СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ ПАРАФИНОФИЛЬНЫХ МИКРООГРАНИЗМОВ Российский патент 2001 года по МПК C12Q1/02 C12Q1/68 C12N1/20 

Эта заявка является частичным продолжением заявки на патент США N 08/035,358, поданной 22 марта 1993 года, под названием "A METHOD FOR PARAFFINOPHILC ISOLATION AND IDENTIFICATION FROM A BODY SPECIMEN" ("Способ выделения и идентификации парафинофилллов из препарата тела"), которая была частичным продолжением заявки на патент США N 08/011,479, поданной 26 января 1993 года под названием "A METHOD FOR MYCOBACTERIUM AVIUM INTRACELLULARE ISOLATION AND IDENTIFICATION FROM A FECAL SPECIMEN" ("Способ выделения и идентификации Mycobacterium avium intracellulare из фекальных образцов").

Изобретение относится к способу определения вида и идентификации парафинофильных материалов.

Вирус иммунодефицита человека типа 1, или ВИЧ, вызывает синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД), который является смертельным заболеванием, приближающимся к эпидемическим размерам во всем мире. По имеющимся расчетам к 2010 году будет ВИЧ-инфицировано 110 млн человек. По мере развития заболевания СПИД он обычно характеризуется сопутствующими заболеваниями, вызванными условно-патогенными микроорганизмами, такими как пневмоцистная пневмония, саркома Капоши, лимфома и комплекс Mycobacterium avium intracellulare (MAI).

Было обнаружено, что комплекс MAI присутствует в организме более чем 80% больных СПИДом (J.M. Wallace et al., Mycobacterium avium complex in patients with AIDS - A Clinicopathologis Study, Chest 93 (5) 926-932 (1988) (Комплекс MAI у больных СПИДом. Клиникопатологическое исследование)). До появления СПИДа микроорганизмы NAI были обнаружены в качестве редкой формы пневмонии у больных с хроническими легочными инфекциями (E. Wolinski, Nontuberculous mycobacteria and associated diseases. Am. Rev. Respir. Dis. 1979, 118:107-59 (Микобактерии нетуберкулезного происхождения и сопутствующие заболевания)).

Микроорганизмы MAI содержали два близко родственных вида, M. avium и M. intracellulare, которые имеют побочную вирулентность для неинфицированного ВИЧ хозяина. В течение 1980 года в медицинской литературе сообщалось только о 24 случаях MAI (C.R. Horsburgh, Jr. et al., Disseminated infection with Mycobacterium avium interacellulare. Medicine (Baltimore) 1985, 64:36-48 (Распространение инфекции Mycobacterium avium intracellulare)). Однако эпидемия распространения инфекции MAI сравнима по масштабам с эпидемией СПИДа.

Исследования показали, что распространение инфекции MAI вносит значительный вклад как в заболеваемость, так и в смертность больных СПИДом (C.R. Horsburgh, Jr. et al. , The Epidemiology of Disseminated Nontuberculous Mycobacterial Infection in Acquired immunodeficiency syndrome (AIDS). Am. Rev. Respir. Dis. 1989, 139:4-7 (Эпидемиология распространения инфекции нетуберкулезных микобактерий при синдроме приобретенного иммунодефицита (СПИД))).

До настоящего времени наиболее распространенным источником выделения MAI был способ выделения из крови. Известны методы выделения для определения присутствия или отсутствия MAI в крови больного. Один из методов включает использование радиометрической системы BACTEC, созданной в ф. Johnson Division of Becton Dickenson. Система использует пробирки с гемокультурой, содержащей жидкую среду MiddleBrook 7H12 плюс 0,05% (по объему) полианетил сульфонат натрия в гемокультуральных пробирках. К тому же жидкая среда 7H12 содержит меченную C-14 пальмитиновую кислоту. При использовании данного способа пробирки, содержащие культуру микобактерий, выделяют CO₂, меченный углеродом-14, который определяют способом (подобным тому, который используют для жидкого сцинтилирования), позволяющим определить бета-излучение. Другой способ выделения из крови включает использование генетических проб, которые основаны на ДНК-гибридизации (C.M. Reichert et al., Pathologic features of AIDS. In: V.T. DeVita Jr. et al., (eds) AIDS etiology, diagnosis, treatment and prevention, p. 134 NY J. 13, Lipponcott, 1985 (Патологические особенности СПИД)).

Однако, когда MAI широко распространяется у больных СПИДом, проникая с помощью крови в скелет, легкие, селезенку и ЦНС, это приводит к почти 100% смертности (C. C. Hawkins et al., MAI in patients witn acquired immunodeficiency syndrome. Am. Intern. Med. 1986; 184-8 (Комплекс MAI у больных с синдромом приобретенного иммунодефицита)); (J. Hoy et al., Quadruple drug therapy for Mycobacterium avium intracellulare bacteremia in AIDS patients. J. Infect. Dis. 990; 161:801-5 (Квадрупольная лекарственная терапия бактериемии Mycobacterium avium intracellulare у больных СПИДом).

Эти известные способы хотя и эффективны, однако требуют дорогостоящего оборудования, специализированного работающего персонала и материалов. Так, небольшие больницы, где находится несколько больных AIDS, передвижные лаборатории, и страны третьего мира, где ресурсы ограничены, не могут иметь такого специализированного оборудования и персонала. В подобных ситуациях были бы гораздо полезнее более простые и более дешевые способ и аппаратура для выделения идентификации MAI.

Известно, что многие атипичные микобактерии растут на основной солевой среде, лишенной любых источников углерода, за исключением парафинового воска, который вводится в среду в виде парафина, покрывающего полоски. Fuhs, G. W., "Der Mickrobiell Abbau Von Kohlenwasserstoffen", Arch. Mikrobiol. 39: 374-422 (1961). Mishra, S.K. et al., "Observations On Paraffin Baiting As a Laboratory Diagnostic Procedure in Nocardiosis", Mycopathologica and Mycologia Applicata 51 (2-3): 147-157 (1973) (Описание парафинового бейтинга как лабораторного диагностического метода при нокардиозе) использовали покрытые парафином полоски и основную солевую среду для выделения астероидов Nocardia из клинических образцов, таких как мокрота, бронхиальный лаваж и спинномозговая жидкость. Метод был в дальнейшем улучшен путем замены полосок на покрытые парафиновым воском предметные стекла, таким образом делая возможным использованием in situ Kinyoun-процесса холодного быстрокислотного окрашивания микроорганизмов, растущих на покрытом парафином предметном стекле. Ollar, R. A. "A Paraffin Baiting Technique that Enables a Direct Microscopic View of in situ Morphology of Nocardia asteroides with the Acid-Fast or Fluorescence Staining Procedures", Zbl. Bakt. , Abt. Orig, A, 234: 81-90 (1976) (Метод парафинового бейтинга, способствующий прямому микроскопическому исследованию in situ морфологии астероидов нокардиоза с помощью кислотно-быстрых или флуоресцентных процедур окрашивания). При этом определении положительная реакция немедленно указывает исследователю, что присутствуют микобактерии, отличные от M. tuberculosis.

Патент США N 5153119, единственным автором которого является один из авторов настоящего изобретения, раскрывает способ видообразования и идентификации MAI в образце и включает использование покрытых парафином предметных стекол для определения присутствия или отсутствия атипичных микобактерий (микробактерии, отличные от M. tuberculosis, M. laprae и M. paratuberculosis). Хотя этот процесс достаточно эффективен для выделения и видообразования MAI, для некоторых целей он может оказаться относительно медленным: для определения необходимо от 6 дней (в фекалиях) до 34,5 дней (в крови).

Из вышеизложенного ясно, что по жизненным показаниям необходимо как можно раньше проводить идентификацию и лечение комплекса MAI. (C.A. Kemper et al. , California Collaborative Group: Microbiologic and clinical response of patients with AIDS and MAC bacterremia to a four oral drug regimen; In: Program and abstracts of the 30th Interscience Conference on Antimicrobial Agente and Chemothetapy; Atlanta, October 21-24; 1990; Washigton D.C.: Am. Society for Microbiology; 1990; 297. abstract (Микробиологическая и клиническая реакция больных СПИДом и бактериемией МАС на четыре схемы приема оральных лекарственных средств).

Существует реальная и существенная необходимость для улучшения способа быстрого определения присутствия MAI и других парафинофильных микроорганизмов у больного.

Используемый здесь термин "парафинофильные" соответствует микроорганизмам, которые могут употреблять парафиновый воск в качестве источника углерода в основной солевой среде, лишенной других форм углерода. Микроорганизмы могут быть по своей природе бактериями или грибками.

Представленное изобретение отвечает вышеописанным требованиям. Оно дает способ обнаружения парафинофильных микроорганизмов в образцах тела путем помещения порций образца в множество резервуаров, которые содержат стерильный бульон и антибиотики. Одно покрытое парафином стекло помещают в каждый резервуар и затем наблюдают за ним для определения последующего роста микроорганизме. После обнаружения такого роста первое предметное стекло подвергают быстрому спиртово-кислотному тесту. Если результат этого испытания указывает на присутствие спиртово-кислотного быстрого микроорганизма, второе предметное стекло подвергают испытанию на теллуритное восстановление для определения возможности присутствия парафинофильного микроорганизма на втором предметном стекле. Если определена такая возможность, то третье предметное стекло подвергают, по крайней мере, одному специфическому испытанию для определения присутствия парафинофильного микроорганизма на предметном стекле. В дальнейшем применяется экстракция ДНК, по крайней мере, на одном дополнительном предметном стекле для обнаружения в образце парафинофильных микроорганизмов.

Задачей настоящего изобретения является быстрый и надежный способ выделения, идентификации и определения вида парафинофильных микроорганизмов в образцах тела.

Другой задачей изобретения является обеспечение такой системы, которая использует экстракцию ДНК как способ, способствующий быстрым результатом.

Еще одной задачей изобретения является обеспечение специфической упрощенной и быстрой системы, которая выполняет выделение и видообразование парафинофильных микроорганизмов из образцов фекалия или других препаратов тела.

Дополнительной задачей изобретения является применение данного изобретения в обнаружении людей, организм которых содержит парафинофильные микроорганизмы.

Еще одной задачей изобретения является обеспечение неинвазивного метода определения наличия парафинофильных микроорганизмов у больных.

Эти и другие объекты изобретения поясняются со ссылками на описание и чертежи, приложенные к этой заявке.

Фиг. 1 является схематическим видом спереди вертикального разреза пробирки, содержащей покрытое парафином предметное стекло в стерильном водном растворе, содержащем фекальные образцы.

Фиг. 2 является схематическим изображением кислотно-спиртового быстрого метода анализа, используемого в настоящем изобретении.

Фиг. 3 является схематическим изображением теллуритного восстановительного метода определения.

Фиг. 4 является схематически изображением нитратного восстановительного метода определения.

Фиг. 5 является схематическим изображением анализа с использованием гидролиза мочевины.

Фиг. 6 является схематическим изображением гидролиза Твин 80.

Фиг. 7 является схематическим изображением использования процесса экстракции ДНК в соответствии с настоящим изобретением.

Используемый здесь термин "пациент" относится к животному миру, включая человека, образцы тела которого обрабатываются в соответствии с настоящим изобретением.

Используемый здесь термин "образец тела" будет включать в себя фекальные материалы, кровь, мокроту, ткань спинномозговую жидкость, полученные от пациента.

Используемый здесь термин "парафинофильный" будет включать в себя, но не будет ограничен следующими микроорганизмами: Micrococcus Paraffinae; Corynebacterium Simplex; Ahnl; Micococcus (Rhodococcus) Cinnabareus; Ahnl. Micococcus (Rhodos) Rhodochrous; Mycobact. Perrugosum Var. Athanicum; Mycobact. Rubrum Var. Proranicum; Mycobacterium Hyalinum; Mycobacterium Lacticola; Mycobacterium Album, M. Luteum; Mycobacterium Microti; Mycobacterium Rubrum, Mycobacterium Phlei; Mycobacterium Phlei, M. Smegmatis; Mycobacterium Testudo; Mycobacterium-Avium-Intracellulare; Nocardia Spp; Actinomyces; Candida Lipolytica; Candida Tropicalis; Torulopsis Colliculosa; Monilia Sp., Hansenula Sp. , Torula rossa; Penicillium Sp., IHNL. Aspergillus Flavus; Aspergillus sp. , Penicillium Sp.; Citromyces Sp., Scopulariopsis Sp.; Pseudomonas Fluorescense Liquefaciencs; Ahnl. Pem. Fluorescense Denitrificans; Pseudomonas Aeruginosa.

В дополнение к определению MAI в фекальном веществе важно также определять другие парафинофильные организмы в других образцах тела, чтобы обеспечить быстрое и точное определение условий, имеющих существенное влияние на здоровье пациента. Парафинофильные организмы, относящиеся к условно-патогенным микроорганизмам, могут быть определены с помощью настоящего изобретения. Например, известно, что болезнь Ходжкина оказывает неблагоприятное влияние на клеточный иммунитет, вызывая принудительную иммунодепрессию, используемую при трансплантации клеток, тканей или органов. Такие условия могут привести к нежелательным сопровождающим инфекциям, раннее определение которых может оказаться очень важным для правильного лечения больного. Наиболее важными категориями таких парафинофильных микроорганизмов являются микобактерии, виды Candida и Nocardia.

Как было ранее указано, жизненноважным для здоровья человека является как можно более раннее распознавание и лечение MAI (C.A,. Kemper et al., California Collaborative Group; Microbiologic and clinical response of patients with AIDS and MAC bacterremia to a four oral drug regimen; In: Program and abstracts of the 30th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy; Atlanta. October 21-24, 1990; Washigton D.C., Am. Society for Microbiology; 1990; 297. abstract (Микробиологическая и клиническая реакция больных СПИД и бактериемией МАС на четыре схемы приема оральных лекарственных средств).

Для достижения этой цели наиболее выгодной является идентификция MAI в фекальном материале, поскольку MAI первоначально обнаруживается в желудочно-кишечном тракте. (E.C. Klatt et al., Pathology of Mycobacterium avium-intracellulare infection in acquired immunodeficiency syndrome; Hum. Pathol. 1987; 18: 709-14 (Инфекция Mycobacterium avium intracellulare при СПИДе), Колонизация желудочно-кишечного тракта на много месяцев предшествует возможности выделения MAI из крови и, следовательно, представляет удобный метод раннего предупреждения. Кислотная гистопатология больных СПИДом показывает большое количество кислотобыстрых бацилл как в слое слизистой оболочки, так и в слое подслизистой оболочки желудочно-кишечного тракта.

Считают, что ранее обнаружение MAI может дать заметное пролонгирование жизни больных СПИДом.

Локализированная желудочно-кишечная инфекция чаще всего встречается в двенадцатиперстной кишке, вызывая лимфаденопатию. Дополнительной областью MAI-инфекции являются концевая подвздошная кишка и аппендикс. Повышенное количество пейеровых бляшек увеличивает местную MAI-концентрацию. Прием этанола связывают со значительным существенным повышением MAI-инфекции в желудочно-кишечном тракте. Предполагают, что это происходит благодаря повышенному прохождению MAI через стенку кишечника и является побочным действием от вызванного спиртом энтерита (L.E. Bermudez et al., An animal model of Mycobacterium avium complex disseminated infection after colonization of the intestinal tract; Kuzell Institute for Arthritis and Infectious Diseases; Medical Research Institute of San Francisco at California Pacific Medical Center 94115; J. Infect. Dis. 1992. Jan; 165 (1) 75-9 (Моделирование на животных инфекции комплекса Mycobacterium avium после колонизации желудочного тракта)). Симптомами, вызванными инфекциям желудочно-кишечного тракта, являются тошнота, диаррея, боли в брюшной полости, закупорка желчных протоков и тяжелое общее истощение.

Колонизация MAI желудочно-кишечного тракта может быть обусловлена передачей инфекции через водоснабжение. Исследования, проведение медицинским колледжем Jefferson Mesical College, свидетельствуют о колонизации системы горячей воды в больнице, начавшейся в 1982 году. Было также обнаружено, что можно показать колонизацию обычных добровольцев после того, как они прополоскали горло водой из системы водоснабжения больницы. (S.A. Murphy et al., Mycobacterium avium intracellulare in a hospital hot water system: epidemiological investigation; In: Proceedings and Abstracts 24th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Las Vegas, Oct. 24-26, 1983, Washigron D.C.; American Society for Microbiology, 1983; 277 (Mycobacterium avium intracellulare в системе горячего водоснабжения больниц; эпидемиологическое исследование)). Домашнее водоснабжение ВИЧ-больных может быть потенциальным источником инфекции первоначального заражения MAI.

ВИЧ-гипотрофический синдром является клиническим определением состояния, при котором имеются данные о полной непроизвольной потере более чем 10% от основного веса тела, сопровождаемой либо хронической диареей (по крайней мере, два жидких стула каждый день не менее 30 дней), либо хронической слабостью и подтвержденным лихорадочным состоянием (не менее 30 дней, периодическое или постоянное) при отсутствии конкурируемых заболеваний или состояний, отличных от ВИЧ-инфекций, которые могут объяснить эти данные, такие, как рак, криптоспородиоз или другие специфические энтериты, например, (P. Ma et al. , AIDS and Infections of Homosexual Men, Second Edition, Appendix 14-B; Stoneham. MA; Butterworths. 1989; 233-234 (СПИД и инфекции среди гомосексуалистов)) с большой вероятностью могут являться доказательством инфекции MAI. Сокращение времени жизни (средняя продолжительность 4,1 месяца с распространившейся MAI-инфекцией) (J.A. Havlic. Jr. et al., Disseminated Mycobacterium avium complex infection: clinucal identification and epidemiologic trends; J. Infect. Dis. 1992; 165: 577-80 (Распространение инфекции комплекса Mycobacterium avium: клиническая инфекция комплекса Mycobacterium avium: клиническая идентификация и эпидемиологические тенденции)) предположительно объясняется резкой потерей веса. Было обнаружено, что во многих случаях смерть является результатом истощения. Таким образом, было бы полезным проводить ежемесячную проверку на MAI всех больных, имеющих следующие существенные критерии: 1) ВИЧ-положительные, 2) потеря веса больше, чем на 5 фунтов, или больше 5% от веса тела, и 3) показатель числа клеток CD4 ниже 400. Если MAI определен в стуле ВИЧ-больного, используя упомянутые критерии, то применение энергичной терапии антибиотиками, как было показано, препятствует распространению MAI. Современная терапия включает использование ципрофлоксазина с этамбутанолом, анасмицина и хлофазимина. (C.B. Inderlied et al., Disseminated mycobacterium avium complex infection: AIDS Clin. Rev. 1990; 165-91 (Распространение инфекции комплекса Mycobacterium avium: клиническая идентификация и эпидемиологические отдельным ВИЧ-больным должен быть установлен на основе определения чувствительности к антибиотику, как это делается с помощью MAI Para SL/C способа (Парафин, Предметное стекло, Культура).

В прошлом определение этих латентных инфекций MAI желудочно-кишечного тракта ARC-больных требовало больших затрат времени, когда использовалась среда Lowenstein-Jensen, MiddleBrook 7H9 и родственная среда MiddleBrook. Очень длинный "протокол", включающий центрифугирование, выделение и медленный рост, делают эти способы очень непрактичными для использования в периодическом тестировании желудочно-кишечного тракта больных ВИЧ на MAI. Для периодического обследования больных ВИЧ на MAI необходим упрощенный и недорогой способ, специфический для инфицированных образцов кала. Настоящее изобретение содержит адаптацию MAI Para SL/C-способа, который мы определили как MAI ParaPecogen-способ. Последний был специально разработан для периодического тестирования ARC-больных, и он состоит из быстрых и недорогих операций для раннего определения присутствия в желудочно-кишечном тракте MAI в соответствии с вышеизложенными критериями.

Первая часть настоящего изобретения - это точное воспроизведение способа, описанного Ollar в патенте США N 5153119. Для выделения парафинофильных микроорганизмов из образцов тела 4 мл свежего образца тела суспендируют в 3-5 мл стерильного физиологического раствора. Используя комплект 10, как показано на фиг. 1, 0,5 мл образца помещают в испытательную пробирку 12, которая содержит стерильный водный раствор 14 (такой, как бульон Чапека) и испытуемую пробирку закрывают хлопковым тампоном. Образец, испытываемый на присутствие или отсутствие парафинофильных микроорганизмов, помещают в испытуемую пробирку 12 и затем анализируется покрытие парафином предметное стекло 18. Покрытое парафином предметное стекло сделано в соответствии с указаниями Ollar в патенте США N 5153119. Бульон Чапека 14 может быть обеспечен антибактериальным анти-грибковым/антибиотическим коктейлем, таким как коктейль, который продается под торговой маркой "PANTA" Ф. Becton, Dickenson/Jonson Labs Division. Этот продукт имеет тенденцию препятствовать возможному заражению такими факторами, как Pseudomonas aeruginosa или Candida tropicalis. Этот продукт не оказывает влияния на парафинофильные микроорганизмы MAI, которые устойчивы к антибиотикам, используемым настоящее время в "PANTA".

Комплект 10 может также служить средством разделения между атипичными микобактериями и нокардиоформными микроорганизмами с одной стороны и микобактериями туберкулеза с другой стороны, т.к. последние не могут использовать парафин в качестве единственного источника углерода. Как известно, между парафином и микроорганизмами, способными использовать парафин в качестве источника углерода, такими как атипичные парафинофильные микобатерии и парафинофильные нокардиоформные микроорганизмы, создается тропизм. Внешним проявлением этого тропизма или бейтинга является появление культуры микроорганизма на поверхности парафина.

Присутствие на предметном стекле парафинофильных микобактерий или нокардиальных определяется с помощью спиртово-кислотного быстрого теста 40 (фиг. 2). Этот тест может быть использован для дальнейшего различия между атипичными микобактериями и нокардиоформными микроорганизмами. Как известно, атипичные парафинофильные бактерии являются спиртово-кислотно-быстрыми; парафинофильные нокардиоформные микроорганизмы являются кислотно-быстрыми, и парафинофильные Pseudomonas aeruginosa или парафильнофильные Candida tropicalis не являются кислотно- и спиртово-кислотно=быстрыми. Таким образом, эти две последние парафинофильные группы (нокардиоформы и Pseudomonas aeruginosa или Candida tropicalis) могут быть удалены по возможности путем спиртово-кислотного тестирования.

В выделении парафинофильных микроорганизмов, как показано на фиг. 2, в восемь тестируемых пробирок 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57 вносят около 4,5 мл стерильного бульона Чапека, содержащего антибактериальный и антигрибковый/антибиотический коктейль, а также 0,5 м суспензии свежего фекалия. В каждую из пробирок 50-57, содержащую образец тела, инокулированный с бульоном Чапека и антибиотиками, как будет описано ниже, вводят покрытое парафином предметное стекло. Средство спиртово-кислотного быстрого тестирования 40 на фиг. 2, дает окрашенный раствор парафинофильных микроорганизмов для последующего анализа под микроскопом. Резервуары или пробирки 50-57 инкубируют при 37^oC. При обнаружении роста, обычно через 24-96 часов, одно из предметных стекол удаляют и окрашивают кислотно-спиртовым красителем Kinyoun, как описано в патенте США N 5153119. Другое предметное стекло извлекают и субкультурируют в среде Lowenstein-Jensen, как описано в патенте США N 5153119. Третье предметное стекло удаляют и испытывают на теллуритное восстановление, как описано в патенте США 5153119. Четвертое предметное стекло удаляют и испытывают на нитратное восстановление в соответствии с патентом США N 5153119. Следующее предметное стекло удаляют и испытывают на гидролиз мочевины в соответствии с патентом США N 5153119. Следующее предметное стекло удаляют и испытывают на гидролиз Твин-80, как описано в патенте США N 5153119.

Покрытое парафином предметное стекло с заметным ростом культуры парафинофильных микроорганизмов 42 удаляют из пробирки 12, фиг. 1, и сначала погружают в две последовательные пробирки 50 и 51 с дистиллированной водой, а затем погружают на 15 минут в пробирку 52 с карболфуксином Kinyoun. Предметное стекло 42 снова погружают в пробирку 53 с дистиллированной водой и затем помещают на 5 мин в пробирку 54, содержащую кислотно-спиртовую среду, состоящую из 97 мл абсолютного этанола и 3 мл концентрироваанной HCl. После этого предметное стекло промывают в четвертой пробирке 55 дистиллированной водой и затем помещают на 1 минуту в пробирку 56, содержащую 1,0% (по объему) водного раствора метиленового голубого. Наконец предметное стекло промывают дистиллированной водой в пробирке 57.

Предметное стекло с культурой затем удаляют из пятой пробирки 57 с дистиллированной водой и осторожно промокают чистой адсорбирующей папиросной бумагой. Культуру на предметном стекле затем рассматривают под микроскопом при 250х, 450х и 1000х масляном погружении.

На фиг. 3 показана проба теллуритного восстановления, которая состоит в том, что испытательная пробирка 60 наполняется предпочтительно бульоном Чапека плюс реагент - теллурит калия 62. Предметное стекло с культурой 43 погружают в испытуемую пробирку 60 и инкубируют. Если на предметном стекле присутствует парафинофильный микроорганизм MAI, то на уровне мениска пленки 65 предметного стекла 43 образуется тяжелый черный осадок. Этот тест предупреждает исследователя о возможности присутствия парафинофильных микроорганизмов. Присутствие парафинофильных NAI микроорганизмов может быть подтверждено после результатов испытаний, обсуждаемых дальше.

На фиг. 4 представлены испытания на нитратное восстановление 70. Предметное стекло с культурой 44, показывающее обильный рост, испытывают на способность восстанавливать нитраты до нитритов. Это делается путем добавления нитратов в пробирку 71, содержащую стерильный бульон. После периода инкубации при 37^oC от 12 до 24 часов предметное стекло 44 удаляют из стерильного нитратного бульона 72 и прибавляют к пробирке 71 последовательно пять капель раствора сульфаниловой кислоты и затем пять капель раствора альфа нафтиламина. Восстановление нитрата в нитрит проявляется как красное окрашивание бульона 73. Как известно, если нитрат восстанавливается до нитрита, это указывает на отсутствие на предметном стекле парафинофильных микроорганизмов MAI.

На фиг. 5 показано испытание на реакцию гидролиза мочевины 80. Предметное стекло с культурой 45 помещают в закрытую пробирку 81, содержащую 4,5 мл стерильной среды с мочевиной 82. Культуру инкубируют при 37^oC и прерывают инкубирование после трех дней. Положительная реакция включает изменение цвета среды 82 к розовому или красному после периода трех дней. Как известно, если раствор меняет цвет, это указывает на отсутствие на предметном стекле 45 парафинофильных микроорганизмов MAI.

На фиг. 6 показано испытание на гидролиз эмульгатора. Используется эмульгатор "Twin 80", торговая марка Atlas Chemical Industries Ins., обычно описан как производное полиоксиэтилена и жирной кислоты, частично этерифицированное сорбитом. Предметное стекло с культурой 46 помещают в стерильную закрытую пробирку 91, содержащую среду 92 и инкубируют при 37^oC. Положительная реакция включает появление красного окрашивания 93 на мениске пленки 94 на предметном стекле 46 в течение 5 дней. Как известно, присутствие красного окрашивания на предметном стекле указывает на отсутствие на нем парафинофильных микроорганизмов.

Следует учесть, что должны быть осуществлены, по крайней мере, первые три идентификационных теста на парафинофильные микроорганизмы MAI (1: теллуритное восстановление, 2: нитратное восстановление, 3: гидролиз мочевины или 4: "Twin 80" или эмульсионный гидролиз. Тест теллуритного восстановления наиболее важен среди четырех указанных тестов). Предпочтительно все четыре теста должны проведены для того, чтобы наиболее точно специфицировать и идентифицировать парафинофильные микроорганизмы.

В конце этой последовательности видообразование и выделение парафинофильных микроорганизмов из образцов тела в основном закончены. Конечная процедура предпочтительно включает экстракцию ДНК.

Пример 1.

Пример представлен для обеспечения дальнейшего руководства по экстракции ДНК согласно настоящему изобретению.

На фиг. 7 показана экстракция ДНК для Parafecogen. Обеспечение к фиг. 7: парафиновое предметное стекло 102 с парафинофильным микроорганизмами из пробирки 57 подвергают соскабливание для удаления парафинового покрытия, содержащего культуру парафинофильных микроорганизмов, используя стерилизованную на пламени инокуляционную иглу 122 с внесением соскобленных выросших парафинофильных микроорганизмов через воронку 126 в пробирку микроцентрифуги 128, содержащую около 1,0 мл октана. Бактерии и оставшийся парафин осаждается при центрифугировании в микроцентрифуге при 14000 об/мин около 5 минут. Супернатант (оставшийся октан) удаляют из микроцентрифуги путем тщательного отбора стерильной пипеткой Пастера. В микроцентрифужную пробирку прибавляют 0,5 мл 100% этанола и проводят перемешивание осторожным переворачиванием. Пробирку помещают в центрифугу и снова центрифугуют 5 минут при 14000 об/мин. Супернатант удаляют стерильной пипеткой Пастера. Осадок внутри микроцентрифужной пипетки 128 снова выдерживают с ~ 0,5 мл 100% этанола центрифугуют 5 минут при 14000 об/мин. ЭТот супернатант снова удаляют стерильной пипеткой. Оставшийся этанол полностью удаляют из микроцентрифужной пробирки путем упаривания в вакууме. Около 0,5 мл лизоцима (10 мг/мл) прибавляют к осадку, содержащемуся внутри микроцентрифужной пробирки, затем сильно перемешивают и инкубируют около 20 минут при 37^oC. Центрифугуют при 14000 об/мин в течение 5 минут и супернатант тщательно удаляют. Осадок внутри микроцентрифужной пробирки встряхивают и затем выдерживают с 0,500 мл протоиназы К (10 мг/мл) в течение 2 часов при ~ 50^oC, затем центрифугуют ~ 5 минут при 14000 об/мин. Супернатант затем тщательно удаляют. К осадку, находящемуся в микроцентрифужной пробирки, добавляют 100 мкл изопропанола, центрифугуют 30 минут при 14000 об/мин при 4^oC. Супернатант удаляют и осадок выдерживают со 100 мкл 70% этанола, помещают в микроцентрифугу и центрифугуют 15 минут при 14000 об/мин. Супернатант удаляют и осадок, содержащий ДНК, ресуспензируют в 50 мкл TE буфера (10 мМ Трис-HCl, 1 мМ EDTA, pH 8,0). Полученная ДНК может быть использована с помощью других методов для ДНК, таких как блотирование пятна, южное блотирование или генная амплификация, как описано в патентах США N 4683195, 4683202, 4695188 для идентификации присутствия MAI-последовательности в осадке ДНК. Среди подходящих генетических амплификационных систем, используемых в настоящем изобретении, эта система распространяется под торговой маркой Polymerase Chain Reaction (PCR) ф. Roche Corporation.

Следует признать, что вышеприведенная система дает улучшенный способ для быстрого и эффективного выделения и идентификации парафинофильных микроорганизмов MAI, присутствующих в образце тела.

Следует заметить, что хотя значительная часть описания была посвящена выделению и идентификации MAI с упором на использование фекального материала в качестве образца тела, изобретение этим не ограничивается. В более широких аспектах изобретение может быть использовано для других образцов тела и может быть использовано для определения других типов парафинофильных веществ в образцах.

Изобретение относится к микробиологии. В способе обнаружения Mycobacterium avium intracellulare (MAI) в образцах тела осуществляют введение порций образцов тела во множество резервуаров, содержащих стерильный бульон и антибиотики, введение одного покрытого парафином предметного стекла в каждый упомянутый резервуар, проведение спиртово-кислотного быстрого теста на первом покрытом парафином предметном стекле. После обнаружения на предметном стекле спиртово-кислотных быстрых микроорганизмов осуществляют пробы теллуритного восстановления на втором покрытом парафином предметном стекле с последующим осуществлением, по крайней мере, одной специальной пробы на третьем покрытом парафином предметном стекле. Осуществляют экстракцию ДНК, по крайней мере, с одного дополнительного предметного стекла после удаления парафина с культуры микроорганизма и определение по экстракции ДНК присутствия в образце MAI. Способ позволяет быстро и эффективно выделять и идентифицировать парафинофильные микроорганизмы MAI. 5 з.п. ф-лы, 7 ил.

1. Способ обнаружения Mycobacterium avium intracellulare (MAI) в образце тела, включающий в себя введение порций указанного образца тела во множество резервуаров, содержащих стерильный бульон и антибиотики, введение одного покрытого парафином предметного стекла в каждый упомянутый резервуар, наблюдение за покрытыми парафином предметными стеклами для обнаружения присутствия на них культуры микроорганизмов, после наблюдения за ростом культуры микроорганизмов на указанных покрытых парафином предметных стеклах проведение спиртово-кислотного быстрого теста на первом покрытом парафином предметном стекле для определения, является ли указанный микроорганизм спиртово-кислотным быстрым микроорганизмом или не является ни кислотно-быстрым, ни спиртово-быстрым микроорганизмом, после осуществления указанного спиртово-кислотного быстрого теста на указанном первом покрытом парафином предметном стекле и обнаружения на нем спиртово-кислотных быстрых микроорганизмов осуществление пробы теллуритного восстановления на втором покрытом парафином предметном стекле для определения возможности присутствия на нем MAI, после выполнения пробы теллуритного восстановления на упомянутом втором покрытом парафином предметном стекле и определения возможности присутствия на нем MAI осуществление, по крайней мере, одной специальной пробы на третьем покрытом парафином предметном стекле для подтверждения возможного присутствия на нем MAI, отличающийся тем, что последовательно проводят экстракцию ДНК и, по крайней мере, с одного дополнительного покрытого парафином предметного стекла после удаления предметного стекла из культуры путем удаления выросшей культуры микроорганизмов с этого предметного стекла, переносят ее в испытательную пробирку с октаном, центрифугируют, удаляют отстоявшийся слой октана, добавляют этанол для осаждения с последующим центрифугированием, удаляют отстоявшийся слой этанола, добавляют к осадку раствор лизоцима, выдерживают в термостате, центрифугируют, удаляют отстоявшийся слой, добавляют к осадку раствор протеиназы К, выдерживают в термостате, центрифугируют, удаляют отстоявшийся слой, добавляют к осадку изопропанол, центрифугируют, удаляют отстоявшийся слой изопропанола, затем добавляют этанол, центрифугируют, удаляют отстоявшийся этанол и повторно суспендируют осадок, содержащий экстрагированную ДНК в буфере, после чего подвергают экстрагированную ДНК процедурам для установления присутствия последовательностей MAI. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что включает в себя проведение специальной пробы на нитратное восстановление. 3. Способ по п.2, отличающийся тем, что включает в себя последующее за указанной специальной пробой на нитратное восстановление проведение на четвертом покрытом парафином предметном стекле пробы на реакцию гидролиза мочевины. 4. Способ по п.3, отличающийся тем, что включает в себя последующее за пробой на реакцию гидролиза мочевины осуществление на пятом покрытом парафином предметном стекле пробы на эмульсионный гидролиз. 5. Способ по п.1, отличающийся тем, что он используется, по крайней мере, на одном образце тела, состоящем из фекального вещества. 6. Способ по п.5, отличающийся тем, что он используется для тестирования фекальных образцов человека для обнаружения у данного человека MAI или других парафинофильных микроорганизмов.