СПОСОБ ОЦЕНКИ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ЛЕЙКОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ Российский патент 1995 года по МПК G01N33/48 G01N33/49 

Изобретение относится к медицине, а именно к физиологии, и может быть использовано в клинических, гематологических и научно-исследовательских лабораториях.

Широко известно, что лейкоциты, участвуя в различных воспалительных, иммунных процессах, изменяют свое функциональное и морфологическое состояние, и это может служить критерием как характера процесса, так и степени его активности или тяжести.

Известны способы определения функциональной активности лейкоцитов по степени фагоцитоза, фагоцитарному числу, по показателю хемотаксиса лейкоцитов, по коэффициенту торможения миграции лейкоцитов в реакции торможения миграции лейкоцитов РТМЛ.

Параметры, определяемые в способах, связанных с фагоцитозом, определяют активность лейкоцитов по отношению к чужеродным объектам (микробам, частицам латекса и др. ), а именно способность к захвату частицы и внутриклеточному перевариванию ее. Технически это реализуется при инкубации суспензии лейкоцитов с фагоцитируемыми микробами и последующим подсчетом фагоцитирующих лейкоцитов, времени переваривания микробных тел и т.п. Чем выше фагоцитарная активность, тем выше функциональная активность лейкоцитов.

Способ определения хемотаксиса лейкоцитов основан на способности лейкоцитов к направленному движению к хемоаттрактанту (например, к казеину) и реализуется при инкубации лейкоцитов в камере, отделенной пористым фильтром от камеры с хемоаттрактантом. Подсчитывая число лейкоцитов в порах фильтра, определяют степень хемотаксиса.

Функциональная активность лейкоцитов может быть определена в РТМЛ с митогеном (конканавалин А, фитогема- гглютинин). Способ основан на выделении лимфоцитами фактора, ингибирующего миграцию лейкоцитов. Этот способ наиболее близок к предлагаемому по техническому решению. РТМЛ реализуют следующим образом: гепаринизированную кровь помещают в тонкостенные капилляры, причем в половине капилляров (опытной) в кровь добавлен митоген, а в другой половине (контрольной) физиологический раствор в том же объеме. Затем кровь разделяют на плазму и форменные элементы центрифугированием и инкубируют 24 ч при 37^оС, а затем под микроскопом производят измерение длин лейкоцитарных облаков, образующихся вследствие движения лейкоцитов на границе форменные элементы плазма. Произведя усреднение полученных величин в опытной и контрольной сериях, рассчитывают индекс торможения миграции лейкоцитов (ИТМЛ) по формуле
ИТМЛ 1 × 100%, где 0 длина лейкоцитарного облака в опытных капиллярах;
К длина лейкоцитарного облака в контрольных капиллярах Нормой считают диапазон значений ИТМЛ от 15 до 40%
Недостатком перечисленных способов является невозможность измерения функциональной активности в абсолютных единицах, а следовательно, невозможность точного сравнения данных, полученных при использовании различных способов оценки функциональной активности лейкоцитов и даже различных модификаций одного способа.

Задачей изобретения является оценка функционального состояния лейкоцитов с точки зрения величины энергии, затрачиваемой лейкоцитами на движение с момента забора крови до момента гибели лейкоцита. При этом энергия (W) измеряется в стандартных единицах Джоулях. W может использоваться как энергетическая харак- теристика лейкоцита для описания различных физиологических и патологических состояний организма, а также для прогнозирования течения острых воспалительных заболеваний. В частности, показана значимость способа для прогно- зирования риска хронизации острого бронхита.

Способ осуществляют следующим образом: берут 5 мл свеженабранной гепаринизированной крови (25 ед. гепарина на 1 мл крови), 4 мл крови ставят на 1 ч в термостат 37^оС, оставшуюся кровь раскапывают в лунки иммунологического планшета, набирают в капилляры (диаметр 1 мм, длина 4,5.5 см) до середины, запаивают с обратной стороны. Для каждой пробы необходимо набрать по 20 капилляров. Капилляры (запаянным концом вниз) центрифугируют 10 мин при частоте вращения 1500 об/мин, затем помещают в термостат (37^оС) так, что 10 капилляров (серия 1) размещают строго вертикально (в штативе, запаянными концами вниз), другие 10 капилляров (серия 2) устанавливают в угловой ротор (частота вращения 77 об. /мин, радиус 15 см). Длительность инкубации 24 ч (ротор постоянно работает).

После инкубации капилляры вынимают и с помощью микроскопа (окуляр 8х, со шкалой для измерения микрообъектов, объектив 20х) измеряют длины лейкоцитарных облаков, образующихся вследствие таксиса лейкоцитов на границе эритроциты-плазма, аналогично считыванию результатов в способе-прототипе. Затем производят расчет среднего арифметического в обеих сериях капилляров.

Расчет энергии производится по формуле
W · · V_#· g · (ρ_#-ρ_ж)·( 1), где l₁ средняя длина облака в 1 серии;
l₂ средняя длина облака во 2 серии;
ρ_ж плотность плазмы крови;
ρ_# средняя плотность лейкоцита;
g ускорение свободного падения;
V_# средний объем лейкоцита;
W энергия, затраченная лейкоцитом на движение (показатель функциональной активности).

В оставшихся 4 мл крови после осаждения форменных элементов производят измерение плотности плазмы стандартным ариометром. Параллельно любым из известных способов подсчитывают лейкоцитарную формулу.

Расчет среднего объема лейкоцита производят по формуле
V_# · πd3#

Средний диаметр и среднюю плотность лейкоцитов рассчитывают соответственно по формулам
d_#;
ρ_# где n_л, n_м, n_н, n_б, n_э соответственно процентное содержание в крови лимфоцитов, моноцитов, нейтрофилов, базофилов и зозинофилов. Плотности и диаметры перечисленных клеток приняты за физиологические константы, практически не изменяющиеся при различных физиологических и патологических процессах и равные соответственно:
Плотность лимфоцитов, моноцитов 1,077 г/см³;
Плотность нейтрофилов, эозинофилов, базофилов 1,082 г/см³(колебания порядка 0,001 г/см³);
Диаметр лимфоцитов 10 мкм;
Диаметр моноцитов 12 мкм;
Диаметр нейтрофилов, базофилов, эозинофилов 10 мкм (колебания порядка 2. 3 мкм).

Теоретический вывод предлагаемой формулы.

На каждый лейкоцит лейкоцитарного облака капилляра из 1 серии действуют 3 силы (фиг.1):
F_A выталкивающая со стороны плазма;
mg тяжести;
F_c сопротивления, представляющая собой сумму сил взаимодействия лейкоцита со средой (плазма, стенки капилляра, другие клетки).

В лейкоцитарном облаке достаточно большое количество лейкоцитов, чтобы можно было говорить об "усредненном" лейкоците, движущемся прямолинейно, имеющем средние размеры и массу.

На фиг. 2 изображен капилляр из 2 серии, находящийся в угловом роторе. Угловое ускорение в капиллярах:
a ω²R=4π²ν²R≈ g Равнодействующая сил направлена вдоль капилляра и соответственно вдоль движения "усредненного" лейкоцита. Обозначим геометрическую сумму и как .Выталкивающая сила в капиллярах 1 серии:
F_A ρ_ж V_# g (1) где ρ_ж плотность плазмы;
V_# объем лейкоцита;
g ускорение свободного падения; в капиллярах 2 серии:
F_A' ρ_ж V_# a_p (2) Масса лейкоцита:
m V_# ρ_# (3)
a_p ≈ g (4) Лейкоциты, начиная движение в капилляре, образуют "облако". "Усредненный" лейкоцит пройдет путь, равный половине длины "облака" (здесь и далее имеется в виду облако, остановившееся в размерах, т. е. в котором лейкоциты уже истратили свою энергию. Такое облако получается в результате 24-часовой инкубации см.табл.1).

Начиная свой путь в капилляре, лейкоцит имеет уровень энергии W W_o. Обстановка обозначает, что энергия истрачена (W 0). Составим энергетические уравнения для 1 и 2 серий капилляров:
W mgl₁+ F_cl₁- F_Al₁ (5)
W ma_pl₂+ F_cl₂- Fl₂ (6)
Разpешая совместно уравнения (1).(6), получим приведенную выше формулу.

Проведены исследования по определению показателя функциональной активности (W) у клинически здоровых людей, больных острым и хроническим бронхитом. Для исследования были отобраны лица мужского пола в возрасте 20.25 лет, так как в ходе исследования было установлено, что на W существенно влияют возраст и пол обследуемого.

Клинически здоровые (10 человек) подвергались 3-кратному забору крови в течение недели: 2 раза в утренние часы натощак и 1 раз через 2-3 ч после приема пищи. Было выявлено, что уровень W составляет в норме для данной возрастной группы 5,45 ± 0,8х x10^-14 Дж. Также установлено, что пищеварение существенно влияет на W, повышая его в среднем на 1,2.1,5 раза в 75% случаев (см.табл.2).

У больных острым бронхитом (табл.3) уровень W измерялся на 1,5,9,13,17,21 день от начала заболевания, у больных хроническим (табл.4) на 1,5,9 (обострение) и 21,25 день (ремиссия).

Больных острым бронхитом обследовано 25, хроническим 19. Установлено, что у больных острым бронхитом уровень W в начале заболевания в 2-2,5 раза выше, чем в контрольной группе, составляя 11,3_-2,8^+5,1х x10^-14 Дж, по мере выздоровления он снижается и достигает уровня контрольной группы на 13.17 день от начала заболевания. У девяти больных (в таблице отмечены звездочкой) в начале заболевания отмечалось незначительное повышение уровня W на 10.15% или даже некоторое снижение ее с последующим значительным снижением на 20. 25% ниже нормы и сохранением такового. У восьми из них зарегистрирована хронизация процесса (повторное обострение через 2.3 недели после клинического выздоровления).

У больных хроническим бронхитом наблюдалось значительное снижение (по сравнению с контрольной группой) уровня W на 30-40% что составляло 2,0.3,0х x10^-14 Дж и некоторый подъем W в периоды обострения (до 4,0.7,0х10^-14 Дж).

Проведенные исследования позволяют сделать следующие выводы:
Средний уровень показателя функциональной активности лейкоцитов (W) у клинически здоровых мужчин в возрасте 20.25 лет при заборе крови из локтевой вены составляет 5,45 ± 0,8х10^-14 Дж.

На уровень показателя W существенное влияние оказывают физиологические процессы (в частности, пищеварение).

У больных острым бронхитом уровень W повышен в 2.2,5 раза по сравнению с контрольной группой, составляя 11,3_-2,8^+5,1х x10^-14 Дж, снижение до нормы происходит на 13.17 день заболевания.

Прогностический критерий: при установленном диагнозе "Острый бронхит" и уровне W в первые дни заболевания ниже, чем 5,9.6,2х10^-14Дж высока вероятность хронизации процесса (в данном исследовании 88%).

У больных хроническим бронхитом уровень W постоянно снижен, составляя 2,0. 4,0х10^-14 Дж, при обострении незначительно возрастает, оставаясь ниже нормальной в среднем на 10.15%
Таким образом, способ позволяет:
проследить за уровнем показателя функциональной активности лейкоцитов (W), как одного из физиологических параметров, в эксперименте;
обладает прогностической значимостью, определяя возможность хронизации острых воспалительных процессов, в частности, острого бронхита.

При простоте, удобстве и высокой информативности способа он требует минимум материальных затрат и может быть использован в практически любой клинической или исследовательской лаборатории.

Использование: в медицине. Сущность изобретения: изменяют длины лейкоцитарных облаков в двух сериях капилляров, заполненных отцентрифугированной гепаринизированной кровью, инкубируемых в термостате, причем 1-я серия инкубируется в вертикальном положении, 2-я - во включенной центрифуге, проводят измерения плотности плазмы, подсчет лейкоцитарной формулы с последуюшим расчетом оценочного показателя по формуле , где l₁ средняя длина облака в первой половине капилляров; l₂ средняя длина облака во второй половине капилляров; ρ_ж плотность плазмы крови; ρ_# плотность лейкоцитов /средняя/; g-ускорение свободного падения; V_# средний объем лейкоцита; W - показатель функциональной активности лейкоцитов, причем при отклонении показателя от 5,45 ± 0,8×10^-14 Дж, функциональное состояние лейкоцитов считается измененным. 2 ил., 4 табл.

СПОСОБ ОЦЕНКИ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ЛЕЙКОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ, включающий отделение клеточных элементов центрифугированием в тонкостенных капилляра, инкубации в течение 24 ч при 37^oС с последующим измерением длин лейкоцитарных облаков и вычислением показателя функциональной активности, отличающийся тем, что первая половина капилляров инкубируется в вертикальном положении, вторая центрифугируется в угловом роторе радиусом 15 см с частотой вращения 77 об./мин, а оценочный показатель рассчитывают по формуле

где g ускорение свободного падения;
l₁ средняя длина лейкоцитарного облака в первой половине капилляров;
l₂ средняя длина лейкоцитарного облака во второй половине капиляров;
ρ_ж плотность плазмы крови;
ρ_# плотность лейкоцитов (средняя);
V_# средний объем лейкоцита;
W показатель функциональной активности лейкоцитов,
причем при отклонении показателя от 5,45 ± 0,8 · 10^-14 Дж функциональное состояние лейкоцитов считается измененным.