СПОСОБ ВЫРАЩИВАНИЯ РАСТЕНИЙ IN VITRO Российский патент 2000 года по МПК A01H4/00 

Изобретение относится к сельскому хозяйству и биотехнологии и может быть использовано в процессе укоренения и адаптации различных культур.

Известен способ выращивания растений in vitro, при котором в питательную среду для укоренения с целью улучшения ризогенеза вводят регулятор роста ауксиновой природы, причем в качестве последнего чаще всего используют индолилмасляную кислоту /авт.св. СССР N 1792270, кл. A 01 H 4/00, 29.04.91. Пивень Н. М., Мельничук Г.Г., Фелалиев А.С. Способ укоренения побегов орехоплодных, полученных in vitro. Бюл. N 4 от 30.01.93/. Однако при таком способе на начальном этапе укоренения часто наблюдается усиление недифференцированного роста тканей, ингибирование процессов формирования и роста корней, что приводит к ухудшению укореняемости и удлинению периода укоренения растений. Поэтому для улучшения укореняемости применяют различные приемы, например, замачивают микрочеренки в растворе регулятора роста /ИМК/ над поверхностью агаризованной среды /патент РФ N2060646 кл. A 01 H 4/00, 1994 г. Туровская Н. И., Пронина И.Н., Матушкина О.В. Способ укоренения побегов плодовых культур, полученных in vitro. Бюл. N 15 от 27.05.96/. Вместе с тем данный способ весьма трудоемок, требует дополнительных затрат времени на приготовление среды и создает опасность контаминации среды вредной микрофлорой.

Критическим этапом для растений, выращенных на питательных средах, является их адаптация к нестерильным условиям. При этом иногда погибает более 50% высаженных растений. Для улучшения приживаемости растения намачивают в воде /авт.св. СССР N 1720597, кл. A 01 H 5/00, 26.12.89. Упадышев М.Т., Высоцкий В. А. Способ подготовки растений - регенерантов к посадке в нестерильные условия. Бюл. N 11 от 23.03.92/. Однако намачивание в воде не на всех культурах приводит к положительным результатам. К тому же в условиях повышенной влажности воздуха и субстрата для адаптации создаются предпосылки поражения растений грибной инфекцией.

Наиболее близким техническим решением, выбранным в качестве прототипа, является способ адаптации растений к нестерильным условиям, при котором растения с целью улучшения приживаемости обрабатывают 1%-ным раствором марганцевокислого калия, а затем раствором индолилуксусной кислоты /патент N 1792269 кл. A 01 H 4/00, 03.01.90. Дорошенко Н.Н., Кострикин И.А. Способ адаптации растений к нестерильным условиям. Бюл. N 4 от 30.01.93/. Недостатками этого способа являются многооперационность, трудоемкость, а также то, что он апробирован только на растениях винограда.

Задачей, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, является увеличение укореняемости побегов, улучшение развития корневой системы различных растений, увеличение приживаемости пробирочных растений при пересадке в нестерильные условия, ускорение и упрощение процесса выращивания.

Поставленная задача решается тем, что в способе выращивания растений in vitro, включающем приготовление питательной среды, высадку на нее побегов растений и их культивирование, на этапе укоренения растений в питательную среду дополнительно вводят оксибензойную кислоту в концентрации 1•10^-5-1•10^-4М. Кроме того, задача решается и тем, что на этапе пересадки в нестерильные условия растения обрабатывают антисептиком, в качестве которого используют борную кислоту в концентрации 1,5•10^-4-1,5•10^-3М.

Сопоставительный анализ заявляемого технического решения с прототипом показывает, что заявляемый способ отличается от известного тем, что растения на этапе адаптации обрабатывают в качестве антисептика борной кислотой, причем предварительно растения культивируют на среде укоренения с добавлением оксибензойной кислоты. Это позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию "новизна".

Предложенное техническое решение обладает изобретательским уровнем, так как предложенный способ выращивания совершенно неочевиден для специалистов, работающих в области культуры ткани, и ранее не был использован для этих целей, то есть предложен впервые.

Применение предлагаемого способа позволяет получить новый эффект - увеличить укореняемость побегов, улучшить развитие корневой системы растений, повысить их приживаемость в нестерильных условиях.

Химические препараты, необходимые для осуществления предложенного способа выращивания, характеризуются низкой стоимостью и производятся промышленностью, поэтому изобретение вполне может быть реализовано в условиях учреждений, работающих в области культуры тканей и органов растений. При этом не требуется разработки специального оборудования.

Пример 1. Приготавливают питательную среду для укоренения. Для этого берут питательную среду по Мурасиге и Скугу /1962/, разбавленную вдвое по минеральным и органическим компонентам, мг/л: аммоний азотнокислый - 825, калий азотнокислый - 950, кальций хлористый - 220, магний сернокислый - 185, калий фосфорнокислый - 85, железо сернокислое - 13,6, этилендиаминотетраацетат натрия - 18,7, борная кислота - 3,1, марганец сернокислый - 11,2, цинк сернокислый - 4,3, калий йодистый - 0,42, натрий молибденовокислый - 0,13, медь сернокислая - 0,013, кобальт хлористый - 0,013, миоинозит - 50,0, тиамин, пиридоксин, никотиновая кислота - по 0,25, аскорбиновая кислота - 0,5, индолилмасляная кислота - 1,0, сахароза - 15000, агар - агар - 7000, остальное - вода до 1 л. В указанную среду добавляют оксибензойную кислоту в концентрации 1•10^-5М. Объем раствора доводят до 1 л, устанавливают pH 5,5-5,7 и при нагревании растворяют навеску агар-агара. Питательную среду разливают по сосудам и автоклавируют при давлении 1 атм /температура 120^oC/ в течение 15 - 20 мин, после чего осуществляют высадку побегов.

Как показали результаты /табл.1/, при разработанном способе отмечается увеличение укореняемости в зависимости от вида растения на 7 - 15%, числа корней в 1,2 - 2,8 раза, длины корней в 1,7 - 3,2 раза по сравнению с прототипом.

Пример 2. Способ осуществляют по примеру 1. В питательную среду вводят оксибензойную кислоту в концентрации 5,0•10^-5М>.

Как видно из таблицы 1, применение разработанного способа выращивания позволяет увеличить укореняемость побегов в среднем на 20 - 27%, числа корней - в 2,1 - 2,9 раза, а их длины - в 1,8 - 5,6 раза по сравнению с известным способом.

Пример 3. Способ осуществляют по примеру 1, в питательную среду вводят оксибензойную кислоту в концентрации 1,0•10^-4М.

Предложенный способ обеспечивает увеличение укореняемости побегов на 15 - 67%, числа корней - в 2,1 - 3,3 раза, длины корней - в 2,1 - 5,0 раз в сравнении с прототипом /табл. 1/.

Следует отметить и такой положительный эффект выращивания растений по предложенному способу, как снижение диаметра каллуса в среднем в 1,6 раза по сравнению с известным способом. Это особенно важно для такой культуры, как груша, поскольку на среде с одной индолилмасляной кислотой она формирует в основании побега очень большой каллус, что отрицательно сказывается и на укоренении, и на развитии корневой системы.

Более низкие концентрации оксибензойной кислоты /0,5•10^-5М/ или более высокие концентрации /2,0•10^-4М/ ухудшали развитие растений по сравнению с предложенным диапазоном концентраций, а следовательно, были менее эффективными /табл. 1/.

Пример 4. Пробирочные растения через 30 дней культивирования на питательной среде укоренения высаживают в нестерильные условия. При этом растения извлекают из сосудов и обрабатывают борной кислотой в концентрации 1,5•10^-4-1,5•10^-3М. Приживаемость растений, обработанных борной кислотой, возрастает на 25,9-49,0% для груши, 14,3-35,7% для ежевики, 13,3-20,0% для малины черной, 16,7-40,0% для малино-ежевичного гибрида и на 10% для жимолости по сравнению с известным способом адаптации /табл. 2/.

Часто наряду с увеличением приживаемости улучшается развитие корневой и надземной систем растений, увеличивается число листьев.

Полученные результаты свидетельствуют о достижении значительного технического эффекта в сравнении с известным способом выращивания. Применение оксибензойной кислоты на этапе укоренения позволяет в среднем увеличить процент укоренения в 1,5 раза, число корней - в 2,3 раза, длину корней - в 3,3 раза. Благодаря более раннему укоренению растения становятся пригодными к высадке в нестерильные условия на 7 - 14 дней раньше, а следовательно, и ускоряется технологический цикл выращивания. Обработка растений борной кислотой на этапе адаптации к нестерильным условиям способствует увеличению приживаемости растений в среднем на 24% по сравнению с известным способом. В лучших вариантах число корней возрастало в 2 раза, их длина - в 5,6 раза, приживаемость в нестерильных условиях - в 4,4 раза. Выход готовых растений в среднем увеличивался в 1,9 раза по сравнению с известным способом выращивания.

Изобретение относится к сельскому хозяйству и биотехнологии, а именно к способу выращивания растений in vitro. Способ состоит в том, что приготавливают питательную среду для укоренения, в качестве которой используют питательную среду по Мурасиге и Скугу, разбавленную вдвое по минеральным и органическим компонентам. В указанную среду добавляют оксибензойную кислоту в концентрации 1•10^-5 - l•10^-4 M. Объем раствора доводят до 1 л, устанавливают pH 5,5 - 5,7 и при нагревании растворяют навеску агар-агара. Питательную среду разливают по сосудам и автоклавируют при давлении 1 атм (температура 120°С) в течение 15 - 20 мин, после чего осуществляют высадку на нее побегов. Через 30 дней культивирования на питательной среде укоренения пробирочные растения высаживают в нестерильные условия. При этом растения извлекают из сосудов и обрабатывают борной кислотой в концентрации 1,5•10^-4 - 1,5•10^-3 М. Способ позволяет увеличить приживаемость растений при пересадке в нестерильные условия на 13,3 - 49,0% по сравнению с известным способом адаптации. Технический результат достигается тем, что последовательно воздействуют оксибензойной кислотой на этапе укоренения побегов, а затем борной кислотой перед пересадкой растений в нестерильные условия. 2 табл.

Способ выращивания растений in vitro, включающий приготовление питательной среды, содержащей оксибензойную кислоту, высадку на нее побегов растений и их культивирование для укоренения с последующей пересадкой растений в нестерильные условия, отличающийся тем, что перед пересадкой в нестерильные условия их обрабатывают борной кислотой в концентрации 1,5 • 10^-4 - 1,5 • 10^-3 М.