СПОСОБ РАЗМНОЖЕНИЯ СМОРОДИНЫ IN VITRO Российский патент 1995 года по МПК A01H4/00 

Изобретение относится к области сельского хозяйства, а именно к клональному микроразмножению смородины.

Известен способ математического планирования эксперимента при подборе оптимальной питательной среды для выращивания культуры клеток растений томатов in vitro [1]
Недостаток известного способа в том, что для его осуществления необходимо большое количество эксплантов (схема опытов содержит 25 вариантов по 20 повторностей в варианте) плюс наличие ЭВМ, программы R-Multi и опытного программиста. Кроме того, схема вариантов опыта содержит сокращенное число вариантов (25) и расчеты, вызывающие сомнения у специалистов в этой области.

Наиболее близким техническим решением из известных является способ определения оптимального соотношения макроионов в питательном растворе [2] согласно которому определяют соотношение между NO₃^- SO₄^2- PO₄^3-: K⁺ Ca²⁺ Mg²⁺ всего по восьми вариантам опыта. В основе способа лежит варьирование соотношений между шестью элементами минерального питания при их неизменной суммарной дозе в питательном растворе, так как в каждом варианте сумма NO₃^- + SO₄^2- + PO₄^3- + K⁺ + +Ca²⁺ + Mg²⁺одинакова. В каждом варианте преобладает относительное количество (доля) одного элемента при неизменных (но меньших) относительных количествах всех других элементов. На основании экспериментально полученных данных (урожайности пшеницы) по формулам Омеса рассчитывают оптимальные соотношения изучаемых элементов минерального питания. После этого проводят испытания по- лученных оптимизированных соотношений на растениях того же вида и сорта в сравнении с общепринятыми удобрениями.

Данный способ не позволяет осуществить подбор оптимального состава питательной среды для растений, выращиваемых с помощью клонального микроразмножения.

Цель изобретения повышение выхода посадочного материала за счет оптимизации соотношения ионов питательной среды, обеспечивающей увеличение регенерации и роста дополнительных побегов.

Данная цель достигается тем, что в известном способе размножения смородины in vitro, включающем вычленение экспланта и последующее культивирование на этапах введения в культуру, размножение и укоренение на питательной среде, по качественному составу соответствующей среде Мурасиге-Скуга (МС), отличающейся тем, что на этапе введения в культуру соотношение ионов NO₃^-: SO₄^2- PO₄^3- K⁺ Ca²⁺ NH₄⁺ равно 30 8 18 20 12 12, на этапе размножения 36 8 6 19 13 18, на этапе укоренения 24 7 15 21 14 19 соответственно при суммарном содержании этих ионов в питательной среде на каждом из этапов культивирования, равном 10 м экв.

П р и м е р реализации. Способ размножения смородины in vitro осуществляют следующим образом. По схеме, представленной Омесом [2] первоначально определяли суммарный уровень испытываемых макроионов NO₃^-+ SO₄^2- + PO₄^3- + K⁺ + Ca²⁺ + + NH₄⁺ в питательной среде на каждом этапе культивирования in vitro. Поскольку общепринятой средой для размножения смородины in vitro является питательная среда МС, испытали влияние кратности дозы макросолей в среде МС на регенерацию и рост эксплантов смородины в диапазоне 0,50,75 1 1,25 1,5 2 суммарного содержания солей среды МС.

На чертеже показано влияние кратности суммарной дозы (СД) макроэлементов среды МС на количество почек на 1 эксплант смородины сорта Загадка.

Зона оптимума содержания макроионов в питательной среде МС на этапе размножения находилась между значениями 1 и 1,25 суммарной дозы. В этом пределе биометрическая разница между эксплантами была несущественна. В то же время и уменьшение и увеличение в 2 раза кратности солей в среде МС приводили к снижению темпов роста побегов в длину, сокращению количества почек в 2,5 раза. На остальных этапах культивирования (введение в культуру и укоренение) оптимум по этому показателю находился в тех же пределах. Для удобства расчетов вариантов дальнейших опытов и из соображения экономии химических реактивов, определили сумму ионов, равную 100 м экв для всех этапов культивирования in vitro, что составляет 1,13 суммарной дозы солей среды МС.

Следующим этапом было определение оптимальных соотношений между тремя анионами и тремя катионами питательной среды (NO₃^- SO₄^2- PO₄^3-: K⁺ Ca²⁺ NH₄⁺). Схема вариантов опыта представлена в табл. 1. Вместо иона магния использовали ион NH₄⁺.

В солевом выражении эти компоненты среды представлены в табл. 2.

Остальные компоненты питательной среды не изменялись по вариантам и соответствовали известной методике, разработанной в НИЗИСНП для клонального микроразмножения черной и красной смородины, и содержали микроэлементы, мг/л: KJ 0,83, Н₃ВО₃ 6,2, MnSO₄ ˙ 7H₂O 22,3, ZnSO₄ ˙ 7H₂O 8,6, NaMoO₄ ˙ 2H₂O 0,25, CuSO₄ ˙ 5H₂O 0,025, CoCl₂ ˙ 6H₂O 0,025, Na ˙ ЭДТА 37,3 FeSO₄ ˙ 7H₂O 27,8, витамины: тиамин 0,5, пиридоксин 0,5, рибофлавин 0,5, глицин 0,5, аскорбиновая кислота 50, мезоинозит 100, сахароза 30, агар 7.

В качестве регуляторов роста использовали на этапе введения 6-бензиламинопурин (6-БАП) в концентрации 0,5 мг/л, на этапе размножения 6-БАП 1,5 мг/л, на этапе укоренения индолилмасляную кислоту (ИМК) в концентрации 0,5 мг/л.

Опыт поставлен в пятикратной повторности. На этапе введения вариант включал 15 пробирок, на этапе размножения и укоренения в варианте 10 банок (по 3 экспланта в банке). Определение оптимальных соотношений макроионов осуществляли на примере сорта Загадка. Найденные оптимумы испытывали на других сортах черной и красной смородины.

После посадки эксплантов сорта Загадка на питательные среды еженедельно проводили измерения биометрических показателей (количества почек, длины побегов, количества побегов, длины и количества корней). Расчеты оптимальных соотношений сред проводили на основании экспериментально полученных данных (по количеству образовавшихся почек) с использованием метода Омеса.

П р и м е р расчета. На основании по-лученных данных, представленных в табл. 3, первоначально рассчитывают "грубый оптимум" ОВ (optimum brutto) в долях единицы для каждого элемента анионной серии по формуле:
OB (1) где Yⁱ урожай в варианте с преобладанием элемента i, Σ Y сумма количества почек, полученных в трех вариантах анионной серии.

OB= 0,599
OB= 0,212
OB= 0,189 (min) Затем находим безразмерный поправочный коэффициент, фактор коррекции F_o(correction factor) для перехода от грубого к точному оптимуму:
F_o 0,88 ˙ n ˙ (OB_min + V) 0,6, (2) где n число элементов в соотношении (в анионной серии 3),
ОВ_min минимальный из грубых оптимумов серии,
V (value уровень) принятая в опыте доля минорного элемента в долях единицы.

F 0,88 ˙ 3 ˙ (0,189 + 0,16) 0,6 0,321. Наконец, с помощью поправки переходят от грубого оптимума ОВ к точному или возможному оптимуму ОР (optimum possible) для каждого из элементов серии:
OP (3)
OP= 0,725
OP= 0,154
OP= 0,121 Таким образом, соотношения между NO₃^- SO₄^2- PO₄^3- равны 0,725 0,154 0,121 (в долях единицы) или 72,5 15,4 12,1 (в м.экв. ). Следующий этап нахождение оптимальных соотношений в катионной серии опыта:
OB_K 0,355
OB_Ca= 0,305
OB= = 0,628
F 0,88 ˙ 3 (0,305 + 0,16) 0,6 0,628
OP_K= 0,392
OP_Ca= 0,258
OP= 0,352
Оптимальные соотношения между К⁺Ca²⁺ H₄⁺ равны 0,392 0,258 0,352. Аналогично находим оптимум между парными соотношениями N K в смешанной серии опыта (7 и 8 варианты).

OB_N 0,59
OB_K= 0,409
F 0,88 ˙ 2 ˙ (0,409 + 0,147) 0,6 0,379
OP_N 0,650
OP_K= 0,350 Оптимальные соотношения между NO₃^- K⁺ равны 0,65 0,35. Далее рассуждаем следующим образом: на 65 частей NO₃^- приходится 35 частей К⁺. Сколько должно приходиться К⁺ на 72,5 частей NO₃^-? Строим пропорцию.

65 NO₃ 35 К
х 39 К⁺.

72,5 х Из катионного соотношения известно, что на 39,2 части К⁺ приходится 25,8 частей Сa²⁺ и 35,2 частей NH₄⁺. А сколько Са²⁺ и NH₄⁺ должно приходиться на 39 частей К⁺?
39,2 К⁺ 25,8 Са²⁺ 39,2 К⁺ 35,2 NH₄⁺
39,0 х 39,0 y
х 25,7 y 35,0 Таким образом, соотношения между NO₃^-SO₄^2-: PO₄^3- K⁺ Ca²⁺ NH₄⁺равно 72,515,4 12,1 39,0 25,7 35,0 (в м ˙ экв).

Сумма ионов должна быть равна 100 м экв, а в данном соотношении она равна 199,7 м экв. Поэтому каждый член соотношения ионов необходимо уменьшить в 1,1997 раза или в 2 раза. Тогда получим оптимальные соотношения ионов NO₃^- SO₄^2- PO₄^3- K⁺Ca²⁺ NH₄⁺, равным 36,25 7,7 6,0 19,5 12,917,5, что после округления до целых будет выглядеть, как 36: 8 6 19 13 18.

В результате экспериментов на всех этапах культивирования смородины in vitro были получены оптимальные соотношения между 6 наиболее важными макроионами питательной среды, которые составили:
I на этапе введения в культуру NO₃^-SO₄^2- PO₄^3- K⁺ Ca²⁺: NH₄⁺ 30 8 1820 12 12 (питательная среда с таким соотношением макроионов была названа нами РСl);
II на этапе размножения NO₃^- SO₄^2-PO₄^3- K⁺ Ca²⁺ NH₄⁺= 36 8 6 19 1318 (питательная среда с таким соотношением ионов была названа нами РС4);
III на этапе укоренения NO₃^- SO₄^2-PO₄^3- K⁺ Ca²⁺ NH₄⁺= 24 7 15 21 1419 (питательная среда с таким соотношением ионов была названа нами РС7).

В солевом выражении полученные соотношения представлены в табл. 4.

После нахождения оптимальных соотношений макроионов питательных сред для каждого этапа культивирования in vitro, полученные среды испытали для размножения и укоренения эксплантов двух сортов смородины.

I этап введения в культуру. Сравнительное изучение влияния полученной среды РС1 для этапа введения в культуру со средой МС (контроль) показало преимущество предложенной среды РС1 (табл. 5). У эксплантов сортов черной смородины Загадка, Белорусская сладкая, Ширяевская питательная среда РС 1 способствовала увеличению в 2-2,6 и 4,8 раза, соответственно, роста побегов и продлению ростовой активности экспланта в течение пассажа. В контроле еще через две недели с начала пассажа наступала приостановка роста вследствие образования черного раневого каллуса плотной консистенции, что сдерживало поступление питательных веществ вглубь экспланта. У сортов красной смородины на среде РС1 рост побегов увеличился на 50-70% по сравнению с контролем.

II этап размножения. Как показал опыт, все испытанные сорта смородины развивались активнее на среде РС4, чем на среде МС (табл. 6).

В результате посадки эксплантов сорта Ранняя сладкая на среду РС4 уровень размножения увеличился в 7,5 раз, у сорта Ширяевская в 6,9 раза, у более пластичного сорта Чулковская, который хорошо размножается на стандартной среде, уровень размножения повысился в 1,5 раза. Период активного роста побегов на среде РС4 был на 1 неделю продолжительнее, чем на среде МС.

III этап укоренения побегов. В результате применения питательной среды РС7 удалось добиться 100%-ной укореняемости почти у всех испытанных сортов смородины (табл. 7).

Полученное соотношение макроионов питательной среды РС7 обеспечило более активный рост корневой системы эксплантов. Длина корней I-го порядка ветвления в среднем на 78% была выше контроля (среда МС). Появление корней 2-го порядка ветвления у этих растений отмечалось на 5 дней раньше контроля. По количеству образовавшихся корней I-го порядка экспланты на среде РС7 превосходили таковые на среде МС на 68,8% У сорта Медведица количество корней этого порядка превышало контроль в 2,27 раза. Все эти преимущества обеспечили получение более качественных микрорастений смородины, которые значительно легче и практически без потерь перенесли адаптацию после перенесения их из культуральных сосудов в нестерильные условия.

Все эти преимущества оптимизированных соотношений в сравнении с общепринятой средой МС способствовали повышению эффективности метода клонального микроразмножения этой ценной культуры и увеличению выхода посадочного материала с единицы площади. Это позволило снизить затраты труда и расходы на оборудование и хим. реактивы для получения I-го растения на 20,8% и сделать клональное микроразмножение смородины прибыльным с уровнем рентабельности 30%
Использование предложенного способа оптимизации соотношений между NO₃^- SO₄^2- PO₄^3- K⁺ Ca²⁺ NH₄⁺ не требует большого количества эксплантов, так как схема вариантов опыта включает всего 8 вариантов, не требуется помощь ЭВМ и сложные математические расчеты.

Использование: для клонального размножения смородины. Сущность изобретения: размножение смородины в культуре ткани проводят вычленения экспланта и последующего культивирования на этапах введения в культуру, размножения и укоренения на питательной среде, по качественному составу соответствующей среде Мурасиге-Скуга. Соотношение ионов NO-3

:SO24^-:PO34^-:K⁺:Ca²⁺:NH+4 на этапе введения в культуру равно 30:8:18:20:12:12, на этапе размножения 36:8: 6: 19: 13: 18 и на этапе ускоренения 24:7:15:21:14:19. На каждом из этапов культивирования суммарное содержание этих ионов равно 100 м экв. 1 ил. 7 табл.

СПОСОБ РАЗМНОЖЕНИЯ СМОРОДИНЫ IN VITRO, включающий вычленение экспланта и последующее культивирование на этапах введения в культуру, размножения и укоренения на питательной среде, по качественному составу соответствующей среде Мурасиге-Скуга, отличающийся тем, что на этапе введения в культуру соотношение ионов NO-3

:SO24^-:PO34^-:K⁺:Ca²⁺:NH+4 равно 30:8:18:20:12:12 на этапе размножения соотношение NO-3:SO24^-:PO34^-:K⁺:Ca²⁺:NH+4 равно 36:8:6:19:13:18, на этапе укоренения соотношение NO-3:SO24^-:PO34^-:K⁺:Ca²⁺:NH+4 равно 24:7:15:21:14: 19 соответственно, при этом суммарное содержание этих ионов в среде на каждом из этапов культивирования равно 100 М · экв.