ЦЕРЕБРОПРОТЕКТОР И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2002 года по МПК A61K35/78 

Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии, и касается способа получения церебропротектора из растительного сырья. Оно может быть использовано для фармакологической коррекции состояний сопровождающихся гипоксией мозга и усилением процессов перекисного окисления липидов (сопровождают любой патологический процесс в организме).

Известным церебропротектором синтетического происхождения является пирацетам [6, 12] . Однако большое число случаев непереносимости синтетических лекарственных препаратов, побочные эффекты при их применении, а иногда и возникновение лекарственной болезни из-за их токсичности заставляет обращать внимание на возможность использования в медицине препаратов растительного происхождения, не создающих ксенобиотической нагрузки на организм.

В настоящее время в медицине известно использование церебропротекторов с антигипоксической активностью растительного происхождения для профилактики состояний, сопровождающихся гипоксией, например бадан толстолистный [8].

Прототипом является церебропротектор - экстракт шлемника байкальского (ЭШБ).

Шлемник байкальский это многолетнее травянистое растение, содержащее ряд биологически активных веществ: флавоноиды, дубильные вещества пирокатехиновой группы, эфирные масла [2].

Известен способ получения церебропротектора бадана толстолистного. Церебропротектор получен путем экстрагирования измельченных листьев растения 70% этиловым спиртом [9].

Наиболее близким (прототипом) способом получения церебропротектора, является способ получения шлемника байкальского. ЭШБ получен путем экстрагирования измельченной подземной части растения 70% этиловым спиртом в колбе в течение 1 часа. Объединенные извлечения упаривают под вакуумом досуха [7]. Однако данные церебропротекторы обладают антигипоксической активностью в диапазоне больших доз - 200 мг/кг.

Задачей заявляемого изобретения является расширение арсенала средств защиты головного мозга за счет обнаружения препаратов с более высокой специфической активностью, низкими побочными эффектами, малой токсичностью и действующих в диапазоне малых доз (2-5 мг/кг).

Поставленная задача решается церебропротектором - высушенный экстракт из воздушно-сухих побегов всех видов водяники, полученного путем трехступенчатого экстрагирования хлороформом в соотношении сырье : экстрагент 1 : 10, ацетоном экстракт : экстрагент 1 : 10, гексаном экстракт : экстрагент 1 : 5. Причем экстракцию хлороформом проводят трижды при температуре 60-62^oС в течение одного часа, экстракцию ацетоном проводят трижды при комнатной температуре, ацетоновый экстракт выпаривают и высушивают до получения вязкой массы, высушенный ацетоновый экстракт экстрагируют трижды гексаном при температуре 60^oС, отфильтровывают теплым и подвергают сублимационной сушке.

Растения рода водяника и в особенности водяника черная в народной медицине применяют как средство купирования судорожных и эпилептиформных припадков, лечения длительно не заживающих ран, при заболеваниях печени и почек. Экстракты видов водяники были нами исследованы как противосудорожный препарат [5, 10]. В качестве церебропротектора с антигипоксической активностью в литературе не описан. Виды водяники - Empetrum nigrum, Empetrum hermaphroditum, Empetrum Subhobrcticum представляют собой вечнозеленые, сильно ветвистые и распластанные по почве кустарники до 1 м длиной, относящиеся к семейству Empetrceae. В побегах растения присутствуют восстанавливающие вещества (аскорбиновая кислота), тритерпеноиды (урсоловая кислота), органические кислоты (бензойная, кофейная), макроциклические алканы, дубильные вещества и флавоноиды различной степени окисленности: кемпферол, кверцетин и его гликозиды, 2, 4-дигидроксихалкон, дигидроксихалконы эмпетрон и метилэмпетрон [1].

Способ получения экстракта осуществляют следующим образом. Измельченные воздушно-сухие побеги водяники заливают хлороформом и экстрагируют трижды при температуре 60-62^oС в течение 1 часа при соотношении сырье : экстрагент 1 : 10. Полученные извлечения процеживают, объединяют и удаляют растворитель под вакуумом досуха. Сухой хлороформный экстракт при комнатной температуре трижды обрабатывают ацетоном (соотношение экстракт : экстрагент 1 : 10) при растирании до получения однородной массы, дают отстояться и фильтруют. Объединенные ацетоновые экстракты упаривают при пониженном давлении и высушивают в вакуум-сушильном шкафу до получения вязкой темно-коричневой массы (выход ацетонового экстракта по загруженному сырью составляет 8,94%). Полученный ацетоновый экстракт обрабатывают при растирании трижды теплым гексаном (60^oС) (соотношение экстракт : экстрагент 1 : 5) и отфильтровывают теплым (Э. В. 1), а оставшийся после экстракции гексаном продукт подвергают сублимационной сушке до получения сухой коричневато-черной массы (Э.В.2). Выход целевого продукта по загруженному сырью составляет 6,4%.

Пример 1.

50 г воздушно-сухих побегов водяники черной (Empetrum nigrum L.) экстрагируют трижды хлороформом (соотношение сырье : экстрагент 1 : 10) в колбе, снабженной обратным холодильником при температуре кипения растворителя (60^oС) в течение 1 часа. Объединенные извлечения упаривают под вакуумом досуха. Полученный сухой экстракт (6, 7 г) обрабатывают ацетоном трижды при комнатной температуре, растирая до получения однородной массы при соотношении хлороформный экстракт : экстрагент 1 : 10, осадок отфильтровывают, объединенные ацетоновые экстракты упаривают при пониженном давлении и сушат в вакуум-сушильном шкафу до получения темно-коричневой вязкой массы. 4,47 г ацетонового экстракта растирают с 23 мл теплого гексана (60^oС), который отфильтровывают теплым. Обработку остатка проводят, как описано выше, дважды. Оставшийся после обработки гексаном продукт подвергают сублимационной сушке до получения сухой коричневато-черной массы. Выход целевого продукта по загруженному сырью составляет 6,4%.

Пример 2.

Из 50 г воздушно-сухих побегов водяники черной (Empetrum nigrum L.) получают ацетоновый экстракт по методике, приведенной в примере 1. Полученный ацетоновый экстракт (4,47 г) растирают с 9 мл теплого гексана (60^oС), который отфильтровывают теплым. Обработку остатка проводят, как описано выше, дважды. Оставшийся после обработки гексаном продукт подвергают сублимационной сушке до получения сухой коричневато-черной массы. Выход целевого продукта по загруженному сырью составляет 6,9%.

Пример 3.

Из 50 г воздушно-сухих побегов водяники черной (Empetrum nigrum L.) получают ацетоновый экстракт по методике, приведенной в примере 1. Полученный ацетоновый экстракт (4,47 г) растирают с 14 мл теплого гексана (60^oС), который отфильтровывают теплым. Обработку остатка проводят, как описано выше, дважды. Оставшийся после обработки гексаном продукт подвергают сублимационной сушке до получения сухой коричневато-черной массы. Выход целевого продукта по загруженному сырью составляет 6,7%.

Пример 4.

Из 50 г воздушно-сухих побегов водяники черной (Empetrum nigrum L.) получают ацетоновый экстракт по методике, приведенной в примере 1. Полученный ацетоновый экстракт (4,47 г) растирают с 36 мл теплого гексана (60^oС), который отфильтровывают теплым. Обработку остатка проводят, как описано выше, дважды. Оставшийся после обработки гексаном продукт подвергают сублимационной сушке до получения сухой коричневато-черной массы. Выход целевого продукта по загруженному сырью составляет 6,3%.

Пример 5.

Из 50 г воздушно-сухих побегов водяники черной (Empetrum nigrum L.) получают ацетоновый экстракт по методике, приведенной в примере 1. Полученный ацетоновый экстракт (4,47 г) растирают с 45 мл теплого гексана (60^oС), который отфильтровывают теплым. Обработку остатка проводят, как описано выше, дважды. Оставшийся после обработки гексаном продукт подвергают сублимационной сушке до получения сухой коричневато-черной массы. Выход целевого продукта по загруженному сырью составляет 6,2%.

Пример 6.

Из 50 г воздушно-сухих побегов водяники черной (Empetrum nigrum L.) получают ацетоновый экстракт по методике, приведенной в примере 1. Полученный ацетоновый экстракт (4,47 г) растирают с 23 мл теплого гексана (60^oС), который отфильтровывают теплым. Обработку остатка проводят, как описано выше, еще 1 раз. Оставшийся после обработки гексаном продукт подвергают сублимационной сушке до получения сухой коричневато-черной массы. Выход целевого продукта по загруженному сырью составляет 67%.

Пример 7.

Из 50 г воздушно-сухих побегов водяники черной (Empetrum nigrum L.) получают ацетоновый экстракт по методике, приведенной в примере 1. Полученный ацетоновый экстракт (4,47 г) растирают с 23 мл теплого гексана (60^oС), который отфильтровывают теплым. Обработку остатка проводят, как описано выше, трижды. Оставшийся после обработки гексаном продукт подвергают сублимационной сушке до получения сухой коричневато-черной массы. Выход целевого продукта по загруженному сырью составляет 6,2%.

Пример 8.

Из 50 г воздушно-сухих побегов водяники черной (Empetrum nigrum L.) получают ацетоновый экстракт по методике, приведенной в примере 1. Полученный ацетоновый экстракт (4,47 г) растирают с 23 мл теплого гексана (60^oС), который отфильтровывают теплым. Обработку остатка проводят, как описано выше, четырежды. Оставшийся после обработки гексаном продукт подвергают сублимационной сушке до получения сухой коричневато-черной массы. Выход целевого продукта по загруженному сырью составляет 6,0%.

Пример 9.

Из 50 г воздушно-сухих побегов водяники гермафродитной (Empetrum hermaphroditum) получают ацетоновый экстракт по методике, приведенной в примере 1. Полученный ацетоновый экстракт (4,47 г) растирают с 23 мл теплого гексана (60^oС), который отфильтровывают теплым. Обработку остатка проводят, как описано выше, дважды. Оставшийся после обработки гексаном продукт подвергают сублимационной сушке до получения сухой коричневато-черной массы. Выход целевого продукта по загруженному сырью составляет 6,3%.

Пример 10.

Из 50 г воздушно-сухих побегов водяники субголарктической (Empetrum subholarcticum) получают ацетоновый экстракт по методике, приведенной в примере 1. Полученный ацетоновый экстракт (4,47 г) растирают с 23 мл теплого гексана (60^oС), который отфильтровывают теплым. Обработку остатка проводят, как описано выше, дважды. Оставшийся после обработки гексаном продукт подвергают сублимационной сушке до получения сухой коричневато-черной массы. Выход целевого продукта по загруженному сырью составляет 6,2%.

В результате исследований выяснено, что все используемые виды водяники (растения рода Empetrum) имеют идентичный химический состав и незначительно отличаются по количественному содержанию.

В процессе поиска оптимальных условий получения целевого продукта после обработки гексаном ацетонового экстракта всех видов водяники было изучено влияние ряда факторов (соотношения ацетоновый экстракт - гексан, кратность экстракции, температурный режим) на выход целевого продукта (табл. 1-4). При этом установлено, что обработку гексаном ацетонового экстракта следует вести при температуре 60^oС: понижение температуры нецелесообразно, так как снижается степень очистки целевого продукта от сопутствующих веществ из-за уменьшения их растворимости в гексане; повышение температуры до температуры кипения гексана (68^oС) также нецелесообразно, т.к. это существенно не влияет на степень очистки целевого продукта (табл. 2) и ведет к значительной потере растворителя за счет интенсивного испарения.

Оптимальное соотношение сырье : экстрагент 1 : 10. При уменьшении количества хлороформа, например 1 : 7, происходит снижение степени очистки целевого продукта от сопутствующих веществ.

Оптимальное соотношение хлороформный экстракт : экстрагент 1 : 10. При уменьшении количества ацетона, например 1 : 7, происходит уменьшение выхода целевого продукта.

Оптимальное соотношение ацетоновый экстракт : экстрагент 1 : 5. При уменьшении количества гексана, например, 1 : 3, происходит снижение степени очистки целевого продукта от сопутствующих веществ. Сдвиг в сторону увеличения соотношения нецелесообразен, т. к. это существенно не влияет на выход целевого продукта (табл. 3).

Наилучшая кратность экстракции равна 3. При уменьшении кратности экстракции до 2 степень очистки целевого продукта от сопутствующих веществ уменьшается, а увеличение, например до 4, существенно не влияет на выход целевого продукта (табл. 4).

Таким образом, предлагаемый авторами способ, позволяет получить средство, обладающее значительно большей церебропротекторной активностью: положительный эффект достигнут благодаря трехступенчатой экстракции: хлороформом, ацетоном, гексаном и подобранному оптимальному режиму получения целевого продукта.

Новый способ получения экстрактов, повышающий содержание биологически активных веществ в целевом продукте, позволил нам увеличить антигипоксическую активность экстрактов растения (увеличивать время жизни животных в условиях НГГ) и тормозить в ткани мозга процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ), вызванные гипоксической травмой.

В результате получили новый церебропротектор растительного происхождения. Церебропротекторное действие изучалось на предложенной модели гипоксии экспериментальным путем.

Пример 11.

Антигипоксическое действие воздушно-сухих побегов водяники черной (Empetrum nigrum L.) изучали на модели нормабарической гиперкапнической гипоксии (НГГ), животных помещали в сосуд объемом 0,2 л. Скрининг проводился на белых мышах (самцы, беспородные), ЭВ вводили профилактически (1 раз/сутки, 5 дней, внутрижелудочно), в дозах 2, 5, 10, 50 и 200 мг/кг. В качестве препарата сравнения использовали пирацетам в антигипоксических дозах 100, 200, 300, 400 и 500 мг/кг [3]. Контрольная группа получала эквиобъемное количество (0,3 мл/20 г) растительного масла. Последнее введение препаратов проводили за сутки до гипоксии. Регистрировали время жизни животных до первого агонального вдоха. Установлено, что экстракты водяники в отличие от пирацетама оказывают отчетливое антигипоксическое действие при НГГ. Максимальный эффект проявлялся у Э.В.1 в дозе 2 мг/кг, а Э.В.2 в дозе 5 мг/кг и составлял соответственно 18,7% и 24% увеличения времени жизни при гипоксии (р<0.05).

Пример 12.

Антигипоксическое действие воздушно-сухих побегов водяники субголарктической (Empetrum subholarcticum) изучали на модели НГТ, животных помещали в сосуд объемом 3 л. Скрининг проводился на белых крысах (самцы, беспородные), Э.В.2 вводили профилактически (1 раз/сутки, 5 дней, внутрижелудочно), в дозе 300 мг/кг [3] . Контрольная группа получала эквиобъемное количество растительного масла. Последнее введение препаратов проводили за сутки до гипоксии. Регистрировали время жизни животных до первого агонального вдоха. Установлено, что Э. В. 2 проявляет отчетливое антигипоксическое действие при НГТ, увеличивая временя жизни при гипоксии на 38,8% (р<0.05).

Пример 13.

Антиоксидантное действие воздушно-сухих побегов водяники гермафродитной (Empetrum hermaphroditum) изучали на модели ННГ в сосуде объемом 3 л. Исследование проводили на крысах (белых беспородных самцах массой 170-200 г). Э. В.1 и 2 вводили профилактически (1 раз/сутки, 5 дней внутрижелудочно) в дозе 312 мг/кг. В качестве препарата сравнения использовали пирацетам в антигипоксической дозе 400 мг/кг [3]. Контрольная группа получала эквиобъемное количество растительного масла. Последнее введение препаратов проводили за сутки до гипоксии. После появления агонального дыхания животное извлекали из сосуда, декапитировали, извлекали мозг и гомогенизировали в охлажденной до 0^oС среде гомогенизации: 2,5•10^-1 М КС1, 17.5•10^-2 М Hepes-буфер, (рН 7,2). По уровню накопления малонового диальдегида (реакция с тиобарбитуровой кислотой), регистрировали интенсивность развития спонтанного и Fe-аскорбат - индуцированного ПОЛ. Уровень накопления МДА выражали в условных единицах. ТБК-активные продукты определяли в пробе через каждые 15 минут в течение часа [4]. Исследования проводили на флуориметре Hitachi М-850 (λeх = 355 нм и λ ем = 450 нм) [11].

Установлено, что все исследованные препараты ограничивают развитие спонтанного ПОЛ в ткани мозга после ННГ.

Таким образом, экспериментальные исследования показали, что экстракты водяники в качестве церебропротектора обладают выраженным антигипоксическим и антиоксидантным действием. Применение экстрактов водяники в клинической практике в свете вышесказанного даст более высокий эффект и позволит не только расширить арсенал препаратов растительного происхождения, обладающих церебропротекторной активностью, но и использовать биологически активные вещества экстрактов, которые являются отходами производства в технологической схеме получения противосудорожного средства "Эмпетрин".

Список литературы
1. Васильев В.Н. Род Empetrum. - 1961. -М.-Л.: АН СССР. - 132 с.

2. Гольдберг Е.Д. Шлемник байкальский, Томский университет, Томск -1994.

3. Колла В. Э., Сыропятов Б.Я. Дозы лекарственных средств и химических соединений для лабораторных животных. М.: Медицина - 1998. - С. 107.

4. Орехович В.Н. // Современные методы в биохимии. Медицина - 1997. -С. 66-68.

5. Патент РФ 1647966. Способ получения средства, обладающего противосудорожным действием.

6. Рощина Л.Ф., Островская Р.У. Влияние пирацетама на устойчивость организма к гипоксии. //Фармакология и токсикол. - 1981, 2, с. 210-213.

7. Сайфутдинов P.P., Хазанов В.А. Влияние шлемника байкальского на окисление янтарной кислоты митохондриями головного мозга при гипоксии. //Экспериментальная и клиническая фармакология. - 1998. Т. 61. - С. 27-29.

8. Смирнова Н. Б. Церебопротекторное действие экстракта листа бадана толстолистного при гипоксии головного мозга крыс: Автореф. Дис...к.м.н. - Томск, 1999.

9. Суслов Н.И. Патогенетическое обоснование психофармакологических эффектов препаратов природного происхождения; Дисс.... доктора мед. наук. - Томск, 1995.

10. Ханин Г.З. Противосудорожный препарат из водяники черной: Автореф. Дисс...к.м.н. - Томск, 1988.

11. Kitai Т., Tanaka A., Tokuka A. et al. // Analytikal biochemistri. - 1992. - Vol. 206. - P. 131-136.

12. H. Van Hoof., Nootropil: Basik scientific and clinical data. Medical Profession prepared Pharmaceutical Division, Brussel, 1980, P. 12.

Изобретение относится к медицине, а именно к созданию церебропротектора растительного происхождения с антигипоксической активностью для профилактики состояний, сопровождающихся гипоксией. Предложен церебропротектор из экстракта всех видов водяники, полученного путем трехступенчатого экстрагирования хлороформом в соотношении сырье : экстрагент 1 : 10, ацетоном - экстракт : экстрагент 1 : 10, гексном - экстракт : экстрагент 1 : 5. Предложен также способ получения церебропротектора. Предложенный церебропротектор обладает антигипоксической активностью в диапозоне больших доз - 200 мг/кг, низкими побочными эффектами и малой токсичностью. 2 с. и 3 з.п. ф-лы, 4 табл.

1. Церебропротектор, содержащий высушенный экстракт из растительного сырья, отличающийся тем, что он содержит экстракт из воздушно-сухих побегов видов водяники, полученный трехступенчатым экстрагированием хлороформом в соотношении сырье: экстрагент 1: 10, ацетоном - экстракт: экстрагент 1: 10, гексаном - экстракт: экстрагент 1: 5. 2. Способ получения церебропротектора путем экстракции растительного сырья, отличающийся тем, что измельченные воздушно-сухие побеги всех видов водяники трижды экстрагируют хлороформом при соотношении сырье: экстрагент 1: 10, сухой хлороформный экстракт трижды экстрагируют ацетоном при соотношении экстракт: экстрагент 1: 10 до получения однородной массы, полученный высушенный ацетоновый экстракт экстрагируют при растирании трижды теплым гексаном при соотношении экстракт: экстрагент 1: 5, отфильтровывают и подвергают сублимационной сушке. 3. Способ получения церебропротектора по п. 2, отличающийся тем, что экстракцию хлороформом проводят при температуре 60-62^oС в течение часа. 4. Способ получения церебропротектора по п. 2, отличающийся тем, что экстракцию ацетоном проводят при комнатной температуре, ацетоновые экстракты упаривают при пониженном давлении и высушивают до получения вязкой массы. 5. Способ получения церебропротектора по п. 2, отличающийся тем, что высушенный ацетоновый экстракт экстрагируют теплым гексаном при растирании при температуре 60^oС и отфильтровывают теплым.