 Pro^B29-hI-NPD и человеческого инсулина-NPH. NPD профиль подобен профилю инсулина-NPH. Продолжительность действия для NPD композиции и инсулин-NPH композиции приблизительно одинаковa. Однако наиболее важно, что настоящая композиция повышает более быстро и остается стабильной в течение более длительного периода, чем инсулин-NPH. Это различие достаточно неожиданно с точки зрения быстродействующего профиля мономерного аналога.

Особенно предпочтительная композиция инсулиновый аналог-протамин, Lys^B28 Pro^B29-человеческий инсулин-NPD, включает Lys^B28 Pro^B29-человеческий инсулин, от 0,27 до 0,32 мг протамина/100 Единиц инсулинового аналога, от 0,35 до 0,9% цинка по весу и фенольное производное. Концентрация протамина предпочтительно составляет 0,3 мг/100 Единиц в расчете на свободное основание.

Изобретение также обеспечивает способ получения Lys^B28 Pro^B29-человеческий инсулин-протамин кристаллов, который включает:
смешение водного раствора Lys^B28 Pro^B29-человеческого инсулина в состоянии гексамерного ассоциата и раствора протамина при температуре от около 8 до около 22^oC;
указанный водный раствор включает от 0,35 до 0,9% цинка по весу, Lys^B28 Pro^B29-человеческий инсулин и фенольное производное при pH от 7,1 до 7,6;
указанный раствор протамина включает протамин при pH от 7,1 до 7,6 так, чтобы его финальная концентрация составляла от 0,27 до 0,32 мг протамина/100 Единиц инсулинового аналога.

До создания изобретения было известно, что мономерные инсулиновые аналоги менее склонны к ассоциации и образованию гексамеров. Условия, необходимые для того, чтобы вызвать ассоциацию мономерных инсулиновых аналогов с протамином с образованием кристаллов, ранее были не известны в данной области. Pанние исследования относились к инсулину. Указания относительно получения инсулина-NPH (нейтральная композиция протамина согласно Hagedorn) или изофан инсулиновых композиций согласно Krayenbuhl и Rosenberg, Sterd Memorial Hospital Report (Copenhagen), 1:60 (1946) не уместны с точки зрения различия в свойствах мономерных инсулиновых аналогов. В действительности, коммерческий способ получения Hunilin-N^TM (инсулин-NPH), кислотно-нейтральный способ, не приводит к получению кристаллического инсулинового аналога-NPD.

Наиболее важно установление того, что параметры настоящего изобретения, а именно температура кристаллизации и образования гексамерного комплекса инсулинового аналога, цинка и фенольного производного, являются существенными признаками для образования стабильных Lys^B28 Pro^B29-hI-NPD кристаллов.

Температура кристаллизации должна находиться в пределах от около 8 до около 22^oC, предпочтительно от 13 до 17^oC. Если температура находится за пределами этого диапазона, то получается главным образом аморфная композиция инсулиновый аналог-протамин.

Также существенно, что инсулиновый аналог трансформируется в гексамерное состояние до кристаллизации. Кристаллизация приводит к аморфному продукту в случае, когда способ осуществляют в состоянии мономерного ассoциирования. Кристаллы образуются без перемешивания в течение от 5 до 30-60 ч. Кристаллы высокого качества образуются обычно в течение 24 ч.

Растворимый мономерный инсулиновый аналог комплексуется в гексамерный ассоциат при суспендировании твердого мономерного аналога в растворителе, содержащем фенольное производное, и при добавлении цинка до тех пор, пока концентрация цинка не составит от 0,35 до 0,9% по весу. Цинк предпочтительно добавляют в виде соли. К иллюстрирующим примерам солей цинка относятся ацетат цинка, бромид цинка, хлорид цинка, фторид цинка, иодид цинка и сульфат цинка. Специалисту в данной области должно быть известно, что существуют и другие соли цинка, которые также могут быть использованы в способе настоящего изобретения. Предпочтительно использование ацетата цинка и хлорида цинка.

Растворению инсулинового аналога в растворителе, как это известно, может способствовать подкисление. При кислом растворении для повышения растворимости аналога pH понижают до около 3-3,5 с помощью физиологически толерантной кислоты, предпочтительно HCl. К другим физиологически толерантным кислотам относятся уксусная кислота, лимонная кислота и фосфорная кислота. pH затем подводят физиологически толерантным основанием, предпочтительно NaOH, до около 7,1-7,6 для кристаллизации. Другими физиологически толерантными основаниями являются KOH и гидрохлорид аммония.

Наиболее важно то, что способ получения Lys^B28 Pro^B29-hI-NPD комплекса чувствителен к концентрации NaCl. Если концентрация превосходит приблизительно 4 мг/мл, кристаллы инсулиновый аналог-NPD оказываются смешанными с аморфным продуктом. Таким образом, предпочтительно, для того чтобы избежать образования ионов соли, мономерный аналог растворить при нейтральном pH. Наконец, аналог можно растворить в растворителе при кислом pH до добавления буфера. Это уменьшает концентрацию солей, генерируемых вследствие подведения pH. Однако порядок, при котором добавляются компоненты, не является существенным для образования гексамера или для аморфного образования.

Как указывалось выше, к композициям настоящего изобретения может быть добавлен изотонический агент. Изотонический агент можно добавлять к раствору аналога, к раствору протамина или к финальной инсулиновый аналог-NPD композиции. Аналогично добавление физиологически толерантного буфера можно проводить к раствору аналога, к раствору протамина, или к финальной инсулиновый аналог-NPD композиции. Однако предпочтительно, чтобы как раствор аналога, так и раствор протамина содержали изотонический агент и буфер до смешения водного раствора и протамина. Из-за влияния NaCl на способ получения кристаллического инсулинового аналога-NPD глицерин является предпочтительным изотоническим агентом.

Изобретение также обеспечивает композиции инсулиновых аналогов, которые включают смеси инcулинового аналога в виде кристаллического твердого вещества и растворимого инсулинового аналога. Эти смеси получают в диапазоне от около 1: 99 до 99:1 по объему суспендированного инсулинового аналога-NPD к растворимому инсулиновому аналогу. Растворимый инсулиновый аналог представляет собой мономерный инсулиновый аналог, растворимый в водном растворителе, содержащий цинк, фенольное производное, изотонический агент и буфер. Концентрации в растворителе такие же, как здесь ранее указанные. Предпочтительно, чтобы отношение инсулиновый аналог-NPD к растворимому инсулиновому аналогу составляло 25:75 - 75:25 и более предпочтительно 50:50. Смеси легко получают смешением индивидуальных компонентов.

Смешанные композиции настоящего изобретения особенно пригодны для лечения сахарного диабета благодаря сочетанию быстрого начала действия и пролонгированного действия. Эти смеси позволяют осуществлять "прекрасный контроль" путем варьирования количества каждого индивидуального компонента исходя из потребностей, диеты и физической нагрузки пациента. Преимущество смесей суспендированного инсулинового аналога-NPD и растворимого инcулинового аналога заключается также в том, что они гомогенны, т.е. при любом равновесном обмене между суспендированными кристаллами и растворимым инсулиновым аналогом они прозрачны.

Инсулиновые аналоги настоящего изобретения могут быть получены при помощи любой из ряда признанных технологий синтеза пептидов, включая классические (растворные) способы, твердофазные способы, полусинтетические способы и более современные способы при помощи рекомбинантной ДНК. Например, Chance et al., EPO 214826, раскрывают получение различных мономерных аналогов.

Следующие примеры приведены для более подробной иллюстрации получения инсулиновых аналогов и настоящего изобретения. Объем изобретения не ограничивается только нижеследующими примерами.

Пример 1
Получение Lys^B28 Pro^B29 - hI-NPD
Раствор Lys^B28 Pro^B29-человеческого инсулина (Lys^B28 Pro^B29-hI) с концентрацией 200 МЕ/мл (Е200) получают путем растворения цинксодержащих кристаллов Lys^B28 Pro^B29-hI в системе консервант/буфер, содержащий 1,6 мг/мл м-крезола, 0,73 мг/мл фенола (эквивалентное 0,65 мг/мл фенола, рассчитанное как 89%), 16 мг/мл глицерина и 3,78 мг/мл двухосновного фосфатного натриевого буфера. Эндогенный (возникший внутри организма) уровень цинка в кристаллах дополняют путем добавления соответствующего объема кислого раствора ZnO (10 мг/мл) до достижения конечной концентрации 0,025 мг/100 ME (0,7%). Растворение Lys^B28 Pro^B29 осуществляют при температуре окружающей среды путем понижения pH до около 3-мкл объемами 5М HCl. После того как раствор просветлеет, pH вновь доводят до 7,5 при помощи микролитровых объемов 5М NaOH.

Раствор протамина получают растворением достаточно твердого сульфата протамина в растворе консервант/буфер до достижения конечной концентрации 0,6 мг/100 ME в расчете на свободное основание. pH этого раствора доводят до 7,5 и стабилизируют при 15^oC.

Оба раствора разбавляют до конечной концентрации водой для инъекции и фильтруют. 5 мл аликвоты Lys^B28 Pro^B29-hI составляющей заполняют в отдельные чистые стеклянные ампулы, и образцы инкубируют в водяной бане при 15^oC. После соответствующего времени стабилизации (15 мин), вызывают осаждение путем быстрого добавления 5 мл раствора протамина к Lys^B28 Pro^B29-hI образцам. Кристаллизацию проводят в течение около 24 ч при 15^oC.

Пример 2
Получение Lys^B28 Pro^B29-hI-NPD
Способ идентичен примеру 1, за исключением того, что растворение Lys^B28 Pro^B29-hI происходит при нейтральном pH. Способ осуществляют так, чтобы конечное pH составляло 7,4.

Пример 3
Получение Lys^B28 Pro^B29-hI NPD
Инсулиновый аналог-NPD получают по способу, аналогичному примеру 1, но растворение в кислой среде Lys^B28 Pro^B29-hI выполняют в присутствии всех наполнителей, за исключением двухосновного натриевого фосфатного буфера. Твердый двухосновной натрий фосфат добавляют, после того как раствор инсулинового аналога возвращают к pH 7,4. Добавление двуxосновного натрий фосфата приводит к осветвлению раствора.

Пример 4
Получение смешанных композиций инсулинового аналога
Смеси Lys^B28 Pro^B29-hI композиций промежуточного и быстрого действия получают следующим образом. Суспензионную композицию промежуточного действия получают при помощи способов, описанных в примере 3, и эта композиция служит в качестве составляющей промежуточного действия для смеси. Отдельный раствор Lys^B28 Pro^B29-hI (100 ME) получают путем растворения цинксодержащих Lys^B28 Pro^B29 - hI кристаллов при температуре окружающей среды в растворителе, описанном в примере 1. Эндогенный уровень цинка Lys^B28 Pro^B29-hI в этом растворе дополняют путем добавления кислого раствора ZnO до соответствия уровню в суспензионной составляющей (т.е. 0,025 мг/100 ME (0,7%)). После того как pH доводят до 7,4, используя 10%-ные растворы HCl и/или NaOH, для разбавления раствора до конечной концентрации используют воду для инъекции. Этот раствор представляет собой быстродействующую составляющую смесей. Конечную смесь получают смешением соответствующих объемов составляющих промежуточного и быстрого действия, получая требуемое отношение. 50/50 смесь получают путем смешения 1 части составляющей промежуточного действия с 1 частью составляющей быстрого действия по объему.

Пример 5
Влияние ионной силы на кристаллизацию Lys^B28 Pro^B29-hI протамин
Влияние ионной силы на кристаллизацию оценивают путем добавления NaCl к Lys^B28 Pro^B29-hI составляющей до смешения с протамином. NaCl добавляют так, чтобы общая концентрация составляла 20, 30 и 40 мM (1,2; 1.8; 2,3 мг/мл). Распределение частиц по объему демонстрирует полимодальное поведение (дополнительные пики для частиц малого размера) по мере повышения концентрации NaCl. Средний объемный размер частиц уменьшается по мере увеличения концентрации NaCl, указывая на увеличение аморфного вещества. Результаты размера частиц в зависимости от концентрации NaCl выглядят следующим образом:
[NaCl] - Средний размер частиц по объему (мкм)
13 мM - 3,9
20 мM - 3.5
30 мМ - 3,3
40 мМ - 3,2
Анализ с помощью микроскопии показал, что все образцы содержали смесь аморфного и кристаллического вещества. Образец, содержащий 40 мМ NaCl, представлял собой в основном аморфное вещество и содержал очень мало кристаллов.

Пример 6
Сравнительные динамики Lys^B28 Pro^B29-hI-NPD и человеческого инсулина
Это исследование проводят на модели conscious собаки. Перед началом исследования делают вливание соматостатина (0,3 мкг/кг-мин). После 10-минутного перерыва вводят подкожную инъекцию либо NPD, либо NPH. Проводят частый мониторинг глюкозы в плазме и вливают переменное количество глюкозы (20%), для того чтобы поддержать гликемию вблизи нормы. Пробы берут все время и анализируют на иммунореактивный инсулин (Linco антитело) и глюкозу. Результаты иллюстрируются фиг. 1.

Пример 7
Получение кристаллов Asp (B28) аналог-протамин
Составляющую Asp (B28)-hI при концентрации 200 МЕ/мл (Е 200) получают путем растворения лиофилизированного блока (95%-ная чистота) в системе консервант/буфер, содержащей: 1,6 мг/мл м-крезола, 0,73 мг/мл фенола (эквивалент для 0,65 мг/мл фенола, рассчитанного как 89%), 16 мг/мл глицерина и 3,78 мг/мл двухосновного фосфата натрия. К системе добавляют цинк, используя соответствующий объем кислого ZnO раствора (10 мг/мл), получая финальную концентрацию 0,025 мг/100 ME. Растворение Asp (B28) проводят при температуре окружающей среды при нейтральной pH. Конечная pH составляющей равна 7,4.

Кристаллизацию проводят, как описано в примере 2. Получают конечные концентрации протамина 0,3, 0,35 и 0,4 мг/100Е. Эти концентрации протамина соответствуют 2,9, 9,3 и 10,5% соответственно в расчете вес/вес. Инкубационные температуры составляют 5^oC (0,3 мг/100Е только), 15 и 22^oC. После выдержки в течение 24 ч при этих температурах, образцы анализируют на образование кристаллов. Результаты, определенные с помощью микроскопии, дают смесь небольшого количества кристаллов и аморфного продукта.

Пример 8
Получение кристаллов Asp (B28) аналог-протамин
Кристаллизацию Asp (B28) протамин проводят, как описано в примере 7, за исключением того, что белок растворяют первым в растворителе, свободном от буфера. Добавление кислой ZnO смеси было достаточно, чтобы подкислить образец до pH 2,0-2,5. После того как раствор осветлится, pH доводят до приблизительно 7 с помощью микролитровых объемов 5N NaOH. Фосфат натрия двухосновный добавляют, используя концентрированный раствор смеси при 47,25 мг/мл, получая финальную концентрацию 3,78 мг/мл. Эту составляющую доводят до pH 7,4. используя микролитровые количества HCl.

Кристаллизацию инициируют путем комбинации составляющих Asp (B28) и протамина, как описано в предыдущих примерах. Получают финальные концентрации протамина 0,3, 0,35 и 0,4 мг/100Е. Температуры инкубации составляют 15 и 22^oC. После выдержки в течение 24 ч при этих температурах образцы анализируют на образование кристаллов. Результаты, определенные с помощью микроскопии, дают смесь кристаллов и аморфного продукта.

Пример 9
Получение кристаллов Leu (B28) Pro(В29) аналог-протамин
Составляющую Leu (B28) Pro (В29) (93%-ная чистота) при концентрации 200 МЕ/мл (Е 200) получают, как описано в примере 8, используя растворение блока в кислоте с последующим доведении pH с помощью 5N NaOH до pH 7,4. Кристаллизацию проводят как описано выше. Исследуют конечные концентрации протамина 0,3, 0,35 и 0,4 мг/100E. Температуры инкубации включают 5, 15 и 22^oC. После 24 ч при этих температурах все образцы содержат некоторое количество кристаллов, но в основном они были аморфными, как это определено с помощью микроскопии.

Пример 10
Des (В27) hI-протамин кристаллы
Составляющую Des Thr (B27) (97,37%-ная чистота) при концентрации 200 ME/мл (Е200) получают, как описано в примере 8, используя кислое растворение блока с последующим доведением pH с помощью 5N NaOH до 7,4. Кристаллизацию проводят, как описано в примере 8. Исследуют конечные концентрации протамина 0,3, 0,35 и 0,4 мг/100E. Температуры инкубации включают 15 и 22^oC. После 24 ч при этих температурах, все образцы в основном были аморфными, как определено с помощью микроскопии. Качественно наблюдаются кристаллы.

Пример 11
Des (B28-B30) hI-протамин
Составляющую Des (28-30) (96,3%-ная чистота) при концентрации 200 МЕ/мл (Е200) получают, как описано в примере 8, используя кислое растворение блока с последующим доведением pH с помощью 5N NaOH до 7,4. Кристаллизацию проводят, используя способ нейтральное/нейтральное смешение белковой и протаминовой составляющих, как описано выше. Исследуют конечные концентрации протамина 0,3, 0,35 и 0,4 мг/100E. Температуры инкубации включают 15 и 22^oC. После 24 ч при этих температурах все образцы в основном были аморфными, как определено с помощью микроскопии. Качественно наблюдаются кристаллы. Эти кристаллы хорошо определяются.

Пример 12
Asp (B28) аналог-протамин
Раствор инсулин Asp (В28)-человеческого инсулинового аналога получают путем растворения 16,6 мг белка в 1 мл раствора, содержащего 3,2 мг/мл м-крезола, 1,3 мг/мл фенола и 32 мг/мл глицерина. Добавляют 14,4-мкл аликвоту раствора смеси подкисленного цинка (10 мг/мл в Zn²⁺, полученный растворением 0,311 г оксида цинка в 5 мл 10%-ной HCl и разбавлением до 25 мл водой). pH раствора составлял 2,3, что обеспечивало полное растворение белка. Добавляют 10-мкл аликвоту 10 NaOH, чтобы довести pH до 7,06. К раствору добавляют 100 мкл 0,28 М двухосновного фосфата натрия, pH 7,0, который повышает pH раствора до 7,27. К раствору добавляют 870-мкл аликвоту воды для инъекции. Дополнительно добавляют 10%-ную HCl (1 мкл) и NaOH (0,7 мкл), и конечный объем раствора доводят до 2 мл водой для инъекции, получая конечную pH 7,26. Раствор фильтруют через 0,2-мкм Supor^R Acrodisc^R 13, Gelman Sciences) фильтр перед использованием.

Протаминовые смесевые растворы получают путем растворения сульфата протамина в растворе, содержащем 1,6 мг/мл м-крезола, 0,65 мг/мл фенола, 16 мг/мл глицерина и 14 мМ двухосновного фосфата натрия. Конечное значение pH раствора доводят до 7,3. Конечная концентрация протамина составляла 0,60 мг/100E в расчете на свободное основание. Оба раствора фильтруют через 0,22-мкм (Millipore Sterivex^TM-GV) фильтрующий элемент перед использованием.

Кристаллизация достигается путем смешения раствора Asp (В28)-человеческого инсулина в отношении 1:1 при контролируемой температуре, указанной в таблице. Конечные условия смеси были 3,94 мг/мл Asp (B28)-человеческого инсулина, 0,0359 мг/мл (0,9%) ионов цинка, 1,6 мг/мл м-крезола, 0,65 мг/мл фенола, 16 мг/мл глицерина, 14 мM двуxосновного фосфата натрия и 0,30 мг/100Е протамина при pH 7,3. В частности, 50-200-мкл порции раствора Asp^B28-человеческого инсулина переносят в стеклянные ампулы, и температуру образцов доводят до 4, 8, 15 или 23^oC (температура окружающей среды). Части обоих протаминовых растворов также доводят до этих температур. Через 15-20 мин эквивалентный объем любого протаминового раствора переносят с помощью пипетки в образцы Asp (В28)-человеческого инсулина. Смесь мягко взбалтывают при вращении, накрывают и затем оставляют неподвижной при контролируемой температуре в течение периода кристаллизации. Все образцы исследуют с помощью микроскопии через 24 ч, и, как обнаружено, они являются в основном аморфными. Через 48 ч образцы, содержащие 0,30 мг/100Е протамина и инкубированные при 15^oC, показывают значительное количество иглоподобных кристаллов и некоторое количество аморфного вещества.

Пример 13
Раствор инсулин Asp (В28)-человеческий инсулиновый аналог получают путем растворения 10,62 мг белка в 0,71 мл раствора, содержащего 3,2 мг/мл м-крезола, 1,3 мг/мл фенола и 32 мг/мл глицерина. Добавляют 10,2-мкл аликвоту смесевого раствора кислого цинка (10 мг/мл в Zn²⁺, полученном растворением 0,311 г оксида цинка в 5 мл 10%-ной HCl и разбавлением до 25 мл водой). pH раствора составлял 2,3, что обеспечивало полное растворение белка. Добавляют 6,5-мкл аликвоту 10%-ной NaOH, чтобы довести pH до 7,00. К раствору добавляют 71 мкл 0,28 М двухосновного фосфата натрия, pH 7,0, который повышает pH раствора до 7,26. К раствору добавляют 620-мкл аликвоту воды для инъекции. Дополнительно добавляют 10%-ную HCl (0,2 мкл) и NaOH (0,6 мкл), и конечный объем раствора доводят до 1,42 мл водой для инъекции, получая конечную pH 7,42. Раствор фильтруют через 0,2-мкм (Supor^R Acrodisc^R 13, Gelman Scinces) фильтр перед использованием.

Протаминовый смесевой раствор получают путем растворения сульфата протамина в растворе, содержащем 1,6 мг/мл м-крезола, 0,65 мг/мл фенола, 16 мг/мл глицерина и 14 мМ двухосновного фосфата натрия. Конечное значение pH раствора доводят до 7,4, и конечная концентрация протамина составляет 0,60 мг/100E в расчете на свободное основание. Раствор фильтруют через 0,22-мкм (Millipore Sterivex^TM-GV) фильтрующий элемент перед использованием.

Кристаллизация достигается путем смешения раствора Aps (В28)-человеческого инсулина в отношении 1:1 с раствором протамина, как описано в примере 12, при контролируемых температурах 13, 15, 17 и 23^oC. Результаты представлены в таблице. Конечные условия смеси - 3,74 мг/мл Aps (В28)-человеческого инсулина, 0,0359 мг/мл (0,9%) ионов цинка, 1,6 мг/мл м-крезола, 0,65 мг/мл фенола, 16 мг/мл глицерина, 14 мМ двуxосновного фосфата натрия и 0,30 мг/100E протамина при pH 7,4. Оценивают четыре различные температуры кристаллизации. 1-мл аликвоту Aps^B28-человеческого инсулина, стабилизированную при 15^oC, смешивают с 1 мл протаминового раствора, доведенного до той же самой температуры. После мягкого взбалтывания при вращении, композицию оставляют неподвижной при 15^oC. Другой образец получают путем стабилизации раствора 100-мкл Asp(В28)-человеческого инсулина при 13^oC и затем смешения со 100 мкл протаминового раствора, доведенного до той же самой температуры, финальную смесь инкубируют при 13^oC. Третий образец получают аналогичным путем, за исключением того, что две 100- мкл аликвоты стабилизируют, смешивают и затем инкубируют при 17^oC. Финальный раствор получают путeм смешения стабилизированных при температуре окружающей среды растворов 80-мкл аликвот Asp (В28)-человеческого инсулина и протамина и инкубирования при температуре окружающей среды (23^oC). Все образцы оценивают с помощью микроскопии через 24 ч и другие более поздние временные интервалы, перечисленные в таблице.

Кристаллы, полученные в соответствии с вышеуказанными примерами, иллюстрируются фиг. 2 и 3.

Изобретение раскрывает различные парентеральные фармацевтические композиции, которые включают мономерный инсулиновый аналог, цинк, протамин и фенольное производное. Композиции аналога обеспечивают пролонгированное действие. Также описан способ получения композиции инсулиновый аналог-протамин. Изобретение включает также описание способа лечения диабета с помощью комплекса инсулина и протамина, а также содержащих его фармацевтических композиций. Техническим результатом изобретения является создание средств для лечения диабета c пролонгированным действием. 8 с. и 23 з.п. ф-лы, 1 табл. 3 ил.

1. Комплекс аналога инсулина и протамина, который включает человеческий инсулин, в котором Pro в положении В28 замещен на Asp, Lys, Leu, Val или Ala, а Lys в положении В29 представляет собой Lys или Pro; человеческий инсулин, в котором аминокислоты В28-В30 делетированы; или человеческий инсулин, в котором аминокислота В27 делетирована, а также протамин, цинк, и фенольное производное, при условии, что когда инсулин представляет собой Asp^В28 - человеческий инсулин, концентрация протамина составляет менее 10% по весу. 2. Комплекс аналога инсулина и протамина по п.1, который содержит Lys^В28 Pro^В29 - человеческий инсулин, протамин, цинк, и фенольное производное. 3. Комплекс по п. 2, который содержит 0,2 - 0,32 мг протамина на 100 Единиц инсулинового аналога, 0,35 - 0,9% цинка по весу, и фенольное производное. 4. Комплекс по п.1, который содержит Asp^В28 - человеческий инсулин, 0,2 - 0,35 мг протамина/100 Единиц инсулинового аналога, 0,35 - 0,9% цинка по весу, и фенольное производное. 5. Комплекс по любому из пп.1, 2, 3 или 4, в котором комплекс имеет форму кристаллов. 6. Фармацевтическая композиция для парентерального введения, содержащая аналог инсулина и протамин, которая включает комплекс по пп.1, 2, 3, 4 или 5. 7. Композиция по п.6, которая включает 0,2 - 1,5 мг протамина на 100 Единиц инсулинового аналога, 0,35 - 0,9% цинка по весу и фенольное производное. 8. Фармацевтическая композиция для парентерального введения, которая включает Lys^В28 Pro^В29 - человеческий инсулин, 0,27 - 0,32 мг протамина на 100 Единиц инсулинового аналога, и 0,35 - 0,9% цинка по весу и фенольное производное. 9. Фармацевтическая композиция для парентерального введения, которая включает Lys^В28 Pro^В29 - человеческий инсулин, 0,3 мг протамина на 100 Единиц инсулинового аналога, 0,7% цинка по весу, 1,7 мг/мл м-крезола, 0,7 мг/мл фенола, 16 мг/мл глицерина и 3,78 мг/мл двуосновного фосфата натрия. 10. Фармацевтическая композиция для парентерального введения, которая включает Asp^В28 - человеческий инсулин, 0,27 - 0,35 мг протамина на 100 Единиц инсулинового аналога, 0,35 - 0,9% цинка по весу и фенольное производное. 11. Фармацевтическая композиция для парентерального введения по любому из пп.6 - 10, которая дополнительно содержит растворимый инсулиновый аналог. 12. Фармацевтическая композиция для парентерального введения, включающая смесь раствора растворимого аналога инсулина, содержащую аналог человеческого инсулина, цинк и фенольное производное, а также кристаллы аналога инсулина-протамина, в которой весовое отношение двух компонентов составляет от 1 : 99 до 99 : 1 аналога инсулина к кристаллам аналога инсулина-протамина, при этом указанный аналог инсулина представляет собой человеческий инсулин, в котором Pro в положении В28 замещен на Asp, Lys, Leu, Val или Ala, и Lys в положении В29 является Lys или Pro человеческий инсулин, в котором аминокислоты В28 - В30 делетированы; или человеческий инсулин, в котором аминокислота В27 делетирована, при условии, что когда инсулин представляет собой Asp^В28 - человеческий инсулин, концентрация протамина составляет менее 10% по весу. 13. Фармацевтическая композиция для парентерального введения, включающая смесь раствора растворимого аналога инсулина, содержащую аналог человеческого инсулина, цинк и фенольное производное, а также кристаллы аналога инсулина-протамина, в которой весовое отношение двух компонентов составляет от 1 : 99 до 99 : 1 аналога инсулина к кристаллам аналога инсулина-протамина, и в котором указанный аналог инсулина представляет собой Lys^В28 Pro^В29 - человеческий инсулин. 14. Фармацевтическая композиция для парентерального введения по п.12 или 13, в которой весовое отношение двух компонентов составляет от 75 : 25 до 25 : 75. 15. Фармацевтическая композиция для парентерального введения по п.14, в которой весовое отношение двух компонентов составляет 50 : 50. 15. Фармацевтическая композиция для парентерального введения по п.14, которая включает Lys^В28 Pro^В29 - человеческий инсулин и кристаллы Lys^В28 Pro^В29 - человеческий инсулина-протамина. 17. Фармацевтическая композиция для парентерального введения по п.16, в которой весовое отношение двух компонентов составляет 50 : 50, 75 : 25 или 25 : 75. 18. Фармацевтическая композиция для парентерального введения, содержащая аналог инсулина-протамин, которая включает смесь раствора растворимого аналога человеческого инсулина, включающую аналог человеческого инсулина, цинк и фенольное производное, отличающаяся тем, что по существу весь растворимый аналог находится в гексамерном комплексе и комплексе аналог инсулина-протамин, в котором весовое отношение двух компонентов составляет от 1 : 99 до 99 : 1 аналога растворимого инсулина к комплексу аналог инсулина-протамин, при этом указанный аналог инсулина представляет собой человеческий инсулин, в котором Pro в положении В28 замещен на Asp, Lys, Leu, Val или Ala, а Lys в положении В29 является Lys или Pro, человеческий инсулин, в котором аминокислоты В28 - В30 делетированы, или человеческий инсулин, в котором аминокислота В27 делетирована,
19. Фармацевтическая композиция для парентерального введения, содержащая аналог инсулина-протамин, по п.18, в которой весовое отношение двух компонентов составляет от 75 : 25 до 25 : 75. 20. Фармацевтическая композиция для парентерального введения содержащая аналог инсулина-протамин, по п. 18 или 19, которая включает растворимые Asp^В28 гексамерные комплексы и комплексы Asp^В28 - протамина. 21. Фармацевтическая композиция для парентерального введения, содержащая аналог инсулина-протамин, по п. 18 или 19, которая включает растворимые Lys^В28 Pro^В29 гексамерные комплексы и комплексы Lys^В28 Pro^В29 - протамина. 22. Фармацевтическая композиция для парентерального введения, содержащая аналог инсулина-протамин, по любому из пп.18, 19, 20 или 21, которая содержит кристаллы комплекса аналог инсулина-протамин. 23. Фармацевтическая композиция для парентерального введения, содержащая аналог инсулина-протамин, по любому из пп.18 - 22, в которой раствор растворимого аналога человеческого инсулина включает 0,35 - 0,09% Zn по весу. 24. Фармацевтическая композиция для парентерального введения, содержащая аналог инсулина-протамин, по п.23, в которой аналог человеческого инсулина представляет собой Asp^В28 - человеческий инсулин. 25. Фармацевтическая композиция для парентерального введения, содержащая аналог инсулина-протамин, по п.23, в которой аналог человеческого инсулина представляет собой Lys^В28 Pro^В29 - человеческий инсулин. 26. Способ получения комплекса в любом из пп.1 - 5, включающий соединение аналога мономерного инсулина, протамина, цинка и фенольного производного в водном растворителе и выдерживания смеси до образования комплекса. 27. Способ получения кристаллов Lys^В28 Pro^В29 - человеческого инсулина-протамина, который включает соединение водного раствора Lys^В28 Pro^В29 - человеческого инсулина в гексамерном ассоциативном состоянии и раствора протамина при температуре 8 - 22^oC, при этом указанный водный раствор содержит 0,35 - 0,9% цинка по весу, Lys^В28 Pro^В29 - человеческий инсулин и фенольное производное при рН 7,1 - 7,6, а указанный раствор протамина содержит протамин при рН 7,1 - 7,6, так чтобы конечная концентрация протамина составляла 0,27 - 0,32 мг протамина/100 Единиц аналога инсулина. 28. Способ по п.27, в котором температура составляет 15^oC, концентрация цинка составляет 0,7 - 0,9%, а концентрация протамина составляет 0,3 мг/100 Единиц аналога инсулина. 29. Способ получения кристаллов Asp^В28 - человеческого инсулина-протамина, который включает соединение водного раствора Asp^В28 - человеческого инсулина в гексамерном ассоциативном состоянии и раствора протамина при температуре 13 - 17^oC, при этом указанный водный раствор содержит 0,35 - 0,9% цинка по весу, Asp^В28 - человеческий инсулин и фенольное производное при рН 7,1 - 7,6, указанный раствор протамина содержит протамин при рН 7,1 - 7,6, таким образом, чтобы конечная концентрация протамина составляла 0,27 - 0,32 мг протамина/100 Единиц аналога инсулина. 30. Способ получения фармацевтической композиции для парентерального введения по любому и пп.6 - 17, который включает суспендирование кристаллов аналога инсулина-протамина в фармацевтически приемлемом разбавителе. 31. Фармацевтическая композиция для парентерального введения по любому из пп.6 - 25 для использования при лечении сахарного диабета.