СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА (ТРЕКРЕЗАНА) С ИММУНОТРОПНЫМ ДЕЙСТВИЕМ Российский патент 1997 года по МПК A61K31/205 C07C215/40 

Изобретение относится к медицине, зооветеринарии, а именно к способам получения лекарственных средств иммунотропными свойствами, т.е. действующих на иммунную систему человека и обладающих антиоксидантным действием [1] В литературе такие средства называют также "иммунотропными" и "иммуноактивными".

В настоящее время потребность в таких средствах велика, в них нуждается до 40 миллионов человек только в нашей стране.

Известны средства растительного происхождения (женьшень, золотой корень, элеутерококк и др.), которые формально можно отнести к иммуностимулирующим средствам, однако их эффективность невелика, ресурсы добычи ограничены, дозирование затруднено, производство экстрактов дорого и трудоемко.

К иммунотропам относятся, например, тимотропин, тимоптин, миелонид, диуцифон и другие препараты животного, растительного, бактериального и синтетического происхождения. Однако отсутствие критериев для контроля их качества и незавершенность исследований по выявлению эффективности действия сдерживают широкое применение таких иммунотропов в качестве лекарственных средств.

Необходимо также отметить, что иммунотропы из класса синтетических фитогормонов (ароксиуксусных кислот) вообще не известны.

Авторами изобретения проведены исследования и предложен способ получения иммунотропного средства, в котором в качестве активного ингредиента использован трис-(2-оксиэтил)-аммоний-орто-крезоксиацетат (крезацин).

Известен способ получения трис-(2-оксиэтил)-аммоний-орто-крезоксиацетата (крезацина), заключающийся в смешении триэтаноламина и орто-крезоксиуксусной кислоты в среде полярных растворителей, в качестве которых применяют, например, спирт, ацетон, диоксан, и др. при температуре кипения растворителя с последующим выделением целевого продукта известными методами (кристаллизация осадка, промывка эфиром и сушка) [2]
Указанный известный способ характеризуется большим расходом растворителей (5-7 л на 1 кг целевого продукта), что определяет высокую себестоимость продукции. К тому же указанные растворители являются легковоспламеняющимися и взрывоопасными.

Полученный указанным способом крезацин обладает высокой биологической активностью. Подвергнутый очистке крезацин используется в медицине под названием "трекрезан" (название утверждено решением фармакологической комиссии при Минздраве Протокол N 3 от 21.09.87 г.), который используется в качестве лекарственного средства, обладающего адаптогенным действием, для сохранения гомеостаза при воздействии на организм человека неблагоприятных факторов физической, химической и биологической природы [3]
Трекрезан прошел клинические исследования и разрешен к медицинскому применению (Приказ Минздрава РФ N 151 от 28.07.94 г.) как адаптоген широкого спектра действия.

Проведенные авторами изобретения исследования трекрезана выявили его новые свойства как ноотропного средства при лечении и/или профилактике ряда заболеваний.

Однако получение лекарственного средства с иммунотропным действием, пригодного для применения в медицине, связано с дополнительной очисткой крезацина (трекрезана). Полученный по известному способу [2] крезацин не обладает фармакологической чистотой из-за наличия побочных продуктов, в частности орто-крезола, хлоридов, ортокрезоксиуксусной кислоты.

По этой причине неочищенный крезацин обладает аминным запахом и окраской от желтой до кремовой, что также нежелательно при его использовании в качестве лекарственного средства при пероральном приеме.

Задачей изобретения является получение крезацина (трекрезана), имеющего более широкий спектр действия как в качестве адаптогена, так и в качестве иммунотропа, и обладающего повышенной фармакопейной чистотой при отсутствии побочных продуктов (в частности орто-крезола и хлоридов), аминного запаха и желтого цвета. Кроме того, целью изобретения является повышение безопасности производства снижение себестоимости продукта.

Указанная задача решается тем, что в известном способе получения лекарственного средства крезацина (трекрезана), включающем смешение триэтаноламина с орто-крезоксиуксусной кислотой в среде полярного растворителя, нагрев полученной смеси и ее осаждение с последующей кристаллизацией продукта, охлаждением смеси, фильтрацией осадка и первичной сушкой, указанное смешение ведут в присутствии активированного угля, а после первичной сушки осуществляют перекристаллизацию продукта из смеси изопропилового спирта и гексана (гептана), взятых в соотношении 1:1 с последующей промывкой эфиром и вторичной сушкой.

Охлаждение реакционной смеси производят медленно, а высаживание осадка ведут максимально быстро в зависимости от объема реактора и реакционной смеси.

При этом обеспечивается получение трекрезана, обладающего фармакопейной чистотой, достаточной для его использования в медицине в качестве нооторопа.

Получение такого трекрезана возможно осуществить только при условии предварительной очистки от остатков орто-крезола, хлоридов, орто-крезоксиуксусной кислоты, для чего ее смешивают с водным раствором изопропилового (этилового) спирта в присутствии активированного угля, а полученную реакционную массу подвергают горячей фильтрации при 70-80^oC. Это позволяет получать трекрезан, обладающий повышенной фармакопейной чистотой без побочных продуктов, аминного запаха и нежелательного желтого или кремового цвета.

При получении трекрезана осаждение смеси можно вести в присутствии гексана, ацетона и изопропанола, взятых в соотношении 1:0,3:0,2, что определяет снижение себестоимости продукта в сравнении с известным способом, предсматривающим применение для этой цели более дорогого серного эфира.

Перекристаллизацию смеси можно вести в присутствии петролейного эфира и гексана, взятых в соотношении 1: 1. Это в сравнении с известным способом также определяет снижение себестоимости продукта и, кроме того, обеспечивает повышение безопасности производства из-за отсутствия в процессе легковоспламеняемых компонентов.

Нагрев смеси ведут при более низких в сравнении с известным решением температурах в пределах 45-65^oC, а охлаждение в пределах 5-15^oC.

При этом уменьшается процесс осмоления и разложения продукта на составляющие компоненты.

Процесс получения трекрезана с улучшенными фармакопейными свойствами осуществляется следующим образом.

В трехгорлую колбу, снабженную мешалкой, обратным холодильником и термометром, загружают 1 кг орто-крезоксиуксусной кислоты, 0,8 л триэтаноламина, 1,9 л абсолютного изопропиленового спирта и 0,085 кг активированного угля марки АГ-3.

Производят разогрев реакционной массы до 40 45^oC и выдержку в этом состоянии до 0,5 ч. Охлаждают реакционную массу до 20^oC, заменяют термометр на капельную воронку и начинают приливать к реакционной массе осаждающую смесь, состоящую из следующих компонентов: гексан, ацетон, изопропанол. Общее количество смеси составляет 1,5 л, а соотношение указанных компонентов соответственно 1:0,3:0,2.

Гексан может быть заменен на гептан или петролейный эфир, кипящий при той же температуре
После прибавления осаждающей смеси осуществляют и кристаллизацию в течение 2-8 ч. 3атем фильтруют на воронке Бюхнера, промывают продукт чистой осаждающей смесью, повторно промывают с помощью 0,15 мл серного эфира. Продукт сушат при 30^oC.

Полученный трекрезан перекристаллизовывают из смеси изопропиловый спирт-гексан, взятых в соотношении 1:1, и промывают небольшим количеством серного эфира. После сушки получают фармакопейный трекрезан, выход которого составляет до 65%
Дополнительное улучшение качества трекрезана обеспечивается предварительной очисткой орто-крезоксиуксусной кислоты также путем ее смешения с активированным углем марки АГ-3. При этом используют описанный выше тот же тип колбы, в которую заливают водный раствор изопропилового спирта (2,4 л спирта и 0,6 л воды) из расчета 1 кг кислоты на 3 л водного раствора спирта. Загружают 0,28 кг активированного угля и кипятят смесь в течение 30 мин при температуре не выше 80^oC.

Реакционную массу после кипения подвергают горячей фильтрации на воронке типа Бюхнера с электроподогревом. Выпавшие в фильтрате кристаллы орто-крезоксиуксусной кислоты отфильтровывают, промывают чистым исходным раствором, сушат на воронке Бюхнера с помощью водоструйного насоса. Затем полученную кислоту сушат в сушильном шкафу при 100-120^oC. Выход целевого продукта на этом этапе составляет 60-70%
Ниже представлены примеры клинических исследований трекрезана как иммунотропного лекарственного средства.

Пример 1. Использование трекрезана при хронической сердечной недостаточности (ХСН).

В формировании и прогрессировании ХСН важная роль принадлежит активации перекисного окисления липидов (ПОЛ). Для предупреждения этих процессов в качестве терапевтических средств предлагаются природные и синтетические антиоксиданты. Влияние трекрезана на содержание продуктов ПОЛ и показатели антиоксидантной активности (АОА) в крови больных ХСН было не изучено.

В клиническом опыте находилось 53 больных в возрасте от 30 до 65 лет(28 мужчин, 25 женщин). Основные причины ХСН у этих больных: ишемическая болезнь сердца, артериальная гипертензия, дилатационная кардиомиопатия.

ХСН стадии II А отмечены у 32 больных, ХСН стадии II Б у 14 больных. В контрольной группе состояло 20 здоровых человек того же возраста. Для диагностики использовали данные экокардиографии, тетраполярной грудной реографии, полярографии.

Больные были разделены на две равноценные по возрасту, полу и тяжести течения болезни группы. Лечение проводили путем приема по 0,3 г трекрезана (0,1 г по 3 раза в день) ежедневно в течение трех недель (20-21 день). В первой гриппе из 23 больных трекрезан применяли одновременно с нитратами пролонгированного действия, а во второй группе из 30 больных давались только нитраты. При ХСН стадии II Б к терапии добавляли фурасемид по общепринятой схеме.

Данные лечения приведены в табл.1
У больных стадий II А и II Б в крови нарастали вторичные продукты ПОЛ и наблюдалось угнетение антиоксидантной системы организма.

У больных, принимавших трекрезан и нитраты, продукты ПОЛ снижались до уровня здоровых людей. К концу лечения концентрация малонового диальдегида (МДА) снизилась с 2,98 ± 0,05 до 2,1 ± 0,03 мкМоль/л (p < 0,05), содержание диенового коньюгата (ДК) снизилось с 18,8 ± 0,19 до 16,1 ± 0,12 мкМоль/л (р < 0,05).

Снижение в крови больных ХСН этой группы первичных и вторичных продуктов ПОЛ, степень активности супероксиддисмутазы (СОД) свидетельствует о стабилизации свободнорадикального окисления липидов. Это предопределяет перспективу улучшения метаболизма в миокардиоцитах и функционирования мембран клеток.

В группе больных, где применяли нитраты без трекрезана происходило только снижение концентрации МДА с 2,79 ± 0,03 до 2,63 ± 0,06 мкМоль/л (p < 0,05), увеличение концентрации витамина А с 2,21 ± 0,04 до 2,36 ± 0,03 мкМоль/л (p < 0,05).

Другие показатели ПОЛ у больных этой группы существенно не изменились. Более того, к концу лечения полной нормализации показателей ПОЛ не наступило, а снижение МДА и повышение содержания витамина А сопровождалось высоким значением показателя перекисшего окисления (ПО).

Таким образом совместное применение трекрезана и нитратов пролонгированного действия обладает синергизмом и более эффективно влияет на нормализацию основных звеньев свободнорадикального окисления липидов, оказывает выраженное антиоксидантное действие и может быть рекомендовано для лечения и профилактики больных ХСН.

Пример 2. Использование трекрезана при эндометрите после кесарева сечения.

В современном акушерстве кесарево сечение позволяет снизить перинатальную и материнскую заболеваемость и смертность и является одной из наиболее распространенных операций. Соответственно возрастает число послеоперационных гнойно-септических осложнений (от 15 до 73%). Ситуацию осложняет возникновение антибиотико-резистентных высоковирулентных штаммов микроорганизмов и устойчивость золотистого стафилококка к химико- и физикотерапевтическим методам воздействия. Одним из эффективных путей уменьшения гнойно-септических осложнений является повышение иммунореактивности организма беременных женщин.

Трекрезан обладает мембранопротекторным, антиоксидантным и гепатопротекторным свойствами. Он легко растворим в воде и жидких субстанциях организма (кровь, лимфа, моча). В его молекуле катион ортокрезоксиуксусной кислоты, близкий по составу и структуре аспирину (орто-ацетилсалициловая кислота), выполняет роль ингибитора развития воспалительных процессов.

Указанные свойства и полная безвредность трекрезана позволяют использовать его для профилактики развития эндометрита после кесарева сечения.

Нами обследовано 30 здоровых небеременных женщин, 30 женщин с нормальным течением беременности (контрольная группа) и 63 беременных группы высокого риска в сроке 38-39 недель. Из них 30 женщин (первая группа) проходили обычную (традиционную) дооперационную подготовку, а 33 женщинам (вторая группа) дополнительно назначали 300 мг трекрезана в сутки на протяжении 7-10 дней. И, наконец, 31 родильница с факторами риска (третья группа) принимали трекрезан с третьего дня послеоперационного периода по той же схеме. Возраст женщин от 18 до 36 лет. Во время беременности у женщин отмечены следующие патологии: анемия 66,9% заболевания почек и мочевыделительной системы 34,0% заболевания органов дыхания 21,3% воспалительные процессы придатков матки 8,5% эндометриты и другие осложнения в предыдущих кесаревых сечениях 6,4% поздние гестозы 22,3%
Проведенные исследования показали, что применение трекрезана у беременных с факторами риска приводит к значительноми увеличению иммунологической реактивности организма. Количество Т-лимфоцитов в этой группе больных составляет 49,71 + 0,94% Т-хелперов 50,29 + 0,72% концентрация В-лимфоцитов 12,84 + 0,85% носителей HLADr-антигена-19,49 + 0,89%
В группе без применения трекразана уровень Т-лимфоцитов равнялся лишь 45,46 + 0,73% Т-хелперов-44,58 + 0,72% Т-супрессоров 45,88 + 1,7% носителей HLADr-антигена 16,87 + 0,01% По сравнению с группой женщин, где дооперационная подготовка проводилась традиционным методом, в опытной группе отмечалось уменьшение расхождения швов с 13,7 + 2,1% до 13,0+2,3% эндометрита с 13,3 + 2,3% до 6,8 + 2,2% раневой инфекции с 7,69% до 3,7% Отмечалось также увеличение почти в 2 раза содержания гемоглобина в крови женщин опытной группы до 106,0 + 8,6 г/л.

Таким образом, препарат нормализует гуморальный и клеточный иммунитет организма и уменьшает количество гнойно-септических осложнений в послеоперационном периоде. Применение трекрезана до операции у беременных с факторами риска гнойно-септических осложнений более эффективно по сравнению с использованием его в послеоперационном периоде.

Побочного действия на состояние плода не отмечено, что согласуется с ранее полученными данными об отсутствии эмбриотоксического действия трекрезана [4]
Пример 3. Влияние трекрезана на кроветворную систему.

Исследования проведены на макаках резус и павианах гамадрилах. Выбраны три группы животных: первая группа -клинически здоровые макаки (12 особей), вторая группа ослабленные с явлениями гиподинамии и легкого истощения и анемии (4 павиана), третья группа, получавшие микродозу (0,1 мг/кг) афлатоксина В (АФВ) (2 макаки и 1 павиан).

Использовали трекрезан в виде инъекции 5%-ного водного раствора под кожу и внутримышечно из расчета 3-5-10 мг/кг веса в течение 1-4 недель.

Фармакологические эффекты оценивали по разным тестам, а именно по: 1) активности в клетке; 2) состоянию волосяного покрова; 3) цвету слизистых оболочек; 4) поедаемости корма (весу животных); 5) общему анализу крови.

Использовались цитохимические методы. Определяли динамику содержания катионного белка в гранулоцитах крови, миелопероксидазы в лейкоцитах, активность сукцинатдегидрогеназы по общепринятым методикам.

В первой группе животных через 7 дней после приема препарата в дозе 5 мг/кг веса наблюдалась активная поедаемость корма, но вес оставался стабильным в течение 1,5-2 месяцев.

В показателях крови через 2 ч после введения отмечалось увеличение числа лейкоцитов, эритроцитов и тенденция к увеличению реакции оседания эритроцитов (РОЭ) (табл. 2). Через сутки эти показатели нормализовывались. При многократном введении в течение 15 дней повышалось количество эритроцитов и содержание гемоглобина. Эти сдвиги в красной части крови сохранялись на протяжении 15-17 дней после окончания приема. При морфологическом анализе мазков крови не было выявлено каких-либо токсических эффектов трекрезана.

Во второй группе (ослабленных) животных прием препарата в дозе 5 мг/кг веса в течение 3 недель сопровождался также повышением физической активности и поедаемости корма. Кроме того, у некоторых особей тусклый волосяной покров приобрел блеск, а слизистая коньюктива стала более розовой. В картине крови более значительно повысился гемоглобин и количество эритроцитов и это состояние наблюдалось в течение двух недель после приема препарата.

На двух половозрелых павианах и двух макаках проверялось действие трекрезана в дозе 10 мг/кг веса (4 дня) на частоту хромосомных аберраций в клетках костного мозга. Препарат не оказал влияния на комплементарную активность сыворотки крови и на процент аутогемолизинов. Содержание общего белка при этом существенно не менялось.

Интоксикацию АФВ ингибировали введением трекрезана в дозе 3 мг/кг массы в течение двух недель.

Таким образом установлено, что предварительное введение трекрезана сопровождалось сохранением нормальной двигательной активности и поведенческих реакций у отравленных животных. Активность дизосомальных катионных белков, миелопероксидазы и сукцинатдегидрогеназы практически не изменялась в отличие от обезьян, отравленных АФВ без введения трекрезана.

Иммуностимулирующее влияние трекрезана отмечалось ранее в [3, 5] В частности в [5] отмечено, что трекрезан в 2 раза усиливает гумморальный иммунный ответ в опытах in vivo у мышей, a in vitro стимулирует пролиферацию мононуклеарных клеток человека, действуя на В-лимфоциты и усиливая продукцию лимфокинов и монокинов, однако рекомендации для лечения больных не даны.

Таким образом предложенный способ получения трекрезана позволяет обеспечить его повышенную фармакопейную чистоту без побочных продуктов, неприятного запаха и желтого цвета, благодаря чему его можно использовать в качестве лекарственного средства с иммунотропного действием. Проведенные клинические исследования показали эффективность полученного трекрезана в качестве иммунотропного при различных заболеваниях.

Источники информации
1. "Человек и лекарство"1 Российский Национальный конгрессом, М. 1992, с. 191; II Российский Национальный конгресс, М. 1995 г.

2. Авторское свидетельство СССР N 515742, кл. C 07 C 215/40, 1973 г.

3. Заявка N 94006580/14, кл. A 61 K 31/185, 24.02.94 г.

4. Авторское свидетельство СССР N 704618, кл. A 61 K 31/185, 1979 г.

5. В. С. Ширинский и др. Экспериментальная и клиническая фармакалогия, 1993 г. N 3, с. 42.

Изобретение относится к медицине, зооветеринарии, а именно к способам получения лекарственных средств с иммуностимулирующими свойствами. Сущность изобретения: осуществляют смещение триэтаноламина с орто-крезоксиуксусной кислотой в среде полярного растворителя в присутствии активированного угля, смесь нагревают до 45 - 65^oC, затем охлаждают до 5 - 15^oC, вводят осадитель, после сушки осадка осуществляют перекристаллизацию продукта из смеси изопропилового спирта и гексана в отношении 1:1, промывку эфиром и вторичную сушку. В качестве осадителя используют гексан, ацетон и изопропиловый спирт, взятые при объемных отношениях 1:0,3:0,2. Можно осуществлять предварительную очистку орто-крезоксиуксусной кислоты, которую осуществляют при ее смешивании с водным раствором спирта в присутствии активированного угля, а полученную реакционную массу подвергают фильтрации при 70-80^oC, выпавшие кристаллы отфильтровывают, промывают и сушат. Технический результат: реализация указанного назначения. 3 з.п. ф-лы, 2 табл.

1. Способ получения лекарственного средства с иммунотропным действием, включающий смешение триэтаноламина с орто-крезоксиуксусной кислотой в среде полярного растворителя, охлаждение смеси, введение осадителя, фильтрацию осадка и его сушку, отличающийся тем, что смешение ведут в присутствии активированного угля, перед охлаждением смесь нагревают, вводят осадитель и после кристаллизации осадка проводят сушку, затем осуществляют перекристаллизацию осадка из смеси изопропилового спирта и гексана или изопропилового спирта и гептана, взятых в отношении 1 1 с последующей промывкой эфиром и повторной сушкой. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что орто-крезоксиуксусную кислоту подвергают предварительной очистке от орто-крезола, смешивая ее с водным раствором изопропилового или этилового спирта в присутствии активированного угля, смесь нагревают и затем фильтруют при 70 80^oС. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве осадителя используют гексан, ацетон и изопропанол, взятые при объемных соотношениях 1 0,3 0,2 соответственно. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что нагрев смеси ведут до 45 - 65^oС, а охлаждение до 5 15^oС.