СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭНЕРГИИ ТАКСИСА ЛЕЙКОЦИТОВ Российский патент 2000 года по МПК G01N33/53 G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано в клинических, иммунологических, научно-исследовательских лабораториях.

Известным фактом является, что лейкоциты являются эффекторным звеном как специфического, так и неспецифического иммунитета и функциональная активность лейкоцитов может служить важной характеристикой состояния иммунной системы [1,2].

Функциональную активность лейкоцитов чаще всего измеряют в относительных единицах (проценты, условные единицы). Примером может служить реакция торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ), сущность которой заключается в подавлении миграционной активности лейкоцитов (оцениваемой по их суточному пробегу) под воздействием антигенов или митогенов. Индекс торможения миграции лейкоцитов (ИТМЛ), показатель, определяемый методикой, оценивается в процентном изменении длины пробега лейкоцитов под воздействием антигена/митогена по отношению к исходному пробегу (без антигенной стимуляции) [3].

Ранее нами предложен "Способ определения функциональной активности лейкоцитов периферической крови" (Авторы Шевченко Т.Ф., Песков А.Б. Патент РФ N2033612, приоритет от 18.10.91), который позволяет оценивать двигательную активность лейкоцитов периферической крови в единицах системы СИ - Джоулях (Дж). Указанный способ принят нами за прототип предлагаемого изобретения. Способ определения функциональной активности лейкоцитов периферической крови, обладая рядом достоинств, в частности, прогностической значимостью в области пульмонологии, имеет следующие недостатки:
1. Требует значительного необходимого объема крови для исследования (5 мл), поэтому забор для постановки теста может осуществляться только путем венепункции, что затрудняет возможность частого повторения теста для динамического наблюдения.

2. Не дает возможности исследования других, кроме крови, тканей, содержащих лейкоциты.

3. Не дает достаточной точности при исследовании функциональной активности лейкоцитов при некоторых заболеваниях в частности, при опухолевых заболеваниях системы крови.

Предлагаемый способ определения энергии таксиса лейкоцитов" (далее способ) позволяет преодолеть указанные недостатки и осуществляется следующим образом.

Любым из известных способов [2,4] производят выделение лейкоцитов из исследуемой ткани. При исследовании крови или костного мозга (стернальный пунктат) достаточно 0.1-0.2 мл ткани. Лейкоциты однократно отмывают физиологическим раствором. Если ткань содержит значительное количество эритроцитов (кровь, костный мозг), допустимо не отделять эритроциты от лейкоцитов. В противном случае к лейкоцитарной взвеси добавляют 0.2 мл аутологичной эритромассы. К полученной взвеси в отношении 1:1 добавляют моделирующий раствор, являющийся физиологичным для лейкоцитов и по своим физическим свойствам близкий к ньютоновской жидкости. Полученный субстрат раскапывают в лунки иммунологического планшета. Затем производят набор суспензии в тонкостенные стеклянные капилляры (внутренний диаметр 1 мм, длина 4.5-5 см, количество, необходимое для одного анализа, равно 20) до середины и запаивают с противоположной стороны. Капилляры центрифугируют (запаянным концом вниз) 10 минут при 1500 об/мин, затем помещают в термостат (37^oC) так, что 5 капилляров (контроль) размещают строго вертикально в специальном штативе, оставшиеся 15 капилляров (опыт) устанавливают в угловой ротор, позволяющий изменять частоту вращения, разделив на 3 серии по 5 капилляров в каждой, причем каждая серия удалена на разные шаговые расстояния от центра вращения ротора, что соответствует разным угловым ускорениям, изменяющимся на шаговую величину. Благодаря изменяемым параметрам частоты вращения ротора и радиуса вращения, векторная сумма ускорения силы тяжести и углового ускорения ротора должна варьировать в пределах 1-6 g (при ускорении, меньшем 1 g, величины лейкоцитарных облаков в опытных и контрольных сериях достоверно не различаются; при ускорении, превышающем 6 g, лейкоцитарное облако в капиллярах опытной серии настолько мало, что практически не поддается измерению). При вращении ротора капилляры должны быть свободно подвижны относительно горизонтальной оси. Время инкубации капилляров в термостате при 37^oC - 24 часа при постоянно включенном роторе. После инкубации капилляры вынимают и с помощью микроскопа, используя окуляр со шкалой для измерения микрообъектов, измеряют длины лейкоцитарных облаков, образующихся на границе осевших при центрифугировании эритроцитов с моделирующим раствором вследствие спонтанного таксиса лейкоцитов.

Параллельно описанному способу методом традиционной микроскопии или с помощью счетчика форменных элементов крови рассчитывают лейкоцитарную формулу.

Оценку энергии таксиса лейкоцитов (ЭТЛ) производят по специально разработанной формуле, учитывающей вышеописанные параметры инкубации, особенности взаимодействия клеток и некоторые физиологические константы.

Показана значимость показателя (ЭТЛ) для прогнозирования риска хронизации острых бронхитов [5-8]. Изучены особенности ЭТЛ при некоторых других заболеваниях, в частности, при острой пневмонии и муковисцидозе у детей [9,10].

При постановке нами теста согласно прототипу и согласно предполагаемому способу результаты оказывались достоверно идентичными в отношении больных острым и хроническим бронхитом, бронхиальной астмой. Однако прототип оказался неприемлемым для оценки ЭТЛ у больных с опухолевыми заболеваниями крови, в частности, с хроническим миелолейкозом (ХМЛ). Нами проводится исследование по динамической оценке ЭТЛ костного мозга и периферической крови этих больных без лечения и на фоне терапии цитостатиками. На чертеже представлены величины ЭТЛ периферической крови больных ХМЛ в зависимости от стадии заболевания. Как видно из чертежа, в терминальной стадии ЭТЛ превосходит норму на 2 порядка, что соответствует гигантским, хорошо видимым глазом лейкоцитарным облакам в капиллярах, причем величины этих облаков в опытной и контрольных сериях достоверно не различаются более чем у половины больных из-за высокой энергетической активности лейкоцитов и малого углового ускорения ротора в прототипе. Соответственно, рассчитать ЭТЛ при этих условиях не представляется возможным. Данные, представленные на чертеже, удалось получить, используя угловые ускорения 3-4 g.

Следует отметить, что применение в исследовании моделирующего раствора вместо плазмы в качестве среды для миграции лейкоцитов существенно снизило количество "выбраковываемых" капилляров при считывании теста, чем повысило достоверность полученных результатов ("выбракованными" мы называем капилляры, измерить длину лейкоцитарного облака в которых невозможно из-за неправильной его формы). При постановке теста по прототипу в среднем "выбраковывается" 20-25% капилляров, с использованием моделирующего раствора - 4-8%. Кроме того, при динамических исследованиях ЭТЛ периферической крови больные зачастую (по нашим данным, более чем в 30% случаев) отказываются от повтора венепункций, соглашаясь на повторные заборы крови из пальца.

Использование моделирующего раствора вместо плазмы крови в качестве среды для движения лейкоцитов позволило стандартизировать условия движения клеток у разных пациентов.

Таким образом, предлагаемый способ по сравнению с прототипом:
1. Расширяет сферу применения теста, делая возможность измерения ЭТЛ в практически любой лейкоцитосодержащей ткани.

2. Повышает точность определения параметра.

3. Делает более доступными и менее травматичными для больных динамические исследования показателя.

ЛИТЕРАТУРА
1. Клиническая иммунология и аллергология. В 3 т.: Пер. с нем. /Под ред. Л. Йегера. - М.,1990. - 3 т.

2. Лебедев К.А., Понякина И.Д. Иммунограмма в клинической практике. - М. , 1990. - 224 с.

3. Артемова А.Г. //Бюллетень экспериментальной биологии. - 1973. - N 10. -C. 67.

4. Лимфоциты. Методы: Пер. с англ. //Под ред. Дж. Клауса. - М., 1990. - 393 с.

5. Песков А.Б. Прогнозирование риска хронизации острых бронхитов методом оценки функциональной активности лейкоцитов. Дисс.канд. мед.наук. - Караганда, 1996. - 130 с.

6. Черданцев А.П. Изменения иммунного и гормонального статуса при острых бронхитах у детей и их магнито-инфракрасно-лазерная терапия.- Дисс. канд. мед. наук. - Самара, 1997. -183 с.

7. Песков А.Б. Динамика показателя энергии таксиса лейкоцитов при различных формах острого бронхита. //Материалы II Международного конгресса пульмонологов Центральной Азии. -Алматы, 1996. - N 60.

8. Иванова Р. Л., Песков А.Б. К вопросу о возможности применения лазеротерапии для предотвращения хронизации острого бронхита.//Там же. - N 146.

9. Kuselman A. I. et al. Leucocyte taxis energy respiratory diseases //13th European Immunology Meeting. - Amsterdam, June, 1997.

10. Peskov A. B., Ivanova R.L. New index of non-specific resistance of the orqanism.//International Journal On Immunorehabilitation. - May 1996, N 2.

Способ может быть использован в области медицины, в частности в иммунологии. Выделяют лейкоциты из тканей, добавляют к ним аутологичные эритроциты и моделирующий раствор, полученную суспензию клеток центрифугируют в стеклянных капиллярах, причем первую часть капилляров инкубируют в вертикальном штативе, вторую часть - в угловом роторе, при этом вторую часть подразделяют на серии, располагая каждую из серий на разном удалении от центра вращения, производят подсчет лейкоцитарной формулы с последующим расчетом оценочного показателя. Способ обеспечивает повышение точности определения и является более доступным и менее травматичным. 1 ил.

Способ определения энергии таксиса лейкоцитов, включающий отделение клеточных элементов суспензии тканей, инкубации их в течение 24 ч при 37^oC в тонкостенных капиллярах в вертикальном положении (контрольная серия) и в угловом роторе при непрерывном вращении (опытные серии) с последующим измерением длин лейкоцитарных облаков и вычислением показателя функциональной активности, отличающийся тем, что отделение клеточных элементов заключается в выделении лейкоцитов, добавлении к ним аутологичных эритроцитов и моделирующего раствора, а центрифугирование опытных серий осуществляют одномоментно при ускорениях 1 - 6q.