БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНАЯ ДОБАВКА К ПИЩЕ Российский патент 2000 года по МПК A23L1/30 A61K31/00 

Изобретение относится к медицине, сельскому хозяйству, пищевой промышленности и может быть использовано в качестве биологически активной добавки к пище человека и кормам для животных.

Известны биологически активные добавки (БАД) к пище в виде многокомпонентных смесей с использованием, например, никотиновой кислоты ("Стресстабс") [Справочник ВИДАЛЬ, Лекарственные препараты в России: Справочник-М.: Астра Фарм Сервис, 1995, с.838].

Известные БАД повышают устойчивость организма к действию стресс-факторов, но их недостатком является побочное действие - возможны реакции повышенной чувствительности к отдельным компонентам используемой смеси.

Известна БАД, содержащая комплекс аминокислот, витаминов и питательных веществ [Биологически активные добавки к пище, VITAMIRAL L.L.C., Москва, 1998 г., с.70].

Указанная известная БАД имеет узкую область применения и используется только для поддержания нормального функционирования головного мозга.

Техническим результатом заявленного изобретения является БАД к пище, обладающая широким спектром действия на организм, в частности выраженным антиоксидантным имуннокоррегирующим мембраностабилизирующим действием.

Указанный результат достигается тем, что в биологически активной добавке (БАД) к пище в качестве биологически активной составляющей используют синтетический фитогормон - трекрезан (трис-(2-оксиэтил) -аммоний-о-крезоксиацетат), разрешенный к применению Фармкомитетом Минздрава РФ (Приказ N 151 от 2 6.07.94, ФС 42-3849-99).

Предложенный БАД (с рабочим названием "Байкалин" принимают длительное время в физиологически активной дозе 50 мг, 2 раза в день из расчета на вес взрослого человека приблизительно 60-70 кг (0,1- 1 мг/кг веса). Для сравнения терапевтическая доза трекрезана составляет 600 мг в течение суток. БАД изготавливают в виде порошка или таблеток. При этом в качестве вспомогательных (формообразующих) составляющих в БАД могут быть использованы, например, молочнокислый сахар (лактоза), крахмал картофельный, стеариновокислый кальций, натрий хлористый, тальк, аэросил, белая глина, корень солодки, поливинилпирромедон и др.

Ниже приводятся примеры исследования физиологической активности созданного в соответствии с изобретением БАД и результаты его клинической апробации.

Пример 1. Исследование антистрессовой активности
Исследования были выполнены на базе лаборатории фармакологии Иркутского института органической химии в 1990 г.

В таблице 1 представлены сравнительные данные, полученные на белых лабораторных мышах при использовании созданного в соответствии с изобретением БАД и собственно препарата трекрезан. Исследуемые вещества вводили внутрибрюшинно (в водном растворе или в растворе димексида).

Анализ данных показал, что БАД даже при однократном введении белым мышам (18-21 г) проявила четкую антистрессовую активность, лишь в ряде тестов уступая препарату трекрезан по силе действия. В то же время некоторые показатели (устойчивость к гемической гипоксии, к высокой температуре) свидетельствуют о преимущественном воздействии малой физиологической дозы БАД -0,5 мг/кг.

Пример 2. Исследование стресс-протективных свойств созданного в соответствии с изобретением БАД в хроническом эксперименте. Исследования выполнены на базе исследовательской лаборатории 000 "Флора-Си" (г. Балашиха, Московской области) в 1997 г.

Исследовалось действие БАД на лабораторных животных при хроническом ее приеме в дозе 0,5 мг/кг. Для сравнения животные получали препарат трекрезан в дозе 5 мг/кг, что равно приблизительно 0,5 терапевтической суточной дозы. Исследуемые вещества применяли в виде порошка, добавляемого к воде и пище, или они вводились внутрибрюшинно (в водном растворе).

В эксперименте использована модель конфликтной ситуации, которая создается столкновением 2 рефлексов - питьевого и оборонительного - путем пропускания электрического тока (при напряжении 80B) через поилку. Опыт начинается с тренировки у крыс чувства жажды и навыка взятия воды из поилки в камере. Животные содержатся на сухом корме в течение 48 ч, затем в одно и то же время суток на протяжении трех дней крыс помещают в камеру, где они получают воду из поилки в течение 10 мин. В день опыта через 5 с после начала питья крысам наносится электрическое раздражение. В течение 20 мин регистрируются показатели поведения крыс: количество взятия воды, число подходов к поилке и величина общей двигательной активности, определяемой по частоте пересечения контрольной линии. Показатели фиксировали счетчиками типа ФЭУ. Использованы белые беспородные крысы-самцы массой 160-170 г.

Данные исследований представлены в таблице 2.

Отмечено увеличение числа подходов к поилке почти в 1,5 раза при приеме БАД и в 2 раза при приеме трекрезана, а количество взятий воды возрастает соответственно на 23 и 40% по сравнению с контролем, что свидетельствовало о снижении уровня тревоги у подопытных животных.

Исследования действия препарата трекрезан и БАД на поведение мышей в условиях эмоционального стресса проводили на мышах-самцах массой 18-21 г в течение 10 дней при свободном выпаивании. В тесте "Открытое поле" стресс-ситуацию создавали включением четырех ламп мощностью 60 Вт. Поведение животных по ориентировочно-исследовательской реакции фиксировалось в течение 3 мин визуально на открытой площадке 40х40 см по следующим параметрам: вертикальная двигательная активность (стойки), горизонтальная двигательная активность (переход с квадрата на квадрат) и "норковый рефлекс" (заглядывание в отверстия).

Данные исследований представлены в таблице 3.

Полученные результаты свидетельствовали, что ориентировочно-исследовательские реакции в опытных группах мышей не только не уменьшились, но и превышали показатели интактных животных.

Исследования показали, что длительное использование созданного в соответствии с изобретением БАД оказывает защитное действие в условиях воздействия стресс-факторов.

Данные исследований действия БАД по тестам оценки психотропной активности на мышах представлены в таблице 4.

Данные показали отсутствие выраженного психотропного действия при использовании предложенного БАД.

Пример 3. Исследование антиоксидантного и мемранстабилизирующего действия БАД
Эксперименты выполнены на базе исследовательской лаборатории 000 "Флора-Си" (г. Балашиха, Московская область) и Тернопольского медицинского института в 1998-1999 г.

В экспериментах in vivo изучено антиоксидантное действие БАД на модели иммобилизационного стресса. При этом БАД в дозе 0,5 мг/кг применялся в виде порошка, добавляемого к питью животным (в свободном режиме употребления жидкости 300 мг на 10 животных) в течение 14 дней. Интактная и контрольная (стресс) группа животных получали обычную водопроводную воду. Животных (крысы-самцы 200-220 г) подвергали 6-часовой жесткой иммобилизации на спине на специальном лабораторном столике, при этом на животных воздействовали электрическим током подпороговой чувствительности. Через 2 ч опытных животных декапитировали.

В сыворотке крови и печени регистрировали уровень основных продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) - малонового диальдегида (МДА), гидроперекиси липидов (ГП) и уровень МДА, инициированный ионами двухвалентного железа (МДА+ Fe²⁺)
[Современные методы в биологии. - М.: Медицина, 1976 г., С.62-66].

Результаты анализов по уровню продуктов ПОЛ у опытных животных свидетельствуют о защитном эффекте предложенного БАД при хроническом приеме в течение двух недель и представлены в таблице 5.

Известно, что при различных видах физико-химического воздействия (радиация, электроток, тяжелые металлы и т.д.) происходит активация ПОЛ.

Исследования выявили характерные изменения МДА и ГП в сыворотке крови и умеренное снижение этих показателей в группах животных, принимавших БАД.

В соответствии с таблицей 5 во второй группе животных концентрация ГП и МДА увеличилась соответственно на 44% и 51%. Также выросла чувствительность липидов печени к переокислению (МДА+ Fe²⁺) на 36% по сравнению с первой группой животных.

Что касается животных, получавших предварительно в течение двух недель предложенный БАД в дозе 0,5 мг/кг, то у них при действии электротока не наблюдалось достоверных отклонений от нормы данных показателей, что свидетельствовало о защитном эффекте на уровне печени.

При оценке антиоксидантных свойств созданного в соответствии с изобретением БАД в модельных системах учитывалась физиологически активная доза трекрезана 50 мг на 70 кг массы, что в пересчете на жидкие среды организма составило приблизительно 1 мг/л (0,3 мг/л - 10 мкМ). Измерение хемилюминесценции в модельной системе проводили с помощью хемилюминометра ХЛМ-З фирмы "Бикап" (РФ) в суспензии многослойных липосом. Состав реакционной среды: 0,4 мг/мл фосфолипидов, 0,04 об.% тритона Х-100, 0,1 мкМ кумарина. Инициация липидной пероксидации осуществлялась введением 18 мкМFe²⁺.

При титровании суспензии липосом биологически активной составляющей созданного БАД было обнаружено, что по мере увеличения концентрации исследуемого вещества происходило:
- уменьшение интенсивности ХЛ суспензии на стадии медленного свечения до концентрации 10 мкМ с выходом на насыщение при дальнейшем увеличении концентрации;
- двухфазное увеличение длительности латентного периода. В начальный период увеличение концентрации до 10 мкМ не оказывало существенного влияния, а затем при дальнейшем увеличении концентрации вещества наблюдалось возрастание длительности латентного периода. Иными словами, в интервале используемых концентраций (0-10 мкМ) наблюдалось существенное уменьшение интенсивности ХЛ на фоне неизменности длительности латентного периода. Это означало, что при малых концентрациях вещество, обладая небольшим коэффициентом распределения (гидрофобностью), связывалось с липидной фазой мембран липосом, где за счет перехвата липидных радикалов ингибирует ПОЛ, что вызывает уменьшение интенсивности ХЛ. Дальнейшее увеличение концентрации соединения не влияет на его распределение в липидную фазу и он остается в водном окружении, где осуществляет перехват водных радикалов, ингибируя стадию инициации, что и проявляется на увеличении длительности латентного периода хемилюмирограммы. Концентрация 50% ингибированная была равной 10 мкМ.

Пример 4. Исследование действия БАД на иммунную систему
Исследования проведены на базе лаборатории фармакологии Иркутского института органической химии в 1992 г.

Известны данные об иммуноактивных свойствах трекрезана [Экспериментальная и клиническая фармакология, 1993, N3,с.42-45].

Для первичной оценки иммунной системы использовали метод локального гемолиза,в частности безгелевый вариант, позволяющий количественно определить клетки, образующие антитела [Science, 1963 г., т. 140, с.405].

Исследования проводили на белых лабораторных мышах (18-21 г).

БАД вводили внутрибрюшинно (трекрезан в дозе 0,5 мг/кг в водном растворе или растворе в димексиде). Антигенная нагрузка - эритроциты барана, которых на 5 сутки забивали декапитацией, извлекали селезенку и из нее готовили гомогенат.

В результате подсчета АОК на 10 спленоцитов оказалось, что БАД стимулирует иммунный ответ по гуморальному типу на 30%.

Далее проверялось действие БАД на реакции преципитации.

Использовали белых лабораторных мышей (18-21 г). БАД вводили per os в течение 7 дней в дозе 0,5 мг/кг. После этого животных иммунизировали путем внутрибрюшинного введения раствора эритроцитов барана в объеме 0,2 мл.

Иммунодепрессивное состояние моделировали введением 40 мг/кг внутрибрюшинного аллоксана за трое суток до забоя. Забой животных проводили на 7,14,21 сутки после иммунизации. Титры антител определяли по реакции гемаглютинации, где при наибольшем разведении сыворотки реакция еще считывалась(коэффициент рассчитывался из значений логарифма титра).

Исследованные группы обозначены условно:
Б-БАД; БАД+аллоксан - Б+А; контроль- К; аллоксан- А.

Полученные данные могут быть представлены в следующем виде:
7 сутки
Б/К=1,6; Б+А/К=1,3; А/К=0,73,
14 сутки
Б/К=3,87; Б+А/К=3,31; А/К=0,93,
21 сутки
Б/К=3,61; Б+А/К=3,38; А/К=1,09.

Анализируя данные по реакции гемаглютинации, следует отметить, что нарастание титра антител отмечается в группе животных, получивших созданный по изобретению БАД, достигая максимума на 14 сутки - 3,87.

На фоне умеренной депрессии иммунной системы в группе животных с экспериментальным диабетом (0,73) предварительное введение животным БАД сопровождается увеличением титра антител на 14 сутки - 3,31. Методом иммунного гемолиза [Иммунология, 1980 г. , N 5, с.51-54], позволяющем выявить мембранстабилизирующие свойства исследуемого вещества, при длительном (14 дней) свободном выпаивании БАД крысам установлено наличие в сыворотке крови эффекта задержки гемолиза эритроцитов барана по сравнению с контрольной сывороткой. Гемолиз эритроцитов барана на 5 сутки после окончания приема БАД по величине Т₅₀ (время гемолиза 50% эритроцитов) увеличен на 123 ± 11% по отношению к показателю контрольной группы 6,5 ± 0,7 мин.

Перечисленные выше факторы указывают на стимулирование пролиферативной активности В- лимфоцитов под действием разработанного БАД.

Пример 5. Клинические испытания БАД
Исследования проводились на базе Российского научного Центра хирургии РАМН в г. Москве в 1998-1999 г.

В исследования были включены 20 человек-ликвидаторов последствий аварии на Чернобыльской атомной электростанции (ЧАЭС).

Все обследуемые работали на ЧАЭС в первые дни после аварии. Средний возраст обследуемых составил 50 лет (от 30 до 71 года), среди них мужчин-16, женщин-4.

После 2-недельного периода плацебо пациентам назначался прием БАД с содержанием трекрезана 50 мг 2 раза в день в течение 2 месяцев. При этом использовались таблетки по 0,31 г с содержанием: трекрезан- 0,1- 0,15 г, молочнокислый сахар(лактоза)-0,075 г, вспомогательные вещества, в виде крахмала картофельного, стеариновокислого кальция, натрия хлористого, талька, аэросила, поливинилпирромедона - остальное.

Иммунный статус оценивали с помощью лазерной проточной цитометрии с использованием панели моноклональных антител. Для изучения психологического статуса использовали многофакторный опросник исследования личности и тест "Самочувствие, активность, настроение" (САН).

Пациенты заполняли опросники 4 раза: до включения в исследование, в конце периода плацебо, через 4 и 8 недель приема БАД. Данные, полученные на фоне приема БАД, сравнивались с данными в конце периода плацебо, что позволяло избежать психологического плацебо-эффекта. У 10 человек была произведена оценка иммунного статуса до и после 2-месячного приема БАД.

Результаты исследований следующие: через 4 недели приема БАД отмечалось улучшение показателей самочувствия у 50 % пациентов, активности - у 60% пациентов, настроения - у 55% пациентов. К концу 2 месяца употребления БАД (в течение 2 месяца прием БАД амбулаторно) эти показатели сохранились примерно на том же уровне.

Показатель интегральной работоспособности в конце 1 месяца приема БАД увеличился у 55% обследуемых пациентов.

По данным теста "Многофакторный опросник для исследования личности" получены следующие данные: снижение выраженности ипохондрических проявлений в 1 месяц - 40%, к концу 2 месяца - 60%; уменьшение депрессивных тенденций в 1 месяц - 45%, к концу 2 месяца - 65%;
Проявления демонстративности и истеричности у пациентов к концу 1 месяца приема БАД снизились на 50% и к окончанию испытаний - на 70%.

Отмечено уменьшение проявлений интеллектуальной и эмоциональной усталости через месяц на 45% и через 2 месяца - на 55%. Наблюдения за пациентами, принимавшими БАД, позволили сделать заключение, что к концу 2 месяца испытаний у большинства пациентов возрос оптимизм и активность (физическая, психическая, социальная). Отмечено благоприятное воздействие БАД на психологический статус пациентов при снижении невротических проявлений - показатели по шкалам невротической триады снизились до нормальных значений.

При оценке иммунного статуса с помощью лазерной проточной цитометрии с использованием панели моноклональных антител у исследуемых пациентов выявлены нарушения иммунных показателей.

Употребление БАД в течение 2 месяцев вызывает улучшение иммунных показателей клеточного звена. Особенно выражено увеличение CD 19, что свидетельствует об усилении противоинфекционной защиты.

В таблице 6 представлены среднестатистические показатели по иммунному статусу группы пациентов (10 человек) при применении БАД в течение 2 месяцев.

При этом была отмечена нормализация почти всех показателей иммунного статуса.

Результаты исследований показали, что БАД к пище, содержащая трекрезан в качестве биологически активной составляющей, способна восстанавливать иммунитет у пациентов, страдающих иммунодефицитом, вызывает улучшение самочувствия, активности и настроения, повышает показатели интегральной работоспособности, улучшает психологический статус за счет снижения невротических проявлений, оказывает антиоксидантное и мембранстабилизирующее действие на организм.

Изобретение относится к пищевой промышленности и к медицине и может быть использовано в качестве биологически активной добавки к пище человека и кормам для животных. Биологически активная добавка (БАД) к пище в качестве биологически активной составляющей содержит синтетический фитогормон - трекрезан (трис-(2-оксиэтил)аммония о-крезоксиацетат). При этом БАД обладает широким спектром физиологического действия на организм: антиоксидантным, мембранстабилизирующим и иммуннокоррегирующим. 6 табл.

Биологически активная добавка к пище, отличающаяся тем, что в качестве биологически активной составляющей используют синтетический фитогормон - трекрезан (трис-(2-оксиэтил)аммония о-крезоксиацетат).