АЦИЛИРОВАННЫЕ АНАЛОГИ ИНСУЛИНА Российский патент 2000 года по МПК A61K38/28 C07K14/62 G01N33/68 

Изобретение относится к области лечения диабета. Более конкретно, настоящее изобретение относится к ацилированным аналогам инсулина пролонгированного действия.

Применение инсулинзаместительной терапии позволяет снизить смертность от этого заболевания и предотвратить развитие острых осложнений сахарного диабета. Однако осложнения при хроническом диабете остаются главной угрозой здоровью человека из-за персистентного нарушения метаболизма, возникающего, главным образом, в результате плохой регуляции уровня глюкозы в крови. Данные, полученные при исследованиях по борьбе с диабетом и его осложнениями (Diabetes Control and Complication Trial-DCCT), показали, что снижение Hb Alc на IX корреллирует с более чем 35%-ным уменьшением случаев заболеваемости ретинопатией.

Для обеспечения нормального уровня глюкозы в крови необходимо разработать такую терапию, чтобы она по возможности близко соответствовала профилю секреции эндогенного инсулина у нормальных индивидуумов. Ежедневная физиологическая потребность в инсулине колеблется и может быть разделена на две фазы: (a) абсорбтивную фазу, требующую выброса инсулина для устранения вызванного приемом пищи резкого увеличения уровня глюкозы в крови, и (b) постабсорбтивную фазу, требующую постоянно поддерживаемого количества инсулина, необходимого для регуляции выхода глюкозы печени для установления оптимального уровня глюкозы в крови натощак.

В соответствии с этим эффективная терапия предусматривает комплексное использование двух типов экзогенного инсулина: инсулина быстрого действия после приема пищи и основного инсулина медленного действия.

В настоящее время для обеспечения пролонгированного основного действия инсулин получают в условиях, способствующих образованию гексамерной конформации в нерастворимом кристаллическом состоянии. Таким лекарственным препаратом пролонгированного действия являются препараты Ультраленте, Ленте и семи-Ленте (Ultralente, Lente и semi-Lente). Однако было показано, что вследствие нерастворимости используемых в настоящее время препаратов пролонгированного действия возникают проблемы, связанные с несоответствием зависимости "доза-эффект", а также с непредсказуемостью времени действия. Помимо этого, один из имеющихся в нестоящее время инсулиновых препаратов пролонгированного действия, такой как говяжий инсулин Ультраленте, является иммуногенным. Присутствие антител в результате иммуногенности говяжьего инсулина Ультраленте приводит к изменению фармакокинетики инсулинов быстрого действия.

Хотя нерастворимый лекарственный препарат Ультраленте, благодаря своему времени действия, является удобным для ежедневного введения базального инсулина, многие врачи в настоящее время предпочитают использовать инсулин с промежуточным временем действия, инсулин-протаминовый лекарственный препарат, обычно называемый инсулином-NPH. Инсулин- NPH используется два раза в день в качестве основного инсулина, поскольку его сравнительно легко довести до оптимальной дозы с помощью лекарственного средства более короткого времени действия. В результате инсулин промежуточного действия составляет 70% в США, 64% в Японии, 45% в Европе, а всего 55% мирового рынка инсулина.

Однако, как нерастворимый инсулин-NPH, так и нерастворимый инсулин Ультраленте являются суспензионными лекарственными препаратами. Таким образом, эти лекарственные препараты по своей природе являются менее предсказуемыми, чем растворимые лекарственные препараты, а поэтому в меньшей степени обеспечивают адекватную регуляцию глюкозы в крови и в большей степени связаны с риском возникновения опасных для жизни приступов гипогликемии. В соответствии с этим, потребность в растворимом базальном инсулине пролонгированного действия для проведения эффективной интенсивной инсулинзаместительной терапии остается актуальной. Настоящее изобретение относится к ацилированным аналогам инсулина, которые могут входить в состав лекарственных препаратов для проведения инсулиновой терапии с использованием растворимого базального инсулина.

В Японской патентной заявке I-S54699 Muranishi & Kiso описывают ацилирование свиного, говяжьего и человеческого 1 инсулина. В частности, описаны следующие соединения: B29 -N^ε-пальмитоилинсулин ( ε- аминогруппа ацилирована), B1 -N^α- пальмитоилинсулин (N-концевая α- аминогруппа цепи B ацилирована) и B1,B29 -N^α,-N^ε- дипальмитоилинсулин ( ε- миногруппа и N-концевая ( ε- аминогруппа ацилированы). Muranishi и Kiso сообщают, что ацилированный инсулин имеет биологический профиль, аналогичный профилю инсулина, однако, не указаны дозы, пути введения или другие условия на in vivo-модели, позволяющие специалистам оценить активность или продолжительность действия ацилированного инсулина.

Аналогично, Hashimoto и др., в Pharmaceutical Research 6: 171-176 (1989) описывают B1 -N^α- пальмитоилинсулин (N-концевая α- аминогруппа ацилирована) и B1,B29 -N^α,-N^ε- дипальмитоилинсулин (как ε- аминогруппа, так и N-концевая α- амингруппа ацилированы). Hashimoto и др. изучили гипогликемическое действие B1 -N^α- пальмитоилинсулина и B1,B29 -N^α,-N^ε- дипальмитоилинсулина на самцов крыс при 25 ед/мл, при наиболее высокой дозе. В этих дозах наблюдается очень низкая активность при внутривенном введении. При внутримышечном введении наблюдается лишь кратковременное гипогликемическое действие B1 -N^α- пальмитоилинсулина и незначительное действие B1,B29 -N^α,-N^ε- дипальмитоилинсулина.

Помимо in vivo-экспериментов, сообщаемых Muranishi, Kiso и Hashimoto и др. , Walter и др. в PCT-публикации WO 92/01476 описывают, что время полужизни белков и пептидов может быть увеличено in vivo путем химического связывания белка с неполярной группой, в частности, с производным жирных кислот. Жирная кислота обеспечивает мостиковую связь между белком и альбумином. Кроме того, Walder и др. указывают на то, что неполярная группа, предпочтительно, ограничена единственным сайтом или сайтами в белке и демонстрирует связывание цистеиновых остатков гемоглобина. В указанной ссылке, в основном, описаны жирнокислотные производные инсулина. Однако не описаны конкретно или не показаны в примерах жирнокислотные производные инсулина, и нет никаких данных, указывающих на сохранение биологической активности жирнокислотных производных инсулина.

Было обнаружено, что селективное ацилирование свободной аминогруппы мономерного аналога инсулина обеспечивает эффективную активность базального инсулина. Указано, что описанные выше неацилированные аналоги инсулина обеспечивают быстрое действие инсулина и быструю очистку. Эти аналоги известны специалистам как мономерные аналоги инсулина. Способность к модификации таких аналогов с получением базальной активности является в высшей степени неожиданным фактом.

Настоящее изобретение относится к моноацилированному аналогу инсулина, который при применении приводит к пролонгированному действию. Эти аналоги могут быть получены в виде растворимых лекарственных препаратов, что делает их использование более эффективным по сравнению с применяемой в настоящее время терапии на основе базального инсулина. Данные аналоги также обладают высокой предсказуемостью в отношении зависимости "доза-эффект", высокой предсказуемостью временного действия, а также не имеют характерного пика в профиле временного действия и идеально подходят для получения смеси лекарственных препаратов, содержащих аналог инсулина или ацилированный аналог инсулина.

Настоящее изобретение относится к моноацилированному аналогу инсулина формулы: SEQ ID N0:1 (последовательность 1 см. в конце описания),соответственно сшитому с последовательностью SEQ ID N0:2 (см. в конце описания)
или его фармацевтически приемлемой соли, где Xaa в положении I последовательности SEQ ID N0:1 (цепь инсулина A) представляет Gly; или ацилированный Gly, если Xaa в положении I последовательности SEQ ID N0:2 представляет Phe, Xaa в положении 28 последовательности SEQ ID N0:2 представляет Asp, Lys, Leu, Val или Ala, a Xaa в положении 29 последовательности SEQ ID N0:2 представляет Lys или Pro;
Xaa в положении I последовательности SEQ ID N0:2 (B-цепь инсулина) представляет Phe; или ацилированный Phe, если Xaa в положении I последовательности SEQ ID N0: 1 представляет Gly, Xaa в положении 28 последовательности SEQ ID N0:2 представляет Asp, Lys, Leu, Val, или Ala, a Xaa в положении 29 последовательности SEQ ID N0:2 представляет Lys или Pro;
Xaa в положении 28 последовательности SEQ ID N0:2 представляет Asp, Lys, Leu, Val, Ala; или анулированный Lys, если Xaa в положении 1 последовательности SEQ ID N0: 1 представляет Gly, Xaa в положении I последовательности SEQ ID N0:2 представляет Phe; a Xaa в положении 29 последовательности SEQ ID N0:2 представляет Pro; и
Xaa в положении 29 последовательности SEQ ID N0:2 представляет Lys, Pro; или ацилированный Lys, если Xaa в положении 28 последовательности SEQ ID N0: 2 представляет Asp, Lys, Leu, Val или Ala, Xaa в положении I последовательности SEQ ID NO:1 представляет Gly, a Xaa в положении I последовательности SEQ ID N0:2 представляет Phe.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к способу лечения гипергликемии путем введения пациенту, нуждающемуся в таком лечении, фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество ацилированного аналога инсулина по настоящему изобретению в сочетании с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми наполнителями.

Настоящее изобретение относится также к фармацевтическим препаратам для парентерального введения, которые содержат ацилированный аналог инсулина по настоящему изобретению вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми консервантами, агентами, придающими изотоничность, или буферами.

Все аббревиатуры аминокислот, используемые в настоящем описании, были приняты патентным ведомством США и бюро по регистрации товарных знаков, см. ст. 37 Свода федеральных правил 1.822 (B).

Термин "поперечное сшивание" означает образование дисульфидных мостиков между цистеиновыми остатками. Соответствующим образом поперечно сшитый инсулин человека или аналог инсулина человека содержит три дисульфидных мостика. Первый дисульфидный мостик образован между цистеиновыми остатками в положениях 6 и 11 цепи A. Второй дисульфидный мостик сшивает цистеиновые остатки в положении 7 цепи A и цистеина в положении 7 цепи B. Третий дисульфидный мостик сшивает цистеин в положении 20 цепи A и цистеин в положении 19 цепи B.

Термины "ацилированный Gly", "ацилированный Phe" и "ацилированный Lys" означает Gly, Phe или Lys, ацилированные C₆-C₂₁-жирной кислотой. Термин "ацилирующая группа" означает жирную кислоту, химически связанную с α- аминогруппой или ε- аминогруппой аналога инсулина. Свободные аминогруппы в положениях A1 и B1 являются α- аминогруппами. Свободная аминогруппа Lys в положении B28 и B29 является ε- аминогруппой.

Термин "ацилирование" означает введение одной ацильной группы, ковалентно связанной со свободной аминогруппой белка. Термин "селективное ацилирование" означает, что ацилирование ε- аминогруппы (или групп) является предпочтительным по сравнению α- аминогруппами.

Термин "жирная кислота" означает насыщенную или ненасыщенную C₆-C₂₁-жирную кислоту. Предпочтительными жирными кислотами являются насыщенными и включают миристиновую кислоту (C₁₄), пентадециловую кислоту (C₁₅), пальмитиновую кислоту (C₁₆), гептадециловую кислоту (C₁₇) и стеариновую кислоту (C₁₈). Наиболее предпочтительной жирной кислотой является пальмитиновая кислота. Соединения по настоящему изобретению представляют моноацилированные аналоги инсулина. Аналоги инсулина ацилированы C₆-C₂₁-жирной кислотой по α- аминогруппе или по ε- аминогруппе. Предпочтительно, эти аналоги моноацилированы по ε- аминогруппе лизина.

Термин "активированный эфир жирной кислоты" означает жирную кислоту, которая активирована с использованием общей методики, описанной в Methods of Enzymology. 25. 494-499 (1972) и Lapidot et al., в J.of Lipid Res. 8: 142-145 (1967). Активированный сложный эфир жирной кислоты включает производные обычно используемых ацилирующих агентов, таких как гидроксибензотриазид (HOBT), N-гидроксисукцинимид и их производные. Предпочтительным активированным сложным эфиром является N-сукцинимидилпальмитат.

Термин "растворимый" означает, что для ацилирования аналога инсулина в жидкой фазе присутствует достаточное количество сложного эфира. Предпочтительно, в жидкой фазе присутствует 1-2 молярных эквивалентов активированного сложного эфира на 1 моль аналога инсулина.

Термин "мономерный аналог инсулина" или "аналог инсулина", используемый в настоящем описании, означает аналог инсулина быстрого действия, менее подверженный димеризации или самоассоциации. Мономерный аналог инсулина является инсулином человека, где Pro в положении B28 замещен Asp, Lys, Leu, Val или Ala, и Lys в положении B29 обозначает Lysine или Proline. Мономерные аналоги инсулина описаны Chance и др. в патентной заявке США N 07/388201 (публикация EP0 N 383472) и Brange и др. в публикации EP0 N 214826. При этом следует отметить, что возможны и другие модификации мономерного аналога инсулина, широко используемые специалистами. Такими модификациями являются: замена гистидинового остатка в положении B10 на аспарагиновую кислоту; замена фенилаланинового остатка в положении B1 на аспарагиновую кислоту; замена треонинового остатка в положении B30 на аланин; замена серинового остатка в положении B9 на аспарагиновую кислоту; делеция аминокислот в положении B1, отдельно, или в комбинации с делецией в положении B2; и делеция треонина из положения B30.

Термин "основные условия", используемый в настоящем описании, означает основность реакции. Для селективного ацилирования аналога инсулина по ε- аминогруппе реакция должна быть проведена с использованием, в основном, всех свободных депротонированных аминогрупп. В водном растворителе или в сорастворителе основные условия означают, что реакцию осуществляют при pH более 9,0. В органическом растворителе реакцию осуществляют в присутствии основания с основностью, эквивалентной pK_a, равным в воде 10,75 или выше.

SEQ ID N0:1 обозначает первую последовательность, указанную в списке последовательностей, и представляет аналог A-цепи инсулина человека, имеющий последовательность (см. в конце описания), где Xaa в положении I последовательности SEQ ID NO: 1 (A-цепь инсулина) представляет Gly; или ацилированный Gly, если Xaa в положении I последовательности SEQ ID NO: 2 представляет Phe, Xaa в положении 28 последовательности SEQ ID N0:2 представляет Asp, Lys, Leu, Val, или Ala, a Xaa в положении 29 последовательности SEQ ID N0:2 представляет Lys или Pro.

SEQ ID N0: 2 обозначает вторую последовательность, указанную в списке последовательностей, и представляет аналог B-цепи инсулина человека, имеющий последовательность (см. в конце описания), где Xaa в положении I последовательности SEQ ID N0:2 (B-цепь инсулина) представляет Phe; или ацилированный Phe, если Xaa в положении I последовательности SEQ ID NO: 1 представляет Gly, Xaa в положении 28 последовательности SEQ ID N0:2 представляет Asp, Lys, Leu, Val или Ala, a Xaa в положении 29 последовательности SEQ ID N0:2 представляет Lys или Pro;
Xaa в положении 28 последовательности SEQ ID N0:2 представляет Asp, Lys, Leu, Val, Ala; или ацилированный Lys, если Xaa в положении I последовательности SEQ ID NO: 1 (A-цепь инсулина) представляет Gly, Xaa в положении I последовательности SEQ ID NO: 2 (B-цепь инсулина) представляет Phe, а Xaa в положении 29 последовательности SEQ ID N0:2 представляет Pro; а
Xaa в положении 29 последовательности SEQ ID N0:2 представляет Lys, Pro; или ацилированный Lys, если Xaa в положении 28 последовательности SEQ ID N0: 2 представляет Asp, Lys, Leu, Val, или Ala, Xaa в положении I последовательности SEQ ID NO: 1 (A-цепь инсулина) представляет Gly, а Xaa в положении I последовательности SEQ ID N0:2 (B-цепь инсулина) представляет Phe.

Как указано выше, настоящее изобретение относится к моноацилированному аналогу инсулина формулы SEQ ID N0:l, соответствующим образом сшитому с последовательностью SEQ ID N0:2, или его фармацевтически приемлемой соли. Предпочтительным аминокислотным остатком в положении I последовательности SEQ ID NO: 1 (A-цепь инсулина) является Gly. Фенилаланин является предпочтительной аминокислотой в положении I последовательности SEQ ID N0:2 (B-цепь инсулина). Предпочтительным аминокислотным остатком в положении 28 последовательности SEQ ID N0:2 является Asp; или ацилированный Lys, если аминокислотным остатком в положении 29 последовательности SEQ ID N0:2 является Pro. Предпочтительным аминокислотным остатком в положении 29 последовательности SEQ ID N0:2 является Lys; или Pro, если аминокислотным остатком в положении 28 последовательности SEQ ID N0:2 является ацилированный Lys. Из стандартных биохимических соединений, хорошо известных специалистам, предпочтительным аналогом является моноацилированный Lys^B28Pro^B29-инсулин человека. Наиболее предпочтительными ацилированными аналогами инсулина являются аналоги, моноацилированные C₈-C₁₈-жирной кислотой, предпочтительно C₁₄-C₁₆-жирной кислотой. Предпочтительными жирными кислотами являются октаноил (C₈), нонаноил (C₉), деканоил (C₁₀), ундеканоил (C₁₁), лауроил (C₁₂), тридеканоил (C₁₃), миристоил (C₁₄), пентадеканоил (C₁₅), пальмитоил (C₁₆). Таким образом, предпочтительными соединениями по настоящему изобретению являются B29 -N^ε- Asp^B28-пальмитоилинсулин человека (B²⁸ представляет Asp; B²⁹ представляет ацилированный Lys), B28 -N^ε- пальмитоил-Lys^B28Pro^B29-инсулин человека (B28 представляет ацилированный Lys; B29 представляет Pro), B28 -N^ε- октаноил-Lys^B28Pro^B29-инсулин человека, B28 -N^ε- деканоил-Lys^B28Pro^B29-инсулин человека, B28 -N^ε- миристоил-Lys^B28Pro^B29-инсулин человека, и B28 -N^ε- ундеканоил-Lys^B28Pro^B29-инсулин человека.

Ацилирование свободных аминогрупп белков, включая инсулин, хорошо известно специалистам. Общие способы ацилирования представлены в Methods of Enzymology. 25: 494-499 (1972) и предусматривают использование активированных сложных эфиров, галогенангидридов или ангидридов кислот. Использование активированных эфиров жирных кислот, в частности N-гидроксиоукцинимидоэфиров, является особенно предпочтительным средством ацилирования свободных аминогрупп жирной кислотой. Lapidot и др. , J.of Lipid Res. 8: 142-145 (1967) описывает получение эфиров N-гидроксисукцинамида и их использование при получении N-лаурилглицина, N-лаурил-Д-серина и N-лауроил-L-глутаминовой кислоты.

При селективном ацилировании ε- аминогруппы могут быть использованы различные защитные группы для защиты α- аминогруппы во время связывания. Подходящие для этой цели защитные группы хорошо известны специалистам, например, параметоксибензилоксикарбонил (pmZ). Предпочтительно, если ε- аминогруппа ацилирует в одной стадии синтеза без использования аминозащитных групп. Ацилирование осуществляют путем взаимодействия ацилированного сложного эфира жирной кислоты с ε- аминогруппой белка в основных условиях в полярном растворителе. Основность реакции должна быть достаточной для депротонирования всех свободных аминогрупп аналога инсулина. В условиях слабого основания не все аминогруппы являются депротонированными, и в результате этого происходит преимущественное ацилирование N-концевых или α- аминогрупп. В водном растворе или сорастворителе термин "основные условия" означает, что реакцию осуществляют при pH более 0,9. Поскольку разложение белка происходит в области pH>12,0, pH реакционной смеси должна быть предпочтительно 10,0-11,5, и наиболее предпочтительно 10,5. Значение pH реакционной смеси в смешанном органическом и водном растворителе представляет собой pH водного растворителя перед смешиванием.

Для достаточного депротонирования ε- аминогруппы (групп) в неводном растворителе селективное ацилирование ε- аминогруппы осуществляют в присутствии основания с основностью, эквивалентной pK_a в воде, равном 10,75 или выше. Таким образом, это основание должно быть, по крайней мере, таким сильным, как триэтиламин. Предпочтительно, основаниями являются тетраметилгуанидин, диизопропилэтиламин или гидроксид тетрабутиламмония. Использование более слабого основания приводит к ацилированию α- аминогрупп.

Выбор растворителя не является определяющей и в значительной степени зависит от растворимости аналога инсулина и эфира жирной кислоты. Растворитель может быть целиком органическим. Обычно приемлемыми органическими растворителями являются ДМСО, ДМФ и т.п. Подходящими являются также водный растворитель и смеси водных и органических растворителей. Выбор полярных растворителей ограничен лишь растворимостью реагентов. Предпочтительными растворителями являются ДМСО; ДМФ; ацетонитрил и вода; ацетон и вода; этанол и вода; изопропиловый спирт и вода; изопропиловый спирт, этанол и вода; и этанол, пропанол и вода. Предпочтительно, растворителем являются ацетонитрил и вода, наиболее предпочтительно 50%-ный ацетонитрил. Специалисту понятно, что подходящими также являются другие полярные растворители.

Обычно предпочтительно, чтобы активированный эфир жирной кислоты был в молярном избытке. Предпочтительно, реакцию осуществляют с использованием 1-4 молярных эквивалентов, более предпочтительно, с использованием 1-2 молярных эквивалентов сложного эфира. Специалисту понятно, что при очень высоких уровнях активированного сложного эфира будет образовываться значительное количество бис- или три-ацилированного продукта.

Температура реакционной смеси не является определяющей. Реакцию осуществляют при температуре от 20 до 40^oC и обычно завершают за период времени от 15 минут до 24 часов.

После ацилирования продукт очищают стандартными методами, такими, как обращение - фазовая хроматография или гидрофобная хроматография. Затем продукт выделяют обычными методами, такими как лиофилизация или кристаллизация.

Мономерные аналоги инсулина по настоящему изобретению могут быть получены любым из известных методов пептидного синтеза, включая калссические (раствор) методы, твердофазные методы, полусинтетические методы и более современные методы с использованием техники рекомбинантных ДНК. Так, например, Chance et al., в заявке на патент США N 07/388201, EP0-публикация N 383472 (Chance и др.) и в EP0 214826 (Brange и др.) раскрывается получение различных аналогов инсулина (все указанные документы введены в настоящее описание посредством ссылки). Цепи A и B аналогов инсулина по настоящему изобретению могут быть также получены посредством проинсулин-подобной молекулы-предшественника с использованием техники рекомбинантных ДНК. См., например, работу Frank et al., Peptides: Synthesis Structure - Function, Proc. Seventh Am. Pept. Symp., Eds. D.Riche & E. Gross (1981), которая вводится в настоящее описание посредством ссылки.

Для более наглядной иллюстрации настоящего изобретения приводятся нижеследующие примеры. При этом следует отметить, что указанные примеры не должны рассматриваться как некое ограничение объема настоящего изобретения.

Пример 1
Ацилирование Lys^B28Pro^B29-инсулина человека с использованием N-сукцинимидилпальмитата в ацетонитриле и воде
Кристаллы Lys^B28Pro^B29-инсулина человека (2,22 г) растворяли в 100 мл 50 мМ раствора борной кислоты при pH 2,5. pH раствора доводили до 2,5 с использованием 10% HCl и полученный раствор перемешивали до тех пор, пока все кристаллы, по визуальной оценке, не были полностью растворены. Раствор активированного сложного эфира (N-сукцинимидилпальмитата) получали путем добавления 270 мг твердого активированного сложного эфира к 27 мл ацетонитрила, предварительно нагретого приблизительно до 50^oC, и интенсивного перемешивания до тех пор, пока вое частицы активированного сложного эфира не были растворены (по визуальной оценке). pH раствора доводили приблизительно до 10,22 путем добавления 10% NaOH и раствор перемешивали 15 минут при 4^oC. К раствору с установленным pH добавляли ацетонитрил (73 мл), а затем ранее полученный раствор активированного сложного эфира. Реакцию проводили в течение 85 минут при 4^oC, а затем гасили путем добавления 1 н. уксусной кислоты (600 мл), в результате чего pH раствора составил 2,35. Выход реакции, рассчитанный как количество B28 -N^ε- пальмитоил-Lys^B28Pro^B29-инсулина человека в погашенной реакции по отношению к исходному количеству Lys^B28Pro^B29-инсулина человека составил 72,5%.

Пример 2
C8(B28)Lys^B28Pro^B29-инсулин человека
Кристаллы Lys(B28), Pro(B29)-инсулина человека (КРВ) (2,0 г) растворяли в 200 мл 50 мМ боратного буфера при pH 2,5. Затем pH раствора снова доводили до 2,5 с использованием 10% HCl и полученный раствор перемешивали до тех пор, пока все кристаллы, по визуальной оценке, не были полностью растворены. Раствор активированного сложного эфира (эфир 1-октаноил-N- гидроксисукцинимида) получали путем добавления 175 мг твердого активированного сложного эфира к 25,62 мл ацетонитрила и энергичного перемешивания до тех пор, пока все частицы сложного эфира, по визуальной оценке, не были растворены. pH раствора КРВ доводили приблизительно до 10,4 путем добавления 10% NaOH, после чего раствор перемешивали 5 минут при комнатной температуре. К этому pH-скорректированному раствору КРВ добавляли ацетонитрил (176 мл), а затем добавляли ранее полученный раствор активированного сложного эфира. Реакцию проводили в течение 90 минут при комнатной температуре, после чего гасили путем добавления 5,5 мл 10% HCl (2,75% об./об.) и трех объемов (1200 мл) холодной dH₂O, в результате чего pH раствора составил 2,70. Выход реакции, рассчитанный как количество LysB29(C8) - КРВ в погашенной реакции, по отношению к исходному количеству ВН1, составил 75,5%. Этот раствор разделили на две 800 мл-аликвоты, для очистки с помощью гидрофобной хроматографии (_sP2O_ss)- После проведения колоночной хроматографии осуществляли ультрафильтрацию и лиофилизацию.

Как указывалось выше, аналоги ацилированного инсулина настоящего изобретения могут быть c успехом использованы для лечения гипергликемии путем введения пациенту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества моноацилированного аналога инсулина. Используемый в настоящем описании термин "эффективное количество" означает количество одного или нескольких ацилированных аналогов настоящего изобретения, необходимое для снижения или удержания уровней сахара в крови терапевтически или профилактически. Это количество может составлять от около 10 единиц или более в день (или от около 0,3 до около 2 мг в расчете приблизительно на 29 ед/мг). Однако, следует отметить, что фактическое количество вводимого ацилированного аналога (или аналогов) определяет лечащий врач с учетом соответствующих факторов, включая конкретное заболевание (т.е., заболевание, вызывающее гипергликемию), конкретно вводимый аналог, выбранный способ парентерального введения, возраст, вес и восприимчивость пациента и тяжесть заболевания. Поэтому вышеуказанные интервалы доз не ограничивают объема настоящего изобретения.

Ацилированные аналоги инсулина по настоящему изобретению вводят пациенту, нуждающемуся в таком введении (т.е., пациенту, страдающему гипергликемией), в виде фармацевтических композиций, содержащих эффективное количество, по крайней мере, одного моноацилированного аналога в сочетании с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми наполнителями или носителями. В этих целях могут быть изготовлены фармацевтические композиции, содержащие около 100 ед/мл или аналогичные концентрации эффективного количества ацилированного аналога (или аналогов) инсулина. Эти композиции, которые предназначены, в основном, для парентерального ведения (хотя это необязательно), могут быть получены любым известным способом с использованием стандартных наполнителей или носителей, обычно применяемых для изготовления парентеральных композиций. См., например. Remington s Pharmaceutical Sciences. 17 th Edition, Mack Publishing Company, Easton, PA, USA (185), которое включено в настоящее описание в качестве ссылки. Так, например, лекарственные формы для парентерального ведения могут быть получены путем суспендирования или растворения нужного количества, по крайней мере, одного моноацилированного аналога инсулина в нетоксичном жидком носителе, подходящем для инъекций, таком, как водная среда и стерилизующая суспензия или раствор. Альтернативно, нужное количество соединения может быть помещено во флакон, после чего этот флакон и его содержимое стерилизуют и герметично запаивают. При этом могут прилагаться еще один флакон или носитель для смешивания перед введением. В фармацевтических композициях, предназначенных для парентерального введения, используют разбавители, наполнители и носители, такие как вода и смешиваемые c водой органические растворители, такие, как глицерин, кунжутное масло, арахисовое масло, водный раствор пропиленгликоля, N,N- диметилформамид и т.п. Примерами таких фармацевтических композиций являются стерильные, изотонические, водные физиологические растворы моноацилированного аналога инсулина, которые могут быть забуферены фармацевтически буфером и которые являются апирогенными. Кроме того, парентеральная фармацевтическая композиция может содержать консерванты, такие, как метакрезол или другие агенты для коррекции pH конечного продукта, такие, как гидроксид натрия или соляная кислота.

Ацилированные аналоги инсулина по настоящему изобретению могут быть также изготовлены в виде смесей. Такие смешанные композиции могут содержать неацилированный инсулин или аналог инсулина и ацилированный аналог инсулина. При этом отношение инсулина или аналога инсулина к ацилированному аналогу составляет от 1:99 до 99:1 по массе. Предпочтительное отношение составляет от 75: 25 до 25: 75; более предпочтительное от 40:60 до 60:40, а наиболее предпочтительное 50: 50. Смешанные композиции получают путем смешивания нужных объемов компонентов в стандартном разбавителе для парентерального введения. Такими стандартными разбавителями являются агент, придающий раствору изотоничность, цинк, физиологически приемлемый буфер и консервант. Предпочтительным физиологически приемлемым буфером является фосфатный буфер, такой, как вторичный кислый натрийфосфат. Другим физиологически приемлемым буфером является Трис или ацетат натрия. Выбор буфера и его концентрации может быть осуществлен в соответствии с традиционной практикой. Фармацевтически приемлемыми консервантами являются фенол, м-крезол, ресорцинол и метил-парабен. Смешанные композиции по настоящему изобретению являются особенно предпочтительными, поскольку относительно быстродействующий инсулин и его аналог и моноацилировнный аналог инсулина растворяются в композиции. Это позволяет предвидеть продолжительность профиля действия композиции.

Нижеследующий пример композиции приводится лишь в целях иллюстрации и не должен рассматриваться как некое ограничение объема изобретения.

Композиция 1
Парентеральная композиция может быть получена следующим образом:
Фенол, мМ - 30
Глицерин, мг/мл - 16
Ацилированный Lys^B28Pro^B29-инсулин человека, ед - 100
Цинк, % - 0,7
Ацетат натрия, мг/мл - 3,8
Раствор вышеуказанных ингредиентов вводят путем инъекции пациенту, нуждающемуся в лечении.

Для иллюстрации эффективности соединений по настоящему изобретению, B28 -N^ε- пальмитоил-Lys^B28Pro^B29-инсулин человека исследовали на модели обученных собак. В проведенных экспериментах участвовали взрослые (в возрасте 1-2 года) коротконогие гончие (самки и самцы) весом 8-15 кг, которым в течение ночи не давали пищу. По меньшей мере, за 10 дней до исследований животных анестезировали изофлураном и делали веносекцию в паховой области с левой или с правой стороны. Катетеры из силастика вводили в бедренную артерию и в проксимальную каудальную бедренную вену и скрепляли шелковой нитью 4-0. Свободные концы катетеров пропускали подкожно к спине с использованием трокара. Затем катетеры наполняли раствором глицерина/гепарина (3:1, об./об. ; конечная концентрация гепарина - 250 ед/мл), а свободные концы зажимали и помещали в подкожный карман так, чтобы они были полностью закрыты кожей. Для предупреждения инфекции вводили Keflex, как до операции (20 мг/кг, вв и 20 мг/кг, вм), так и после операции (250 мг, по одному разу в день в течение 7 дней). Для снятия боли после операции вводили торбугезик (1,5 мг/кг, вм).

Для оценки состояния здоровья животного непосредственно за день до проведения эксперимента у животных брали пробы крови. В экспериментах использовали лишь животных, у которых гематокриты составляли выше 38%, а число лейкоцитов составляло менее 16000/мм³. После полудня за день до эксперимента свободные концы катетеров вынимали из подкожного кармана путем небольшого разреза, сделанного под местной анестезией (2% лидокаин), и собакам одевали комплект из корсета с привязью и ошейника.

Утром, в день эксперимента, содержание артериального катетера отсасывали (в этих исследованиях использовали только артериальный катетер), катетер промывали физиологическим раствором, а затем удлиненная трубка (защищенная стальной привязью) присоединялась к катетеру. Собак помещали в метаболическую клетку и катетер c удлиненной трубкой присоединяли к шарнирной системе, так, чтобы собаки могли свободно передвигаться по клетке. После 15-минутного отдыха (для контрольных собак - 45 минут) брали пробы крови для определения концентрации глюкозы в плазме. Второй базовый образец брали на 15 минут позже (время 0). Испытуемое соединение (забуференный фосфатом физиологический раствор или 10,5 ммоль/кг B28 -N^ε- пальмитоил-Lys^B28Pro^B29-инсулин человека; это соответствует молярному эквиваленту 1,75 ед/кг инсулина человека) вводили подкожно в заднюю часть шеи.

Затем, по меньшей мере, каждые 30 минут в течение последующих 2-х (контроль) - 6-ти (B28 -N^ε- пальмитоил-Lys^B28Pro^B29-инсулин человека) часов брали пробы артериальной крови. Полученные пробы собирали в герметично закрывающиеся пробирки коллектора для сбора крови, содержащие динатрий-ЭДТА, и сразу помещали на лед. После этого пробы центрифугировали и полученную плазму переносили в полипропиленовые лабораторные пробирки, где ее хранили на льду, или помещали в холодильник на все время исследования.

В конце эксперимента животных анестезировали (изофлураном), катетер промывали свежим физиологическим раствором и наполняли смесью глицерина/гепарина, а свободный конец катетера зажимали и помещали подкожно, как описано выше; и вводили антибиотик (300 мг Keflex, вм). Концентрации глюкозы в плазме определяли в день эксперимента по методу с использованием глюкозооксидазы в глюкозном анализаторе Бекмана. Величины выражали как средние значения ± стандартные отклонения от среднего (sEM).

После инъекции забуференного фосфатом физиологического раствора концентрация глюкозы в плазме по сравнению с базовой концентрацией заметно не изменялась за двухчасовой период наблюдения (таблица 1). За этот же период времени, после подкожного введения B28 -N^ε- пальмитоил-Lys^B28Pro^B29-инсулина человека наблюдалось 15%-ное (17 мг/дл) снижение концентрации глюкозы в плазме. Концентрация глюкозы в плазме у животных, которым был введен B28 -N^ε- пальмитоил-Lys^B28Pro^B29-инсулин человека, продолжала постепенно падать еще в последующие 4 часа, и через 6 часов после инъекции уровень глюкозы опустился ниже базового уровня и составил 41 мг/дл (35%-ное снижение).

Из литературы известно, что концентрации глюкозы в крови у нормальных собак заметно не снижаются даже после недельного голодания. Такое снижение уровня глюкозы, наблюдаемое в этом эксперименте, обусловлено введением B28 -N^ε- пальмитоил-Lys^B28Pro^B29-инсулин человека, что свидетельствует о инсулиноподобной активности этого соединения.

Изобретение относится к области медицины, в частности касается лечения диабета. Более конкретно настоящее изобретение относится к мономерному аналогу инсулина, где цепь А является натуральной последовательностью цепи А инсулина человека, а цепь В является модифицированной в любом из положений В28 и В29 или в обоих положениях. Указанный аналог является моноацилированным у N - конца цепи А или цепи В, или в лизине. Ацилированные аналоги инсулина обладают пролонгированным действием, что является техническим результатом изобретения. 4 с. и 8 з.п.ф-лы, 1 табл.

1. Моноацилированный аналог инсулина формулы SEQ ID NO : 1, указанной в описании, соответствующим образом сшитый с последовательностью SEQ ID NO : 2, указанной в описании, или его фармацевтически приемлемая соль. 2. Моноацилированный аналог инсулина по п.1, где Xaa в положении 28 последовательности SEQ ID NO : 2 представляет собой ацилированный Lys, а Xaa в положении 29 последовательности SEQ ID NO : 2 представляет Pro. 3. Моноацилированный аналог инсулина по п.2, где ацилирующей группой является C₆ - C₁₇-жирная кислота. 4. Моноацилированный аналог инсулина по п.2, где ацилирующей группой является C₁₃ - C₁₇-жирная кислота. 5. Моноацилированный аналог инсулина по п. 1, представляющий собой B28-N^ε-пальмитоил-Lys^B28Pro^B29-инсулин человека. 6. Моноацилированный аналог инсулина по п. 1, представляющий собой B28-N^ε-миристоил-Lys^B28Pro^B29-инсулин человека. 7. Моноацилированный аналог инсулина по любому из пп.1 - 6, предназначенный для его использования при лечении сахарного диабета. 8. Фармацевтический препарат для парентерального введения, содержащий эффективное количество моноацилированного аналога инсулина по любому из пп.1 - 6 вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми консервантами, агентами, придающими изотоничность, или буферами. 9. Фармацевтический препарат для парентерального введения по п.8, содержащий смесь инсулина или аналога инсулина и моноацилированного аналога инсулина по любому из пп.1 - 6, где соотношение по массе между двумя компонентами составляет около 1 - 99 : 99 - 1. 10. Фармацевтический препарат для парентерального введения по п.9, где указанная смесь содержит Lys^B28Pro^B29-инсулин человека и B28-N^ε-ацилированный Lys^B28Pro^B29-инсулин человека. 11. Способ лечения пациента, страдающего гипергликемией, который включает введение фармацевтического препарата по п.8. 12. Способ получения фармацевтического препарата для парентерального введения, который включает смешивание соединения по любому из пп.1 - 6, агента, придающего изотоничность, и физиологически приемлемого буфера.