ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ РАСТЕНИЙ IN VITRO Российский патент 1995 года по МПК A01H4/00 

Изобретение относится к сельскому хозяйству и биотехнологии и может быть широко использовано в процессе микроразмножения различных культур.

Известны жидкие питательные среды для культивирования растительных тканей и пробирочных растений.

Наиболее близким техническим решением, выбранным в качестве прототипа, является модифицированная жидкая питательная среда с макро- и микроэлементами по Мурасиге и Скугу.

Однако жидкая питательная среда не нашла широкого промышленного применения в силу ее некоторых недостатков.

Недостатком жидкой среды является то, что при помещении в такую среду эксплантов часто имеет место их гибель вследствие создания неблагоприятных для развития эксплантов анаэробных условий. Для предотвращения гибели обычно применяют мостики из фильтровальной бумаги, однако этот прием значительно снижает технологичность процесса микроразмножения, затрудняет посадку эксплантов, ведет к увеличению материальных и трудовых затрат. Кроме того, использование жидкой питательной среды часто приводит к витрификации тканей эксплантов и появлению сильно оводненных, "стекловидных" и маложизнеспособных побегов.

Вместе с тем известна питательная среда, в которую для затвердения вносят агар-агар в концентрации 6-8 г/л. Однако стоимость агара в настоящее время очень высока и его применение при культивировании пробирочных растений резко увеличивает себестоимость получаемого посадочного материала и снижает рентабельность производства. Кроме того, на указанной среде не всегда удается достичь высоких коэффициентов размножения. Для получения пригодных к укоренению побегов часто применяют дополнительные приемы, например высаживают побеги с целью увеличения их длины на среду с низкой концентрацией цитокининов или прибегают к длительному (3-4 мес.) выдерживанию побегов на среде размножения. Это приводит к увеличению длительности технологического цикла производства посадочного материала и возрастанию затрат.

Задачей, на решение которой направлено изобретение, является улучшение приживаемости эксплантов, увеличение числа образуемых почек и побегов, длины побегов, ускорение процесса производства посадочного материала различных культур и снижение стоимости питательной среды.

Задача решается тем, что на этапе микроразмножения в питательную среду вносят гомополисахарид при следующем соотношении компонентов, мг/л: аммоний азотнокислый 1600-1700; калий азотнокислый 1850-1950; кальций хлористый 400-480; магний сернокислый 340-400; калий фосфорнокислый 140-200; железо сернокислое 27-28,6; этилендиаминотетраацетат натрия 37-37,6; борная кислота 6,0-6,4; марганец сернокислый 22,0-22,6; цинк сернокислый 8,0-9,2; калий йодистый 0,80-0,86; натрий молибденовокислый 0,2-0,3, медь сернокислая 0,02-0,03; кобальт хлористый 0,02-0,03; миоинозит 80-120; тиамин, пиридоксин, никотиновая кислота по 0,4-0,6; аскорбиновая кислота 0,8-1,2; 6-бензил- аминопурин 0,8-1,2; сахароза 29000-31000; гомополисахарид 25000-100000; остальное вода до 1 л.

Сопоставительный анализ предлагаемого решения с прототипом показывает, что предлагаемая питательная среда отличается от известной тем, что в ее состав входит новый компонент гомополисахарид. Это отличие позволяет сделать вывод о соответствии предлагаемого технического решения критерию "Hовизна".

Вместе с тем следует сказать, что предложенное техническое решение обладает изобретательским уровнем, так как применение гомополисахарида в качестве компонента питательной среды в процессе микроразмножения совершенно неочевидно для специалистов, работающих в области культуры тканей, и ранее не было использовано, т.е. предложено впервые. Ранее гомополисахарид, являясь побочным продуктом в ряде отраслей легкой промышленности, использовался в агрохимических лабораториях при выполнении ряда анализов, а также в текстильной, полиграфической и медицинской отраслях промышленности.

Поскольку все компоненты предложенной питательной среды производятся промышленностью, изобретение вполне может быть реализовано в условиях лабораторий, работающих в области культуры тканей и занимающихся ускоренным размножением растений. Введение гомополисахарида в питательную среду не требует разработки специального оборудования и особых навыков производства работ.

Применение гомополисахарида в качестве компонента питательной среды позволяет получить новый эффект увеличивать число образуемых почек и побегов и улучшать развитие побегов. Следовательно, заявляемое решение соответствует критерию "Существенные отличия". Гомополисахарид примерно в 100 раз дешевле агар-агара, что делает его применение экономически выгодным.

П р и м е р 1. В питательную среду вносят компоненты в указанных концентрациях (табл. 1, среда 1). Объем раствора доводят до 1 л, устанавливают рН 5,5-5,6. Питательную среду разливают по сосудам и автоклавируют при давлении 0,9 атм (температура 119^оС) в течение 15-20 мин. После этого осуществляют высадку эксплантов.

Результаты микроразмножения на разных средах через 1 мес. культивирования приведены в табл. 2.

На среде с гомополисахаридом по сравнению с жидкой средой отмечается увеличение приживаемости эксплантов на 79,5-94,5% числа почек и побегов в 2,8-3,2 раза, длины побегов в 3,2-6,9 раза. Предлагаемая среда по сравнению с агарсодержащей средой способствовала увеличению числа почек и побегов в 1,4-1,6 раза, длины побегов в 1,3-1,8 раза, тогда как различия по приживаемости эксплантов на этих двух средах были незначительными. На среде с гомополисахаридом отмечено увеличение пригодных для укоренения побегов в 1,2-2,3 раза. Это дает возможность более ранней высадки побегов на среду укоренения, что значительно ускоряет процесс производства посадочного материала.

П р и м е р 2. Среду готовят и операции осуществляют по примеру 1. Концентрация компонентов указана в табл. 1, среда 2.

Результаты размножения на предлагаемой среде в сравнении с известными приведены в табл. 3.

В сравнении с жидкой средой на среде с гомополисахаридом наблюдается увеличение приживаемости на 79,5-100% числа побегов в 2,5-3,6 раза, длины побегов в 4,4-8,5 раза. Среда с гомополисахаридом по сравнению с агаризованной средой обеспечивает увеличение приживаемости эксплантов на 5-10% числа почек и побегов в 1,4-1,7 раза, длины побегов в 1,2-2,3 раза и процента пригодных для укоренения побегов в 1,4-2,6 раза.

П р и м е р 3. Среду готовят и операции осуществляют по примеру 1. Концентрация компонентов указана в табл. 1, среда 3.

Результаты размножения на разных средах представлены в табл. 4.

На среде с гомополисахаридом по сравнению с жидкой средой наблюдается увеличение приживаемости эксплантов на 79,5-100% числа почек и побегов в 2,9-3,3 раза, длины побегов в 3,8-9 раз. В сравнении с агаризованной средой предлагаемая среда способствует увеличению приживаемости эксплантов на 5-10% числа почек и побегов в 1,4-2,3 раза, длины побегов в 1,6-2,2 раза, процента пригодных для укоренения побегов в 1,3-6,5 раза.

Полученные данные свидетельствуют о достижении значительного технического эффекта в сравнении с известными средами. Кроме того, среда с гомополисахаридом заметно снижала витрификацию побегов. Так, у малинно-ежевичного гибрида Санберри витрифицированных побегов на жидкой и агаризованной средах составлял соответственно 80 и 61,1% тогда как на среде с гомополисахаридом витрификация отсутствовала.

Введение в питательную среду гомополисахарида в концентрациях 10 и 115 г/л оказалось менее эффективным, чем использование его в диапазоне концентраций от 25 до 100 г/л (табл. 5).

Таким образом, размножение растений на предложенной питательной среде в сравнении с жидкой и агаризованной средами обеспечивает увеличение приживаемости эксплантов соответственно на 88 и 3% числа почек и побегов в 4,4 и 1,6 раза, длины побегов в 8 и 1,8 раза, пригодных для укоренения побегов в 18 и 1,6 раза. Вместе с тем особо следует подчеркнуть, что даже при отсутствии технического эффекта (по-лучение одинаковых результатов на предложенной и известных средах) применение предложенной среды является экономически выгодным вследствие ее дешевизны.

Использование: сельское хозяйство и биотехнология. Сущность изобртения: питательная среда для выращивания растений в культуре тканей содержит макро- и микроэлементы, витамины, 6-бензиламиноцурин, сахарозу и дополнительно гомополисахарид при указанных соотношениях компонентов. 5 табл.

ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ РАСТЕНИЙ IN VITRO, содержащая аммоний азотнокислый, калий азотнокислый, кальций хлористый, магний сернокислый, калий фосфорнокислый, железо сернокислое, этилендиаминотетраацетат натрия, борную кислоту, марганец сернокислый, цинк сернокислый, калий йодистый, натрий молибденовокислый, медь сернокислую, кобальт хлористый, миоинозит, тиамин, пиридоксин, никотиновую кислоту, аскорбиновую кислоту, 6-бензиламинопурин, сахарозу, воду, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит гомополисахарид при следующем соотношении компонентов, мг/л:
Аммоний азотнокислый 1600 1700
Калий азотнокислый 1850 1950
Кальций хлористый 400 480
Магний сернокислый 340 400
Калий фосфорнокислый 140 200
Железо сернокислое 27,0 28,6
Этилендиаминотетраацетат натрия 37,0 37,6
Борная кислота 6,0 6,4
Марганец сернокислый 22,0 22,6
Цинк сернокислый 8,0 9,2
Калий йодистый 0,80 0,86
Натрий молибденовокислый 0,2 0,3
Медь сернокислая 0,02 0,03
Кобальт хлористый 0,02 0,03
Миоинозит 80 120
Тиамин 0,4 0,6
Пиридоксин 0,4 0,6
Никотиновая кислота 0,4 0,6
Аскорбиновая кислота 0,8 1,2
6-Бензиламинопурин 0,8 1,2
Сахароза 2900 31000
Гомополисахарид 25000 100000
Вода До 1 л