СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭКСТРАКТА, ОБЛАДАЮЩЕГО ПРОТИВОИШЕМИЧЕСКОЙ И НООТРОПНОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 1998 года по МПК A61K35/78 

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и касается способов получения биологически активных веществ из растительного сырья.

В проанализированной авторами литературе не найдено источника информации,в котором описывается получение экстракта, обладающего одновременно противоишемической и ноотропной активностью. Таким образом, предложенный способ не имеет прототипа и является пионерским.

Целью изобретения является расширение арсенала средств, обладающих ноотропным и противоишемическим действием, и повышение выхода целевого продукта, а также сокращение времени его получения.

Поставленная цель достигается тем, что экстрагируют растительное сырье - надземную часть княжика сибирского - 25%-ным раствором этанола при 70-80^oC в течение 60-120 мин при соотношении сырье: экстрагент (1:10)-(1:12).

Новым в предлагаемом способе является то, что экстрагируют надземную часть княжика сибирского 25%-ным раствором этанола при 70-80^oC в течение 60-120 мин при соотношении сырье: экстракт (1:10)-(1:12).

В проанализированной литературе не найдено данных отличительных признаков.

Для специалиста не является очевидным, что методика выполнения данного способа приводит к появлению ноотропных и противоишемических свойств, следовательно, данный способ не вытекает из уровня техники.

Данный способ можно с успехом использовать в фармацевтической промышленности, поэтому оно соответствует критерию "промышленно применимо", "новизна" и "изобретательский уровень".

Сущность изобретения заключается в том, что измельченные воздушно-сухие листья и стебли княжика сибирского (Atragenae sibirica,L.) - надземную часть - заливают 25%-ным раствором этанола и экстрагируют при 70-80^oC в течение 60-120 мин при соотношении сырье: экстрагент (1:10)-(1:12). Полученное извлечение процеживают через 4 слоя марли и упаривают под вакуумом досуха. Готовый высушенный экстракт представляет собой темно-коричневый гигроскопичный порошок со специфическим запахом. Выход продукта по загруженному сырью составляет 20-22,5%, время процесса - 4-5 ч.

Примеры конкретного выполнения способа.

Пример 1. 50 г воздушно-сухих измельченных листьев и стеблей княжика сибирского (Atragenae Sibirica, L) заливают 500 мл 25%-ного раствора этанола и нагревают на водяной бане с обратным холодильником при 60-63^oC в течение 30 мин. Извлечение отделяют от обработанного сырья, процеживанием через 4 слоя марли и упаривают под вакуумом досуха. Выход сухого экстракта 4,75 г, что составляет 9,50% от массы исходного сырья.

Пример 2. 50 г воздушно-сухих измельченных листьев и стеблей княжика сибирского (Atragenae Sibirica, L.) заливают 500 мл воды дистиллированной и нагревают на водяной бане с обратным холодильником при 60-63^oC в течение 60 мин. Извлечение отделяют от обработанного сырья процеживанием через 4 слоя марли и упаривают под вакуумом досуха. Выход сухого экстракта 4,95 г, что составляет 9,90% от массы исходного сырья.

Пример 3. 50 г воздушно-сухих измельченных листьев и стеблей княжика сибирского (Atragenae Sibirica, L.) заливают 500 мл 40%-ного раствора этанола и нагревают на водяной бане с обратным холодильником при 50-63^oC в течение 60 мин. Извлечение отделяют от обработанного сырья процеживанием через 4 слоя марли и упаривают под вакуумом досуха. Выход сухого экстракта 9,32 г, что составляет 18,64% от массы исходного сырья.

Пример 4. 50 г воздушно-сухих измельченных листьев и стеблей княжика сибирского (Atrarenae sibirica, L.) заливают 500 мл 25%-ным раствором этанола и нагревают на водяной бане с обратным холодильником при 79^oC в течение 90 мин. Извлечение отделяют от обработанного сырья процеживанием через 4 слоя марли и упаривают под вакуумом досуха. Выход сухого экстракта 11,25 г, что составляет 22,50% от массы исходного сырья.

Пример 5. 50 г воздушно-сухих измельченных листьев и стеблей княжика сибирского (Atragenae Sibirica, L.) заливают 500 мл 25%-ного раствора этанола и нагревают на водяной бане с обратным холодильником при 70^oC в течение 30 мин. Извлечение отделки от обработанного сырья процеживание через 4 слоя марли и упаривают под вакуумом досуха. Выход сухого экстракта 11,01 г, что составляет 22,02% от массы исходного сырья.

Пример 6. 50 г воздушно-сухих листьев и стеблей княжика сибирского (Atragenae sibirica, L.) заливают 400 мл 25%-ного раствора этанола и нагревают на водяной бане с обратным холодильником при 80^oC в течение 120 мин. Извлечение отделяют от обработанного сырья процеживанием через 4 слоя марли и упаривают под вакуумом досуха. Выход сухого экстракта 9,16 г, что составляет 18,32% от массы исходного сырья.

Пример 7. 50 г воздушно-сухих измельченных листьев и стеблей княжика сибирского (Atragenae sibirica, L.) заливают 600 мл 25%-ного раствора этанола и нагревают на водяной бане с обратным холодильником при 80^oC в течение 20 мин. Извлечение отделяют от обработанного сырья процеживанием через 4 слоя марли и упаривают под вакуумом досуха. Выход сухого экстракта 11,32 г, что составляет 22,74% от массы исходного сырья.

Влияние концентрации этанола, температурного режима, времени экстракции, соотношение сырья и экстрагента можно проследить по табл. 1-4 соответственно.

Обоснование режимов.

В процессе поиска оптимальных условий получения экстракта из надземной части княжика сибирского было изучено влияние ряда факторов на выход целевого продукта (табл. 1-4). При этом установлено, что экстракцию сырья следует вести при 70-80^oC; понижение температуры ведет к уменьшению выхода целевого продукта за счет уменьшения его растворимости, а дальнейшее повышение температуры не рационально, так как выход экстракта практически не увеличивается (табл. 2).

Оптимальной концентрацией этанола является 25%; изменение ее в сторону уменьшения или увеличения ведет к снижению фармакологической активности.

Наиболее оптимальным временем экстракции является 60-120 мин; в случае уменьшения продолжительности процесса снижается выход целевого продукта; увеличение же времени экстракции нерационально, т.к. при этом выход экстракта возрастает незначительно (табл.3), наилучшее соотношение сырья и экстрагента (1: 10)-(1: 12) (табл.4). Сдвиг его в сторону уменьшения количества экстрагента приводит к снижению выхода целевого продукта. Сдвиг в сторону увеличения нерационален, так как выход готового экстракта возрастает незначительно.

Пример 8. Было проведено исследование влияния экстрактов сибирского, полученных при различной концентрации алкоголя в экстрагенте, на ориентировочно-исследовательское поведение в открытом поле и обучаемость условному рефлексу пассивного избегания у мышей, перенесших гипоксическую травму (табл.5). Так же было исследовано влияние температуры экстракции на биологическую активность конечного продукта. В данном случае для более точной оценки были дополнительно выполнены исследования по влиянию препарата на течение иммобилизационного стресса (табл.6).

Ориентировочно-исследовательское поведение в открытом поле представляет из себя один из наиболее часто используемых методических приемов, применяемых для суждения о функциональном состоянии центральной нервной системы [1,2] . Экспериментальная установка " открытое поле" представляло собой камеру размером 40х195х40х20 см с квадратным полом и стенками белого цвета. Ее пол, разделенный на 16 квадратов, имел в каждом из них круглое отверстие диаметром 3 см. Сверху камера освещалась электрической лампой накаливания мощностью 100 Вт,расположенной на высоте 1 м от пола. Мышь помещалась в один из ее углов и в течение 2 мин регистрировалась количество перемещений с квадрата на квадрат (горизонтальная активность), количество обследований отверстий (норковый рефлекс), количество вставаний на задние лапки (вертикальная активность), количество умываний (груминг) и количество дефекаций по количеству фекальных шариков, вычислялся коэффициент асимметрии поведения, в виде отношения количества горизонтальных перемещений к общей двигательной активности, выраженного в процентах.

Гипоксическая травма исследовалась в условиях гипоксии гермобъема. Для более детальной оценки влияния гипоксической травмы на животных у мышей изучалась не только выживаемость в условиях гипоксии, но и оценивалось функциональное состояние центральной нервной системы по состоянию ориентировочно-исследовательского поведения и памяти по воспроизведению условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ), который вырабатывался непосредственно перед гипоксическим воздействием, как это описано ниже. Гипоксия гермобъема моделировалась помещением мышей, предварительно отобранных по весу (20-21 г), в герметически закрываемую камеру объемом 250 мл. Мыши выдерживались там до наступления судорожного припадка, после чего животных извлекали из камеры, давали отсидеться 1 ч и затем у них изучалось ориентировочно-исследовательское поведение в "открытом поле". Методика условного рефлекса пассивного избегания [1] основана на подавлении врожденного рефлекса предпочтения темного пространства, имеющегося у грызунов. Экспериментальная установка представляла из себя камеру,состоящую из двух отсеков - большого и малого темного. Животное помещалось в светлый отсек и через некоторое время переходило в темный, после чего отверстие, соединяющее оба отсека, перекрывалось дверкой и на пол темного отсека, представляющий собой решетку из параллельных чередующихся электродов, подавали электрический ток импульсами продолжительностью 50 мс, частотой 5 Гц и амплитудой 50 мА. Через 20 с дверку открывали и животное могло выскочить в светлый отсек с обычным полом. В результате описанной процедуры у животных вырабатывался условный рефлекс избегания темного пространства. Для выработки рефлекса животное помещали в светлый отсек в угол камеры,противоположный от входа, и наблюдали в течение 3 мин. Регистрировали время первого захода в темный отсек (латентное время захода - ЛТ), суммарное время пребывания в темном отсеке, количество животных с выработанным рефлексом. Хорошо выработанным рефлекс считался в том случае, когда в течение всех трех минут наблюдения животное не совершило перехода из светлого отсека в темный. Если латентное время захода превышало 150 с, это считалось признаком наличия рефлекса. Проверка наличия рефлекса осуществлялась через 24 и 48 ч после гипоксического воздействия.

Иммобилизационный стресс создавался подвешиванием мышей за шейную складку на 22 ч [3]. По истечении времени мышей снимали, через 15 мин после снятия у них изучали ориентировочно-исследовательское поведение в открытом поле, регистрировали эмоциональную реакцию по методу Brady и Nauta [4], подсчитывали количество лейкоцитов в периферической крови, после чего животных забивали и определяли вес надпочечников, селезенки и тимуса, рассчитывали весовые коэффициенты органов на 20 г массы животного. Затем по методу Добрякова [3] подсчитывали степень выраженного стресса в баллах. При оценке поведенческих показателей использовалась балльная шкала,аналогичная той, которая принята в методе Добрякова в нашей модификации [5].

Препараты вводили 5-кратно в течение 4 дней, предшествовавших моделированию экспериментальной методики, и 5-й раз за 1 ч до стрессирования или помещения в гермокамеру.

Результаты исследования приведены в табл. 5 и 6
Как видно из данных табл. 5, наилучшими показателями поведения отличаются мыши, перенесшие гипоксическую травму и получавшие экстракт княжика, приготовленный с использованием экстрагента, содержащего 25%-ный раствор этанола. У животных была наибольшая двигательная активность и показатели сохранности рефлекса максимально приближенные к животным интактного контроля.

Пример 9. Влияния экстракта княжика на течение ишемии головного мозга изучалось на модели ишемии средней тяжести, вызываемой полуторной перевязкой сонных артерий [6].Эксперименты были выполнены на 24-х крысах-самцах линии Wistar массой тела 200-240 г. Для создания ишемии у крыс под эфирным наркозом производилась перевязка левой общей сонной артерии и частичная перевязка правой сонной артерии с ограничением кровотока на 50%. Контрольным животным производилась ложная операция с рассечением кожи и выделением обеих сонных артерий без перевязки. Такая ишемия не вызывает гибели животных и ее проявление может быть оценено только по функциональным нарушениям. Критерием оценки тяжести повреждений, вызываемых ишемией, была степень нарушения процессов выработки и воспроизведения сложного питьевого условного рефлекса. Выработка рефлекса производилась в Т-образном лабиринте. Опыты выполнялись на крысах на фоне водной депривации, которая начиналась со вторых суток после перевязки артерий.

Лабиринт представлял собой установку, состоящую из одной стартовой камеры и двух систем коридоров, каждая из которых включала в себя по три Т-образных колена, спирально соединенные друг с другом и заканчивающихся целевыми камерами [7] . Процедура обучения выглядела таким образом: начиная со следующего дня после лишения крыс воды, в течение 2-х дней каждую крысу дважды в день на 20 мин с интервалом в 1 ч индивидуально помещали в лабиринт, где беспорядочно были расставлены 6 поилок (первый этап обучения). На третий день животное помещалось в стартовую камеру лабиринта, при этом все поилки из последнего были убраны. Краса начинала искала поилку, выходила из стартовой камеры и делала первый поворот в правую или левую часть лабиринта. Направление первого поворота фиксировалось и считалось предпочтительным направлением поворота для данного животного. Немедленно вслед за этим в целевую камеру, находящуюся в половине лабиринта, противоположной той, в которую крыса повернула в первый раз, становилась поилка. При всех последующих побежках поилка ставилась для данной крысы именно в эту целевую камеру. Это делалось для того, чтобы при становлении условного рефлекса исключить влияние предпочтительного поворота на процесс обучения. Каждое животное тестировалось в лабиринте таким образом в течение 15 мин, если оно не находило поилку раньше. Если животное не находило поилки в течение 15 мин, его помещали в целевую камеру, чтобы крыса могла напиться. Крысы, отказавшиеся искать поилку в течение первых 4-х побежек, из дальнейших экспериментов исключались. Таким образом, каждая крыса обучалась в течение 8 дней (2-й этап обучения - всего 8 побежек). При этом регистрировалось время достижения поилки, количество ошибок (заходы в "неправильные" рукава лабиринта и тупики), количество вертикальных стоек и груминг. О качестве обучения судили по сокращению времени достижения поилки и количества ошибок. Груминг и вертикальные стойки характеризовали смещенную и ориентировочно-исследовательскую активность соответственно. О функциональном состоянии центральной нервной системы судили по разнице показателей 6-й побежки, так как в этот день наблюдалась наибольшая разница между ложнооперированными крысами и животными ишемического контроля. Отказ от выполнения рефлекса после двух удачных нахождений поилки считался проявлением невропатической реакции [8] и оценивался как самостоятельный показатель в виде отношения числа невротических реакций за время обучения считая после 2-й побежки к общему числу побежек, считая после второй. Введение экстракта княжика начинали с момента лишения животных воды (всего 10 введений). После окончания обучения (8 побежек для всех крыс) животным давали отдохнуть 7 дней при свободном доступе к воде и на 8-е сутки после 24-часовой водной депривации из вновь помещали в лабиринт на одну побежку. Регистрируемые показатели были теми же.

Данные эксперимента приведены в табл. 7 и 8.

Как следует из данных табл. 7, ишемия вызывает существенное ухудшение показателей обучаемости, о чем свидетельствует прежде всего увеличение времени нахождения поилки. Источником увеличения данного показателя или главной причиной потери времени при поиске поилки выступает прежде всего увеличивающееся в 6,9 раза количество отказов, являющееся главным проявлением невротической реакции. Увеличивающееся количество вертикальных стоек и актов груминга не могут существенно повлиять на время достижения поилки, однако сами по себе они являются свидетельством существенного ухудшения качества условного рефлекса, так как говорят либо об уменьшении значимости специфической мотивации условно-рефлекторного акта, либо об астенизации самого условно-рефлекторного процесса.

Применение экстракта княжика привело к значительному улучшению исследуемых показателей практически до уровня ложнооперированных животных. При этом достаточно пропорционально улучшаются все показатели, характеризующие условно-рефлекторный процесс. Следует заметить, что экстракт княжика существенно превосходит прототип по главным показателям, а именно по снижению времени достижения поилки и по уменьшению количества отказов.

Как показывают данные,приведенные в табл.8, через 7 сут произошло практически полное восстановление функциональной активности мозга - показатели его функциональной активности практически полностью совпадают с соответствующими показателями ложнооперированных крыс. При этом заявляемый препарат практически не оказывает влияния на исследуемые показатели.

Результаты эксперимента показывают, что в условиях использованной модели экстракт княжика сибирского оказывал улучшающее действие на функциональную активность мозга только в условиях ее нарушения, вызванного ишемией.

Суммируя данные, приведенные в примерах 8 и 9 относительно характера биологической активности экстракта княжика сибирского, можно сделать вывод о том, что он обладает ноотропной и противоишемической активностью.

Источники информации:
1. Буреш Я., Бурешова О., Хьюстон дж. П. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения (пер. с англ. под ред. проф. А.С.Батуева). - М.: Высшая школа, 1991, с.398.

2. Walsh R. N. , Cummins R.A. The open-field test: a critical reniew// Psychol. Bull. - 1976, V.83/ - P.482-504.

3. Добряков Ю. И. Скрининговый метод оценки антистрессорного действия препаратов// Стресс и адаптация: Тез. Всесоюзн. симпозиума. - Кишинев, 1978, с.172.

4.Brady J.V. Nauta W.J.H. Subcortical mechanisms in emotional behavioral affectine changes following septal forebrain lession in the albino rat.//J. comparative and phisiol psichol. - 1953,V.46, N 3,p. 339-341/
5. Патогенетическое обоснование психофармакологических эффектов препаратов природного происхождения (экспериментальное исследование). Диссерт. д.м. н. Томск, 1995,с.406.

6. Плотников М. Б., Ваизова О.Е., Суслов Н.И. Влияние цереброкраста на локальный мозговой кровоток и ЭЭГ у бодрствующих крыс при ишемии мозга// Бюлл. экспер. биол. - 1995, т.117, N 3,с. 296-298.

7. Азарашвили А.А. Исследование механизмов памяти с помощью физиологически активных соединений. - М.: Наука, 1981,с. 183.

8. Крушинский Л.В. Биологическое основы рассудочной деятельности.- М.: Изд-во Московского ун-та, 1986,с.275.

Использование:изобретение относится к области медицины, а именно к химико-фармацевтической промышленности, и касается способа получения средства, обладающего одновременно противоишемической и ноотропной активностями. Сущность способа заключается в экстракции надземной части растения княжика сибирского 25%-ным этанолом при 70-80^oC в течение 60-120 мин при соотношении сырье: экстрагент 1:(10-12). Технический результат заключается в получении средства, обладающего двумя разными активностями, которые одновременно в экстрактах из растительного сырья не описаны. 8 табл.

Способ получения экстракта, обладающего противоишемической и ноотропной активностью, заключающийся в экстракции надземной части княжика сибирского (Atragenae sibirica L.) 25%-ным раствором этанола при 70 80^oС в течение 60 120 мин при соотношении сырье экстрагент 1 10 12.